Histaminrezeptoragonisten/ -antagonisten

Histamindihydrochlorid Sigma, Steinheim

4-Methylhistamin Tocris Bioscience, UK

3.1.6.2 Histaminrezeptorantagonisten

JNJ7777120 Prof. H. Stark, Johann Wolfgang Goethe

Universität, Frankfurt/Main 3.1.7 Hergestellte Puffer und Lösungen für In-vitro-Versuche

DC-Medium RPMI 1640

10 % Fetales Kälberserum 1 % Penicillin / Streptomycin 50 µmol β-Mercaptoethanol

PBS Puffer 8 g NaCl

0,2 g KCl 1,44 g Na2PO4

0,2 g KH2PO4

Aqua bidest ad 1000 ml

pH 7,2 mit 1 mol/l HCl und 1 mol/l NaOH

Reagent Diluent (1 %) 0,8 g BSA

Aqua bidest ad 80 ml

Erythrozytenlyse-Puffer 8,29 g NH4Cl

1 g KHCO3 0,034 g Na-EDTA Aqua bidest ad 1000 ml

pH 7,4 mit 1 mol/l HCl und 1 mol/l NaOH

3.2 Versuchstiere

Die Tierversuche sind durch das Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit in Oldenburg genehmigt worden (Aktenzeichen: 33.9-42502-04-09/1633).

Für die Versuche wurden zum einen weibliche Mäuse des Inzuchtstammes BALB/c verwendet und stammten vom Züchter Charles River (Sulzfeld). Die H4R-Knockout-Mäuse wurden von Robin Thurmond (Johnson & Johnson, La Jolla, CA, USA) zur Verfügung gestellt. Zu Beginn wurden 5 männliche und 5 weibliche Tiere geliefert, mit denen im eigenen Institut eine Züchtung stattfand. Die Tiere wurden regelmäßig genotypisiert.

Alle Tiere waren zu Beginn der Untersuchungen acht Wochen alt und wogen etwa 20 g. Die Tiere wurden in Gruppen von 7-8 Tieren je Käfig gehalten und in einem 12-Stunden Hell-/Dunkel-Lichtzyklus bei 23 °C Raumtemperatur. Pelletfutter (Altromin 1324) und Wasser standen ad libitum zur Verfügung.

Zum Zeitpunkt der Versuche waren die Tiere klinisch gesund.

3.3 Versuchsübersicht

In dieser Arbeit wurde die H4R-vermittelte Wirkung, zum einen durch H4R-Knockout-Mäuse zum anderen pharmakologisch durch den H4R-Antagonisten JNJ7777120, sowohl in vitro als auch in vivo untersucht.

Ziel der In-vivo-Versuche war es, den Einfluss des H4R im Kontaktallergiegeschehen zu untersuchen. In den Versuchen wurde durch die Haptene Toluen-2,4-diisocyanat (TDI) und Fluorescein-Isothiocyanat (FITC), beides Substanzen die ein eher Th2-dominiertes Entzündungsgeschehen auslösen, eine Kontaktallergie erzeugt. Der Einfluss des H4R wurde sowohl in der Sensibilisierungsphase (Induktion der Allergie) als auch in der Challengephase (Auslösephase) untersucht. Als ein wichtiger Parameter galt in allen Versuchen die entzündliche Schwellung der Ohren, die mit den Haptenen in Kontakt kamen. Im Mouse-Ear-Swelling-Test (MEST) wurde die Hapten-induzierte allergische Reaktion sowie ihre Inhibition durch den H4R-Antagonisten bestimmt. Bei den TDI-Kontaktallergie-Versuchen konnte über das Lymphknotengewicht und die Gesamtzellzahl im Lymphknoten die Proliferation der

T-Zellen bestimmt werden. Desweiteren wurden sowohl die Lymphknotenzellen als auch Milzlymphozyten in vitro mit Concanavalin A (ConA) stimuliert und mittels ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) die Menge von pro- und antiinflammatorischen Zytokinen bestimmt. Um zu untersuchen, ob der H4R auf die akute, nichtallergische Entzündung einen Einfluss hat, wurde ein Versuch mit Arachidonsäure (AA) durchgeführt.

Bei den In-vitro-Versuchen sollte der Einfluss von Toll-Like-Receptor-Agonists (TLR-Agonisten) auf verschiedene pro- sowie anti-inflammatorische Zytokine untersucht werden. In-vitro-generierte DC aus dem Knochenmark von H4R-Knockout- sowie Wildtyp-Mäusen wurden mit verschiedenen TLR-Agonisten stimuliert und mittels ELISA die Menge der produzierten Zytokine bestimmt. Von besonderem Interesse waren dabei die Mitglieder der IL-12-Familie (IL-12, IL-23, IL-27). Neben der Stimulation mit den TLR-Agonisten wurden die DC mit Histamin sowie dem H4R-Agonisten 4-Methylhistamin (4-MH) stimuliert.

Auch dort wurde die Zytokinproduktion mittels ELISA bestimmt.

3.4 In-vivo-Versuche

Für die vorliegende Arbeit wurden Untersuchungen in verschiedenen Kontaktallergie- und Entzündungsmodellen der Maus durchgeführt. Von besonderem Interesse war der Einfluss des H4R auf das Entzündungsgeschehen in der Haut durch genetische (H4R-Knockout-Mäuse) wie auch pharmakologische (JNJ7777120) Manipulation. Der Einfluss wurde sowohl während der Sensibilisierungs- als auch während der Challengephase untersucht. Für alle Versuche wurden die Mäuse in Gruppen à 7 bis 8 Tieren aufgeteilt. In jedem Versuch wurden vergleichend H4R-Knockout-Mäuse und Wildtyp-Mäuse (Vehikelgruppe) sowie mit dem H4R-Antagonisten JNJ7777120-behandelte Wildtypmäuse untersucht. Zudem dienten unbehandelte Kontrollmäuse als Basalkontrolle. Alle Tiere waren zu Beginn der Versuche 8 Wochen alt. Die jeweiligen Behandlungsschemata und Konzentrationen der verwendeten Substanzen für die verschiedenen Versuche sind nachfolgend einzeln beschrieben. Die entsprechenden Substanzen wurden in Tabelle 3-1 aufgeführt gelöst.

Tabelle 3-1: Übersicht über die verwendeten Substanzen und ihre Lösungsmittel aus den In-vivo-Versuchen

Stoff Lösungsmittel

Toluen-2,4-diisocyanat (TDI) Aceton

Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) Aceton und Dibutylphtalat im Verhältnis 1 : 1

JNJ7777120 oral Hydroxypropyl-β-Cyclodextrin (HPBCD) 20 %

JNJ7777120 s.c. oder i.p. PBS und zum Vorlösen 2,5 % DMSO

Arachidonsäure (AA) Aceton

3.4.1 TDI-Kontaktallergiemodell

Von Interesse war der Einfluss des H4R auf die allergische Entzündung, die durch das Hapten Toluen-2,4- diisocyanat (TDI) ausgelöst wurde. Als Untersuchungsparameter dienten dazu in vivo die Ohrschwellung und ex vivo die Expression verschiedener inflammatorischer Zytokine in der Ohrhaut und Lymphozyten. Zur Vorbereitung der Versuche wurden die Mäuse in der Abdominalregion enthaart. Die Enthaarung erfolgte mit Veet-Enthaarungscreme, die auf die Bauchhaut aufgetragen und nach drei Minuten Einwirkzeit mit einem feuchten Tuch wieder entfernt wurde. Am darauf folgenden Tag begann die Sensibilisierung der Tiere mit TDI (in Aceton). Hierzu wurde die Bauchhaut zunächst zehnmal mit Tesafilmstreifen behandelt (Tape-Stripping) und daraufhin jeweils 100 µl 5 %iges TDI auf das Abdomen aufgetragen, an Tag 2 bis 4 je 50 µl. Durch die Behandlung der Bauchhaut mit Tesafilm an den ersten drei Tagen der Sensibilisierung wurden die oberen Hornschichten entfernt, wodurch eine Störung der Barrierefunktion und somit eine verbesserte Penetration des Kontaktallergens erreicht wird. An Tag 22 erfolgte eine Boosterung durch Gabe von TDI 5 % (100 µl) auf das Abdomen. An Tag 29 wurde die Ohrdicke der Tiere gemessen. Anschließend begann die Challenge mit dem Hapten TDI 0,5 % auf die Innen- und Außenseite des Ohrs (100 µl) sowie die Behandlung mit JNJ7777120 im wöchentlichen Abstand.

3.4.1.1 Untersuchung des Einflusses des H4R auf die allergische Entzündung im TDI-Modell

3.4.1.1.1 Sensibilisierung

Im Sensibilisierungsversuch wurden zunächst unbehandelte Mäuse über einen Zeitraum von 3 Tagen mit dem Hapten TDI 0,5 % auf der Innen- und Außenseite des linken Ohrs behandelt.

Neben einer Gruppe von H4R-Knockout-Mäusen und einer Vehikelgruppe wurde eine Behandlungsgruppe mit JNJ7777120 s.c. behandelt.

Vor der ersten Behandlung wurde die Ohrdicke aller Mäuse gemessen. An den Tagen 1 bis 3 erfolgte eine Applikation von 20 µl TDI (0,5 %) auf das linke Ohr. 30 Minuten vor und 2 Stunden nach jeder TDI-Gabe wurden einer Wildtypmaus-Gruppe 30 mg/kg JNJ7777120 (gelöst in 1,5 % DMSO/PBS) s.c. in den Nacken appliziert. An Tag 5 wurde erneut die Ohrdicke gemessen und die Tiere durch zervikale Dislokation getötet. Für weitere Untersuchungen wurden die Lnn. auricularis und die Milz entnommen und die Ohren bei -80 °C eingefroren (für weiterführende Untersuchungen siehe Kapitel 3.4.4).

Abbildung 3-1: Versuchsaufbau in der Sensibilisierung mit TDI

3.4.1.1.2 Challenge

Für diesen Versuch standen vier Versuchsgruppen mit je 4 weiblichen und 4 männlichen Wildtyp- bzw. H4R-Knockout-Mäusen zur Verfügung. Eine Gruppe von Wildtyp-Mäusen diente als Kontrollgruppe, die nur mit dem Hapten TDI 5 % in Kontakt kam. Eine andere Gruppe von Wildtyp-Mäusen wurde sowohl in der Sensibilisierungs- als auch in der Challengephase, eine andere nur in der Challengephase mit JNJ7777120 (30 mg/kg) s.c.

behandelt. JNJ7777120 wurde immer 30 Minuten vor und 2 Stunden nach TDI-Gabe (0,5 %) s.c. in den Nacken injiziert. Die H4R-Knockout-Mäuse wurden nur mit dem Hapten behandelt.

Während jeder Challenge wurde vor und 24 Stunden nach Behandlung der Ohren mit dem Allergen die Ohrdicke bestimmt. Nach Challenge 8 (Woche 11) wurden die Tiere getötet. Die Ohren wurden für weitergehende Untersuchungen (Zytokinbestimmung) bei -80 °C eingefroren. Zudem wurden die Lymphknoten entnommen und entsprechende dem Local-Lymph-Node-Assay (LLNA) behandelt. Außerdem wurden aus der Milz T-Lymphozyten gewonnen (für weiterführende Untersuchungen siehe Kapitel 3.4.4).

Abbildung 3-2: Versuchsaufbau in der Challenge mit TDI

3.4.2 FITC-Kontaktallergiemodell

In diesem Versuchsmodell war der Einfluss des H4R auf die allergische Entzündung von Interesse, die durch Applikation des Haptens Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) ausgelöst wurde. Als Untersuchungsparameter dienten in vivo die Ohrschwellung und ex vivo die Expression verschiedener inflammatorischer Zytokine in den Ohren und Lymphozyten. Zur Vorbereitung der Versuche wurden Wildtyp-Mäuse sowie H4R-Knockout-Mäuse in der Abdominalregion mittels Veet-Enthaarungscreme enthaart, die auf die Bauchhaut aufgetragen und nach drei Minuten Einwirkzeit mit einem feuchten Tuch wieder entfernt wurde. Am darauffolgenden Tag wurde mit der Behandlung der Tiere begonnen. Hierzu wurde die Bauchhaut zunächst zehnmal mit Tesafilmstreifen behandelt (Tape-Stripping) und daraufhin an Tag 1 und 2 jeweils 100 µl 1,5 % FITC auf das Abdomen aufgetragen. Durch die Behandlung der Bauchhaut mit Tesafilm während der Sensibilisierung wurden die oberen Hornschichten entfernt. Dadurch erreichte man eine Störung der Barrierefunktion und somit eine verbesserte Penetration des Kontaktallergens. An Tag 7 wurde die Ohrdicke der Tiere bestimmt und die Challenge durch die Gabe von 15 µl FITC auf die Innen- und Außenseite des linken Ohrs begonnen. Zudem begann an Tag 7 die Behandlung mit JNJ7777120 im wöchentlichen Abstand.

3.4.2.1 Untersuchung des Einflusses des H4R auf die allergische Entzündung im FITC-Kontaktallergiemodell

3.4.2.1.1 Sensibilisierung

Über einen Zeitraum von 3 Tagen wurden zunächst unbehandelte Wildtyp-Mäuse mit FITC 0,1 % behandelt. Den Mäusen wurde das Hapten auf das linke Ohr appliziert. Die Behandlungsgruppe wurde mit JNJ7777120 (50 mg/kg) oral behandelt, die Vehikelgruppe bekam das Lösungsmittel von JNJ7777120 oral appliziert. Zudem dienten unbehandelte Kontrollmäuse, die nicht mit dem Hapten in Kontakt kamen, als Basalkontrolle.

Die Behandlung an Tag 1 bis 3 mit JNJ7777120 bzw. Hydroxypropyl-β-Cyclodextrin (HPBCD) erfolgte je 30 Minuten vor und 4 Stunden nach der Applikation von FITC. An Tag 5 wurde erneut die Ohrdicke bestimmt. Anschließend wurden die Tiere mittels zervikaler Dislokation getötet. Die regionalen Lymphknoten wurden für die Durchführung eines LLNA

entnommen. Die genaue Beschreibung der weiterführenden Untersuchungen sind in Kapitel 3.4.4 aufgeführt.

Abbildung 3-3: Behandlungsschema in der Sensibilisierung; X = 1 mal pro Tag

3.4.2.1.2 Challenge

Für diesen Versuch standen drei Gruppen von Wildtyp-Mäusen und eine von H4 R-Knockout-Mäusen zur Verfügung. Bei zwei Behandlungsgruppen (Wildtyp-Mäuse) erfolgte eine orale Behandlung mit JNJ7777120 in zwei unterschiedlichen Konzentrationen (20 mg/kg und 50 mg/kg), die andere Wildtyp-Maus-Gruppe bekam ausschließlich das Lösungsmittel von JNJ7777120 appliziert. Die H4R-Knockout-Maus-Gruppe wurde nur mit dem Hapten behandelt. Vor Versuchsbeginn wurde die Ohrdicke der Tiere auf beiden Seiten bestimmt.

Danach erfolgte bei allen Gruppen die Sensibilisierung wie zuvor beschrieben. An Tag 6 erfolgte eine Applikation von FITC 0,5 % (15 µl) auf das linke Ohr. 20 Minuten vor und 4 Stunden nach Gabe des Haptens erfolgte eine orale Behandlung mit JNJ7777120. Weitere 24 Stunden danach wurde die Ohrdicke der Mäuse bestimmt. An Tag 13 wurde den Tieren 1,5 % FITC (15 µl) auf das rechte Ohr appliziert. Erneut erfolgte 20 Minuten vor und 2 Stunden nach FITC-Applikation eine orale Behandlung mit JNJ7777120. Die Ohrdicke wurde 24 Stunden nach der Behandlung bestimmt. Nachdem die Tiere mittels zervikaler Dislokation getötet wurden, wurden die Ohren und die Lymphknoten für die Bestimmung von Zytokinkonzentrationen mittels ELISA entnommen.

Abbildung 3-4: Versuchsaufbau in der Challenge mit FITC

In einem weiteren Versuch in der Challengephase wurden die Tiere in drei Gruppen (Wildtyp-Mäuse) aufgeteilt. Der einen Behandlungsgruppe wurde JNJ7777120 (50 mg/kg) oral appliziert, einer anderen ausschließlich das Lösungsmittel HPBCD. Zudem diente eine Gruppe als unbehandelte Basalkontrolle. Die Sensibilisierung erfolgte wie in Kapitel 3.4.2.1.1 beschrieben. Ab Tag 6 wurde wöchentlich vor und 24 Stunden nach der Hapten-Applikation (15 µl von 1,5 % FITC auf die Innen- und Außenseite des linken Ohrs) die Ohrdicke bestimmt. Die Gabe von JNJ7777120 bzw. dem Lösungsmittel erfolgte 20 Minuten vor und 4 Stunden nach Gabe des Haptens FITC.

Abbildung 3-5: Versuchsaubau in der Challenge mit FITC

3.4.3 Versuche zum akuten Entzündungsgeschehen

Ein möglicher Einfluss des H4R ein akutes Entzündungsgeschehen wurde im Arachidonsäure-Modell untersucht. Hierbei wurde durch die topische Gabe von Arachidonsäure (AA) 5 % eine entzündliche Ohrschwellung ausgelöst. Die ausgelöste Entzündung wurde anhand der entstehenden Ohrschwellung untersucht.

3.4.3.1 Untersuchung zum Einfluss des H4R auf die Arachidonsäure-induzierte Entzündung

In diesem Versuch gab es vier Gruppen, zwei Wildtypmaus-Gruppen und zwei H4 R-Knockout-Maus-Gruppen. Je eine diente als Vehikel-, die andere als Behandlungsgruppe, die mit JNJ7777120 (30 mg/kg) intraperitoneal behandelt wurden. Den Vehikelgruppen wurde das Lösungsmittel intraperitoneal gespritzt. Bei allen Gruppen wurde 30 Minuten später AA 5 % (20 µl) auf das Ohr gegeben. Nach weiteren 30 Minuten wurde die Ohrdicke bestimmt.

3.4.4 Einzelparameter der In-vivo-Versuche 3.4.4.1 Mouse-Ear-Swelling-Test (MEST)

Das Prinzip des MEST ist die Erfassung der Ohrdicke vor und nach der Applikation des Entzündungszreizes, der durch das Hapten bzw. durch die Arachidonsäure ausgelöst wird. Die Zunahme der Ohrdicke wurde als Parameter für eine entzündliche Reaktion herangezogen.

Die Durchführung erfolgte in Anlehnung an GAD et al. (1986) und BÄUMER et al. (2004).

Vor Beginn des Versuchs wurde die ursprüngliche Dicke des Mäuseohres in µm gemessen.

Als Messwerkzeug diente ein Cutimeter nach Mitutoyo (GAD et al., 1986). Die zweite Messung und somit die Erfassung der Zunahme der Ohrdicke erfolgte 24 Stunden nach Hapten- bzw. 30 Minuten nach AA-Gabe. Die Differenz der Werte ergab die tatsächliche Ohrschwellung.

3.4.4.2 Local-Lymph-Node-Assay (LLNA)

Der LLNA diente dazu die Proliferationsrate der T-Zellen nach deren Stimulierung durch antigenpräsentierende Zellen zu untersuchen. Beim LLNA diente die Bestimmung des Gewichtes und der Gesamtzellzahl der regionalen Lymphknoten als Messparameter (EHLING et al., 2005). Werden im Rahmen der Sensibilisierung T-Zellen durch in den Lymphknoten migrierte antigenpräsentierende Zellen stimuliert, so proliferieren sie und führen nachfolgend zu einer Erhöhung des Gewichtes der zum Entzündungsgebiet gehörigen (drainierenden) Lymphknoten.

3.4.4.3 Gewinnung und Untersuchung der Lnn. auriculares

Den Tieren wurden post mortem die regionalen Lymphknoten (Lnn. auriculares) der behandelten Ohrseite bzw. der unbehandelten Kontrollohren entnommen. Sie wurden zunächst jeweils in ein Well einer 24-Well-Platte mit PBS gelegt, von umgebenen Gewebe befreit und mit Hilfe einer Feinwaage gewogen. Um die Gesamtzahl der Lymphknotenzellen zu bestimmen, wurde von jedem Lymphknoten eine Zellsuspension hergestellt. Die in 500 µl PBS aufgenommenen Lymphknoten wurden mit Hilfe eines Homogenisators mit einem Glaspistill zerkleinert. Die gewonne Zellsuspension wurde in ein Eppendorfgefäß überführt

und bei 500 g und 4 °C für 10 Minuten zentrifugiert. Nach Dekantieren des Überstandes wurde das Zellpellet in 1 ml RPMI-Medium resuspendiert. Anschließend wurden von jeder Probe 10 µl entnommen und mit 90 µl Trypanblau (1:10) gemischt. Die Gesamtzellzahl wurde dann mittels der Neubauerzählkammer bestimmt. Von jeder Probe der Zellsupension wurden 5 x 10⁵ Zellen entnommen, in eine 48-Well-Platte überführt und mit RPMI-Medium auf 500 µl aufgefüllt. Jede Probe wurde mit 2 µg/ml ConA bzw. 1 mg/ml FITC für 72 Stunden stimuliert. ConA fungiert hierbei als Mitogen, welches die T-Lymphozyten stimuliert. Zur weiteren Untersuchung (ELISA) wurden die Überstände bei -20 °C eingefroren.

3.4.4.5 Proteinextraktion aus den Ohren

Um die Gesamtproteinmenge in den Ohren bestimmen zu können wurden die geforenen Ohren mittels Mörser unter flüssigem Stickstoff zerkleinert. Nach Zugabe von Medium und Proteaseblocker folgte eine Inkubationsphase von zwei Stunden auf Eis. Danach wurde die Suspension für 10 min bei 3000g und 4 °C zentrifugiert und der Überstand abpipettiert. In eine 96-well Platte wurden 0,5 µl des Überstandes mit 159,5 µl Medium überführt, in der zu jeder Probe 40 µl Biorad-Reagenz zugeführt wurde. Nach einer Inkubationsphase von 5 Minuten bei Raumtemperatur wurde die Proteinmenge bei 570 nm im MRX-Reader gemessen. Um in jeder Probe die gleiche Gesamtproteinmenge zu haben wurde die jeweilige Suspension entsprechend der gemessenen Werte verdünnt. Nun wurde die Suspension bei -20 °C für weitere Untersuchungen (ELISA) eingefroren. Für diese von BRADFORD (1976) entwickelte Methode wurde ein kommerzielles Kit (Biorad protein assay) verwendet (BRADFORD, 1976).

3.5 In-vitro-Versuche

3.5.1 Generierung muriner dendritischer Zellen

Die Gewinnung dendritischer Vorläuferzellen für die In-vitro-Experimente wurde nach einem Protokoll von LUTZ et al. (1999) durchgeführt. Die Kultivierung der Zellen (= BMDC, bone marrow derived dendritic cells) erfolgte über 10 Tage im Brutschrank.

Die Mäuse wurden durch zervikale Dislokation getötet und der Femur mittels sterilem Instrumentarium herauspräpariert. Der Femur wurde durch Abschaben mittels einer Skalpellklinge von der Muskulatur freipräpariert, um jedwede Kontamination zu vermeiden.

Nach vollständiger Reinigung des Femur wurde dieser zunächst zur Desinfektion für 2 bis 5 Minuten in 70 % Ethanol, nachfolgend für einige Minuten in steriles PBS gelegt. Die Femurköpfe wurden mit Hilfe einer Skalpellklinge abgetrennt. Der Knochen wurde von beiden Seiten mit insgesamt 5 ml sterilfiltriertem PBS durchspült. Die Flüssigkeit wurde in einem Falconröhrchen aufgefangen, resuspendiert und anschließend für 10 Minuten bei 290 g und 4 °C zentrifugiert. Nach Verwerfen des Überstandes wurde das Zellpellet in 5 ml DC-Medium resuspendiert. Um die Zellzahl der gewonnen Zellen zu bestimmen, wurden 100 µl der Zellsuspension für 5 Minuten in 100 µl Schwinzer-Lyse, einem Erythrozyten-Lysepuffer, bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Zellen im Verhältnis 1:3 mit Trypanblau gefärbt und mit Hilfe einer Neubauer Zählkammer gezählt. 2,5 bis 3,5 Millionen Zellen wurden in einer Cell⁺-Petrischale in 10 ml DC-Medium, unter Zugabe des Wachstumsfaktors GM-CSF (20 ng/ml) aufgenommen und die Zellen im Brutschrank bei 37 °C und 5 % CO2 im Brutschrank inkubiert. An Tag 3 erfolgte die Zugabe von 10 ml DC-Medium und GMCSF (20 ng/ml), an Tag 6 und 8 wurden 10 ml der Suspension abgenommen und zentrifugiert (290 g, 4 °C, 10 Minuten). Nach Verwerfen des Überstandes wurde das Zellpellet in frischem DC-Medium aufgenommen, resuspendiert und unter erneuter Zugabe des Wachstumsfaktors zu der verbliebenen Suspension gegeben. An Tag 10 standen die Zellen zur Behandlung zur Verfügung.

3.5.2 Stimulation muriner dendritischer Zellen mit Toll-Like-Receptor-Agonisten Die murinen DC von Wildtyp- und H4R-Knockout-Mäusen wurden an Tag 9 ihrer Kultivierung abgenommen und zentrifugiert (290 g, 4 °C, 10 Minuten). Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet in 3 ml DC-Medium aufgenommen. 50 µl der Zellsuspension wurden in 100 µl Trypanblau aufgenommen und mit Hilfe einer Neubauer Zählkammer gezählt. In einer 48-well-Platte wurden 250.000 Zellen in 500 µl ausgesät und mit den TLR-Agonisten behandelt. Die Zellen wurden für 24 Stunden mit 1 µg/ml Lipopolysaccharid (LPS), 10 µg/ml Lipoteichonsäure (LTA) und 10 µg/ml Peptidoglykan (PGN) im Brutschrank inkubiert. Hierbei fungiert LPS als TLR-4-Aktivator, PGN und LTA stimulieren den TLR-2.

Nach der Stimulation wurden die Überstände abgenommen, zentrifugiert (500g, 4 °C, 10

Minuten) und bis zur weiteren Untersuchung mittels ELISA bei -20 °C eingefroren. Um den Einfluss von Histamin und 4-Methylhistamin (4-MH) auf die Zytokinproduktion zu untersuchen, wurden die kultivierten DC bereits an Tag 8 wie oben beschrieben abgenommen, gezählt und ausgesät und für 24h mit Histamin (1 mmol/l) bzw. 4-MH (10 µmol/l) vorstimuliert. Erst danach erfolgte die Stimulation mit den TLR-Agonisten wie beschrieben.

Um die TLR-induzierte Zytokin-Sekretion beurteilen zu können, wurden unbehandelte Kontrollen mitgeführt. Die Zytokine wurden mittels ELISA bestimmt.

3.5.3 Zytokinbestimmung in Zellkulturüberständen mittels ELISA

Die Bestimmung der Konzentration von verschiedenen Zytokinen (IL-12, IL-23, IL-27, TNFα, IFNγ, IL-17, IL-6, IL-10, CCL2, IL-1β) in den Überständen kultivierter DC wurde mittels enzymgebundenem Immunadsorptionstest (ELISA, Enzyme Linked Immunosorbent Assay) durchgeführt. Mit Hilfe dieses Tests können geringste Mengen an Peptiden und somit die Wechselwirkung zwischen Antigen und Antikörper nachgewiesen werden. Die ELISAs wurden nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Bei jedem Messansatz wurde eine Standardreihe mitgeführt.

3.6 Statistische Auswertung

Die Darstellung der Ergebnisse erfolgte mit Angabe der Mittelwerte (MW) ± Standardfehler (SEM). Die statistische Auswertung erfolgte mit dem Programm GraphPadPrism (Version 4.01, GraphPad Software, Inc.). In den Versuchen, in denen nur eine Vergleichsgruppe mit der Kontrollgruppe verglichen wurde, wurde ein ungepaarter T-Test verwendet. Bei Versuchen, bei denen die Kontrollgruppe mehreren Vergleichsgruppen gegenübergestellt wurde, wurde eine parametrische Varianz-Analyse (One-way-Anova) mit nachfolgendem Dunnetts-Test als post-hoc-Test gewählt. Es wurden Irrtumswahrscheinlichkeiten von 5 %, 1

% und 0,1 % bestimmt. Die entsprechenden Einzelwerte der durchgeführten Versuche sind in den Anhangstabellen aufgeführt.

4 Ergebnisse

4.1 In-Vitro-Versuche

4.1.1 Einfluss des H4R auf die Zytokinkonzentration nach Stimulation mit Toll-Like-Receptor-Agonisten

In vitro wurde der Einfluss des Histamin-H4-Rezeptors (H4R) auf die Produktion verschiedener pro- und antiinflammatorischen Zytokine untersucht. Die Zytokinsekretion von bone-marrow-derived dendritic cells (DC) von Wildtyp- und von H4R-Knockout-Mäusen wurden miteinander verglichen.

4.1.1.1 Einfluss auf die Sekretion der Zytokine IL-12, IL-23 und IL-27

Alle mit einem Toll-Like-Receptor-Agonisten (TLR-Agonisten) stimulierten DC von Wildtyp-Mäusen wie von H4R-Knockout-Mäuse zeigten nach Stimulation mit Lipopolysaccharid (LPS), Lipoteichonsäure (LTA) und Peptidoglykan (PGN) im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle eine erhöhte Konzentration der Zytokine. Dieser Effekt war bei Stimulation mit PGN bei allen drei Zytokinen am deutlichsten. Des weiteren war überall eine konstant höhere Konzentration von allen Zytokinen bei den H4R-Knockout-DC im Vergleich zu den Wildtyp-DC zu sehen, die sich teilweise als signifikant darstellte. Abbildungen 4-1, 4-2 und 4-3 zeigen die Mittelwerte aus sechs unabhängigen Versuchen, in denen sich überall die gleichen Tendenzen zeigten.

Abbildung 4-1: IL-12-Konzentration muriner dendritischer Zellen nach Stimulation mit TLR-Agonisten

Abbildung 4-1: IL-12-Konzentration muriner dendritischer Zellen nach Stimulation mit TLR-Agonisten

Im Dokument Einfluss des Histamin-H4-Rezeptors auf die T-Zell-Aktivierung bei allergischen Hauterkrankungen (Seite 47-0)