4.1 Methoden im Tiermodell
4.1.3 Leberaufarbeitung
Um das Lebergewebe weiteren aufwendigen Analysen, wie histologischer, molekularbio-logischer und durchflusszytometrischer Untersuchungen, zugänglich zu machen, bedurf-te es zuvor einer sorgfältigen Entnahme und Aufbedurf-teilung des Gewebes.
Euthanasie
Die Euthanasie der Tiere wurde in einem durchsichtigen Behälter mittels ansteigender Kohlenstoffdioxidkonzentration durchgeführt. Die ansteigende Kohlenstoffdioxidkonzen-tration führt durch den direkt narkotisierenden Effekt zunächst zur Bewusstlosigkeit und schließlich durch die Hypoxie zum Tod.179
Hepatektomie
Die Tiere wurden in Rückenlage
Korkplatte befestigt. Nach Befeuchtung des Fells die Tiere mit einer spitzen Schere
bis oberhalb des Xiphoids erneut
ischämischen Leberlappen, bestehend aus Lobus medialis
(Abb. 2), nach kranial mobilisiert hepatica propria, der Vena portae schließend wurden die Porta hepatis
zen Schere (3.4) durchtrennt, sodass die ischämischen Leberlappen mithilfe einer an der Gallenblase fixierten, gebogenen Pinzette
kleinen Petrischale (3.5) wurde von der ischämischen Mausleber für immunhistochemische Färbung von sionsanalyse (4.1.5) abgetrennt
Abb. 3.Ischämische Anteile der Tierleber
Der verbliebene Rest des Lobus medialis und Lobus lateralis
zisionswaage (3.3) gewogen, nach Entfernung der Gallenblase aufgearbeitet und a schließend für den Enzymimmunoassay
trie (4.1.7), kurz FACS, verwendet. Bis zur Weiterverarbeitung wurde die RT-PCR (4.1.5.2) in
2-ml-munhistochemische Färbung von Kryostatschnitten
wurden in Rückenlage mittels Kanülen (3.5) an den Extremitäten a Korkplatte befestigt. Nach Befeuchtung des Fells mit 70%igem Isopropanol
mit einer spitzen Schere (3.4) ventral vom Beckenrand ausgehend erneut eröffnet. Mit einem Wattestäbchen
ischämischen Leberlappen, bestehend aus Lobus medialis und Lobus lateralis sinister mobilisiert, sodass der Blick auf die Porta hepatis
Vena portae und dem Ductus hepaticus communis frei wurde. A Porta hepatis sowie abgehende Gefäße der Leber mit
durchtrennt, sodass die ischämischen Leberlappen mithilfe einer an der gebogenen Pinzette (3.4) entnommen werden konnten. In einer wurden mit einem Einwegskalpell (3.5) drei kleine Leberanteile von der ischämischen Mausleber für die HE-Färbung von Paraffinschnitten
immunhistochemische Färbung von Kryostatschnitten (4.1.4.2) sowie abgetrennt (Abb. 3).
der Tierleber zur weiteren Analyse. Modifiziert nach Abe et al.
Der verbliebene Rest des Lobus medialis und Lobus lateralis sinister wurde mittels Pr gewogen, nach Entfernung der Gallenblase aufgearbeitet und a schließend für den Enzymimmunoassay (4.1.6), kurz ELISA, und die Durchflusszytome
verwendet. Bis zur Weiterverarbeitung wurde der Leberanteil für -Rundbodenröhrchen (3.5) aufbewahrt. Der Anteil für die i munhistochemische Färbung von Kryostatschnitten (4.1.4.2) wurde mit Einbettmedium
an den Extremitäten auf einer mit 70%igem Isopropanol (3.6) wurden vom Beckenrand ausgehend nach kranial Mit einem Wattestäbchen (3.5) wurden die Lobus lateralis sinister Porta hepatis mit der Arteria Ductus hepaticus communis frei wurde. An-sowie abgehende Gefäße der Leber mit einer spit-durchtrennt, sodass die ischämischen Leberlappen mithilfe einer an der
entnommen werden konnten. In einer kleine Leberanteile Färbung von Paraffinschnitten (4.1.4.1), die sowie die
Genexpres-odifiziert nach Abe et al.178.
sinister wurde mittels Prä-gewogen, nach Entfernung der Gallenblase aufgearbeitet und an-, kurz ELISAan-, und die Durchflusszytome-der Leberanteil für aufbewahrt. Der Anteil für die
im-wurde mit Einbettmedium
(3.6) in Einbettschälchen (3.5) fixiert, temporär in flüssigem Stickstoff im Dewar (3.4) gefro-ren und dann bei –80 °C aufbewahrt. Der Anteil für die HE-Färbung von Paraffinschnitten
(4.1.4.1) wurde zunächst in Einbettschälchen (3.5) gelagert und in Formaldehydlösung
(3.6) fixiert.
Einzelzellsuspensionsgewinnung
Nach Abtrennung der drei Leberanteile für die oben genannten experimentellen Verfah-ren wurden die übrig gebliebenen Anteile des Lobus medialis und Lobus lateralis sinister mit der MACS®-Technologie zur Erstellung von Einzelzellsuspensionen aufgearbeitet, womit eine hohe und reine Zellausbeute während der Zelltrennung erreicht werden kann180. Zur Abmessung der Volumina wurde eine Pipettierhilfe (3.3) verwendet. Die Ge-webedissoziationsröhrchen (3.5) wurden zunächst mit einem Inkubationsmix, bestehend aus 4,4 ml KRB (3.10), 500 µl Kollagenase-IV (3.6), 50 µl Magnesiumchlorid (3.6), 20 µl Calciumchlorid (3.6) und 25 µl DNAse (3.6), befüllt und für 30 min bei 37 °C auf einem Tischrundschüttler (3.3) inkubiert. Dann wurde die zuvor mit KRB (3.10) gewaschene Le-ber in den Inkubationsmix gegeben und in einem Gewebedissoziator (3.3) mit dem ersten Leberprogramm zerkleinert, für 30 min bei 37 °C auf einem Tischrundschüttler (3.3) inku-biert und anschließend ein zweites Mal im Gewebedissoziator (3.3) mit dem zweiten Le-berprogramm weiter zerkleinert. Im nächsten Schritt wurde die Probe im Gewebe-dissoziationsröhrchen (3.5) für 5 min bei 1.500 rpm zentrifugiert (3.3), um dann den Über-stand zu verwerfen. Anschließend wurden zur Resuspension 5 ml PBS (3.6) verwendet.
Das resuspendierte Gewebe wurde im nächsten Schritt über einen Zellfilter (3.5) in ein 50-ml-Röhrchen (3.5) filtriert, verbliebene Leberreste im Gewebedissoziationsröhrchen
(3.5) in weiteren 5 ml PBS (3.6) gelöst und in dasselbe 50-ml-Röhrchen (3.5) filtriert. Um kontaminierende Hepatozyten in dem 50-ml-Röhrchen (3.5) aus der Probe zu entfernen, wurde diese für 5 min bei 300 rpm zentrifugiert (3.3), sodass sich die Hepatozyten am Boden absetzten. Der Überstand wurde mit einer serologischen 10-ml-Pipette (3.3; 3.5) in ein weiteres 50-ml-Röhrchen (3.5) überführt, welches im nächsten Schritt für 5 min bei 1.500 rpm zentrifugiert (3.3) wurde. Der dabei entstandene Überstand wurde dann ver-worfen. Um das sich am Boden des 50-ml-Röhrchens (3.5) befindliche Pellet zu resus-pendieren, wurden 1 ml PBS (3.6) und 9 ml erwärmter Erythrozyten-Auflösungspuffer
(3.6) dazugegeben, mittels Schüttler (3.3) vermischt und für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Danach schloss sich eine 5-minütige Zentrifugierung (3.3) bei 1.500 rpm an, um dann den Überstand wieder zu verwerfen. Anschließend wurde das Pellet mit 10 ml PBS
(3.6) in dem 50-ml-Röhrchen (3.5) wieder resuspendiert und davon 10 µl verwendet, um die enthaltenen Zellen in einer Neubauer-Zählkammer zu quantifizieren. Zur
Quantifizie-rung wurden zu den 10 µl des mit PBS (3.6) resuspendierten Pellets 90 µl Trypanblau
(3.6) gegeben und die entstandene 1:10-Verdünnung in einer ELISA-96-Lochplatte (3.5)
gemischt. Dann wurden 10 µl der gemischten Verdünnung in die Zählkammer gegeben, die äußeren vier Quadranten ausgezählt und daraus die Zellzahl pro ml errechnet. Nach Wegnahme der 10 µl von dem resuspendierten Pellet für die Quantifizierung wurde der Rest noch 2-malig mit jeweils 5-minütiger Zentrifugierung (3.3), erneuter Zugabe von 10 ml PBS (3.6) und Verwerfung des Überstands gewaschen.
Zellaktivierung
Unter einer Sterilbank wurde das aufgearbeitete resuspendierte Pellet aus der Einzel-zellsuspensionsgewinnung in 1 ml Kulturmedium (3.10) überführt und gemischt, um dann in einer 24-Lochplatte (3.5) mit jeweils 100 µl Vollmedium (3.10) versetzt zu werden. Da-nach wurden die Zellen für 4 Stunden bei 37 °C inkubiert. Das Vollmedium (3.10) enthält neben Kulturmedium auch PMA, Ionomycin und BD-GolgiStop™. Unter der Annahme, dass die Anzahl von Zellen, die ein bestimmtes Zytokin produzieren, sehr klein ist, wird eine externe Aktivierung durch unspezifische Stimulatoren, wie PMA oder Ionophor, er-reicht.181 Um dann die Zytokinsekretion und -akkumulation in der Zelle zu vermeiden, wird GolgiStop, auch Monesin genannt, verwendet.181
Im Anschluss an die abgeschlossene Inkubation wurden die Zellen aus der 24-Loch-platte (3.5) abgeerntet und bei 1.500 rpm für 5 min zentrifugiert (3.3). Der dabei entstan-dene Überstand wurde jeweils in 1,5-ml-Gefäße (3.5) aliquotiert und für den ELISA (4.1.6)
weiterverwendet, während das Pellet für die durchflusszytometrische Analyse (4.1.7) wei-terverarbeitet wurde.