4.1 Methoden im Tiermodell
4.1.7 Durchflusszytometrie
Die FACS-Analyse stellt ein Verfahren dar, sowohl intrazelluläre Proteine als auch Ober-flächenantigene von Zellen mittels fluoreszenzmarkierter Antikörper zu identifizieren, um Zellgemische zu analysieren.194 Die Oberflächenantigene sind für die verschiedenen Zel-len des Immunsystems charakteristisch und werden als CD-Antigene bezeichnet.194 Die markierten Zellen werden in einem Probengefäß elektrisch aufgeladen, um dann einzeln einen Laserstrahl zu passieren, der den Fluoreszenzfarbstoff anregt.194 Wenn die Zelle den Laserstrahl passiert, streut sie das einfallende Laserlicht in alle Richtungen, wobei zwischen dem Vorwärtsstreulicht, kurz FSc, und dem Seitwärtsstreulicht, kurz SSc, un-terschieden wird.195 Das FSc einer Zelle korreliert näherungsweise mit deren Zellgröße während das SSc mit der Granularität oder anderen intrazellulären Komplexen, wie zum Beispiel Vakuolen, korreliert.195 Geeignete Detektoren erfassen das FSc und SSc und wandeln deren Energie in ein elektrisches Signal um, das proportional zur Lichtintensität ist.195 Anhand der Fluoreszenzsignale wird die Anzahl der jeweiligen Zellen in einer Gra-fik dargestellt, in der jeder Punkt eine Zelle darstellt.194
Durchführung
Die FACS-Analyse wurde mit dem Durchflusszytometer FACSCanto™-II (3.3) durchge-führt, welcher bis zu acht Fluoreszenzfarbstoffe detektieren kann.196 Das aus der Zellak-tivierung im Rahmen der Leberaufarbeitung hervorgegangene Pellet (4.1.3, Abb. 3) wurde in 5-ml-Probenröhren (3.5) mit MACS-Puffer (3.10) unter Zuhilfenahme eines Schüttlers
(3.3) resuspendiert. Da das Durchflusszytometer maximal acht Farbstoffe pro Lauf detek-tieren kann, wurde jede Probe für zwei verschiedene Ansätze (Tab. 4-5 A und B; Tab. 4-6 A und B) jeweils auf 5-ml-Probenröhren (3.5) aufgeteilt und mit MACS-Puffer (3.10) auf 2 ml aufgefüllt. Dann wurden diese resuspendierten Zellen bei 1.500 rpm für 5 min zentrifu-giert (3.3). Der dabei entstandene Überstand wurde verworfen und das Pellet in einem zweiten Waschschritt mit 1 ml MACS-Puffer (3.10) wieder resuspendiert, zentrifugiert (3.3)
und der Überstand wieder verworfen.
Oberflächenfärbung
Im nächsten Schritt der Oberflächenfärbung wurden die aufgeteilten Proben jeweils mit 100 µl Mastermix zweier Ansätze (Tab. 4-5 A und B) versetzt und für 15 min bei 4 °C im Dunkeln inkubiert. Die Mastermixe wurden in zwei Ansätzen entsprechend der unten stehenden Tabellen (Tab. 4-5 A und B) angefertigt.
Wenn mehrere Fluoreszenzfarbstoffe verwendet werden, besteht die Möglichkeit der Fluoreszenzüberlagerung durch die überlappenden Emissionsspektren.197 Beispielswei-se werden FITC und PE bei 488 nm angeregt, wobei deren maximale Emissionspeaks bei 520 nm beziehungsweise 575 nm liegen.197 Da jedoch die Emissionswellenlänge die-ser Fluoreszenzfarbstoffe relativ breit ist, findet trotz des Einsatzes von Filtern eine Über-lappung zwischen den beiden Emissionen statt.197 Die Programme des Durchflusszyto-meters eliminieren diese Überlappungen der Fluoreszenz, was als Kompensation be- zeichnet wird.197 Um praktischerweise diese Kompensation einzustellen, wurde für jeden Fluoreszenzfarbstoff jeweils eine 5-ml-Probenröhre (3.5) als Kompensationsröhrchen mitgemessen. Zur Kompensation der Überlappung der Fluoreszenzfarbstoffe wurde von jedem Fluorochrom ein Kompensationsröhrchen mit Leberzellen einer C57BL/6-Wildtyp-maus (3.1) erstellt, indem die jeweils in den Tab. 4-5 A und B angegebenen Mengen des entsprechenden fluoreszenzfarbstoffmarkierten Antikörpers mit 100 µl MACS-Puffer
(3.10) versetzt wurden.
Tab. 4-5. Durchflusszytometrie-Mastermix für die Oberflächenfärbung
A Antigen Fluorochrom Menge in µl/Probe
Antikörper CD3 APC-Cy7 (3.8, Tab. 3-7) 1
CD27 PE-Cy7 (3.8, Tab. 3-7) 1
γδTCR APC (3.8, Tab. 3-7) 1,25
NK1.1 PE (3.8, Tab. 3-7) 1
Aqua 0,1
Puffer MACS-Puffer (3.10) 95,65
B Antigen Fluorochrom Menge in µl/Probe
Antikörper CD3 APC-Cy7 (3.8, Tab. 3-7) 1
CD4 APC (3.8, Tab. 3-7) 1
CD8 PB (eFluor450) (3.8,
Tab. 3-7) 0,625
NK1.1 PE-Cy7 (3.8, Tab. 3-7) 1
Aqua 0,1
Puffer MACS-Puffer (3.10) 96,275
Zur Negativkontrolle, die ungefärbte Zellen einer C57BL/6-Wildtypmaus (3.1) enthält, wurde lediglich 100 µl MACS-Puffer (3.10) zugegeben. Diese ungefärbten Zellen sind notwendig, um vor der eigentlichen Messung der Proben die Detektorspannung des Durchflusszytometers (3.3) für das FSc und SSc manuell einzustellen. Im Anschluss wur-den sowohl die zu messenwur-den Proben als auch die Kompensationsröhrchen mit 1 ml MACS-Puffer (3.10) gewaschen, bei 1.500 rpm für 5 min zentrifugiert (3.3) und der Über-stand verworfen, um ungebundene fluoreszenzmarkierte Antikörper zu entfernen.
Intrazelluläre Färbung
Im Anschluss an die Oberflächenfärbung wurde mit der Prozedur der intrazellulären Fär-bung fortgefahren. Dabei wurde zunächst eine Fixierungs-/Permeabilisierungslösung
(3.6) verwendet. Die fixierten Zellen werden durch Reagenzien, wie Saponin, permeabili-siert, was den Antikörpern ermöglicht ins Zytoplasma einzudringen, um mit intrazellulär akkumulierten Zytokinen zu reagieren.181 Daher ist es notwendig, die Oberflächenfär-bung einer Zelle vor der intrazellulären FärOberflächenfär-bung durchzuführen, da sonst durch die per-meabilisierte Membran die Oberflächenantikörper auch intrazelluläre Bereiche anfärben würden.
Zur Durchführung der intrazellulären Färbung wurden im nächsten Schritt die zu mes-senden Proben und die entsprechenden Kompensationsröhrchen jeweils mit 500 µl Fi-xierungs-/Permeabilisierungslösung (3.6) versetzt und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Am nächsten Tag erfolgte dann die intrazelluläre Färbung, wozu im ersten Schritt die inku-bierten Proben für 5 min bei 1.500 rpm zentrifugiert (3.3) wurden und der Überstand ver-worfen wurde. Um die Reste der Fixierungs-/Permeabilisierungslösung (3.6) zu entfer-nen, wurden die Proben und Kompensationsröhrchen mit 1 ml Waschpuffer (3.10) in einem Schüttler (3.3) gewaschen, für 5 min bei 1.500 rpm zentrifugiert (3.3) und der Über-stand verworfen. Dann wurden die Kompensationsröhrchen mit 100 µl Waschpuffer (3.10) vermischt, während die Proben aus Ansatz A der Oberflächenfärbung (Tab. 4-5 A) mit 100 µl des Ansatzes A der intrazellulären Färbung (Tab. 4-6 A) versetzt wurden. Dasselbe wurde für den jeweils anderen Teil der aufgeteilten Proben in Ansatz B (Tab. 4-5 B;
Tab. 4-6 B) durchgeführt. Alle Proben und Kompensationsröhrchen wurden dann auf Eis
(3.3) gestellt und abgedunkelt für 40 min inkubiert. Im letzten Schritt vor der Messung im Durchflusszytometer (3.3) wurden die Proben und Kompensationsröhrchen nochmals mit 1 ml Waschpuffer (3.10) gewaschen, zentrifugiert (3.3) und abgeschüttet, um danach wie-der mit 300 µl Waschpuffer (3.10) versetzt zu werden. Zu den ungefärbten Zellen wurden zusätzlich 200 µl Waschpuffer (3.10) gegeben.
Tab. 4-6. Durchflusszytometrie-Mastermix für die intrazelluläre Färbung
A Antigen Fluorochrom Menge in µl/Probe
Antikörper IFN-γ FITC (3.8, Tab. 3-7) 1
IL-17A PB (3.8, Tab. 3-7) 1,5
Puffer Waschpuffer (3.10) 98
B Antigen Fluorochrom Menge in µl/Probe
Antikörper IFN-γ FITC (3.8, Tab. 3-7) 1
IL-17A PE (3.8, Tab. 3-7) 1
Puffer Waschpuffer (3.10) 98
Auswertung
Die Auswertung erfolgte mit einer speziellen Durchflusszytometriesoftware (3.11). Nach Auswahl von Gerätekonfiguration, Erstellung eines Experiments und Auswahl der Para-meter und verwendeten Fluorochrome (Tab. 4-5 A und B; Tab. 4-6 A und B) wurde die Kom-pensationsautomatik gestartet. Dazu wurden mithilfe der Messung der ungefärbten Zel-len die Grundspannungen des Detektors für FSc und SSc sowie der SchwelZel-lenwert eingestellt, ab dem bestimmte Zellen oder Zellschrott nicht miterfasst werden. Mithilfe des Fluorochroms und Vitalfarbstoffs Aqua wurde zwischen vitalen und toten Zellen un-terschieden. Im nächsten Schritt wurde mit den für jeden Fluoreszenzfarbstoff vorbereite-ten Kompensationsröhrchen die Kompensation berechnet. Nach der Einstellung der Durchflussrate, des Stoppziels und der Stoppzeit konnte mit der Messung der einzelnen Proben begonnen werden. Die verschiedenen Zellpopulationen konnten durch gegensei-tiges Auftragen der verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffe in X-Y-Diagrammen aufge-trennt und quantifiziert werden.