Langzeit‐Kinetik

7.3.9.3 Langzeit‐Kinetik   

Neben der Kurzzeit‐Kinetik aus dem vorangegangenen Kapitel wurde auch noch eine Kinetik  über einen wesentlich längeren Zeitraum (hier 335 Stunden) angefertigt^[XVII]. 

Die Abbildung 7‐81 zeigt das Ergebnis der Kinetik, in man eine kontinuierliche Zunahme der  Form II‐DNA für die Kontrollen erkennen kann. Dieser Befund macht eine Auswertung über  den hier betrachteten Zeitraum schwierig. 

 

1  2  3  4  5 6  7  8 9 10 11 12 13 14 15  16  17

Kontrolle 0 h  Kontrolle 24 h  46 (10 µM), 24 h  Kontrolle 48 h  46 (10 µM), 48 h  Kontrolle 72 h  46 (10 µM), 72 h  Kontrolle 96 h  46 (10 µM), 96 h  Kontrolle 168 h  46 (10 µM), 168 h  Kontrolle 216 h  46 (10 µM), 216 h  Kontrolle 264 h  46 (10 µM), 264 h  Kontrolle 336 h  46 (10 µM), 336 h 

Abbildung 7‐81: Agarose‐Gel von pUC19‐Plasmid‐DNA, die mit 46 inkubiert wurde (pH 7). Im Abstand von je  ein bis drei Tagen wurde eine Probe entnommen, um eine Langzeit‐Kinetik erstellen zu können. Oben im Bild: 

open‐circle‐DNA (Form II), unten supercoiled‐DNA (Form I). In der Analytik ist lineare DNA nur sehr schwach zu  erkennen. 

 

Besonders deutlich wird dies, wenn man sich die quantifizierten Werte in Tabelle 7‐28  anschaut. Die Hintergrundreaktion steigt bis zum Ende der Kinetik auf annähernd 70 % an,  und schon nach 4 Tagen erreicht der Wert problematische 23 %. 

   

XVII Zusätzlich ist auch eine Kinetik bei pH 6.5 durchgeführt worden (hier nicht gezeigt), die aber durch die starke 

Hintergrund‐Reaktion bei diesem pH keine zuverlässige Aussage zulässt. 

Tabelle 7‐28: Quantifizierung der zeit‐abhängigen Umwandlung von supercoiled Plasmid‐DNA in open‐circle‐

DNA (oc). Die Spalte „oc“ steht hierbei für die Summe von open‐circle und ‐falls vorhanden‐ linearer DNA. In  der Spalte „Δ“ ist die Differenz von Kontrolle und der entsprechenden mit 46 inkubierten Probe eingetragen. 

t [h] Lane  Molekül oc [%] Lane Molekül  oc [%]  Δ [%] 

0  1  Kontrolle 0.5    

24  2  Kontrolle 4.4 10 46(10 µM) 47.2  42.8 

48  3  Kontrolle 10.3 11 46(10 µM) 55.7  45.4 

72  4  Kontrolle 15.7 12 46(10 µM) 61.1  45.4 

96  5  Kontrolle 22.4 13 46(10 µM) 66.5  44.1 

168  6  Kontrolle 40.9 14 46(10 µM) 74.5  33.6 

216  7  Kontrolle 50.1 15 46(10 µM) 77.6  27.5 

264  8  Kontrolle 60.0 16 46(10 µM) 81.9  21.9 

336  9  Kontrolle 69.5 17 46(10 µM) 84.6  15.1 

 

Schaut man sich das Experiment über die kompletten 336 Stunden an (siehe dazu Abbildung  7‐82), erscheint der  Effekt  durch  46  als  rückläufig  (grüne  Dreiecke),  sobald  man  den  Hintergrund (blaue Rauten) von der Gesamtspaltung (rote Quadrate) subtrahiert hat. Man  kann aus der Grafik ablesen, dass dieser Trend schon ab 72 h einsetzt. 

 

 

Abbildung 7‐82: Graphische Darstellung der Ergebnisse aus Tabelle 7‐28. Die blauen Rauten zeigen den Trend  der Hintergrund‐Reaktion an, während die roten Quadrate für die Summe aus Hintergrund und Spalteffekt  steht. Die grünen Dreiecke steht für die Differenz aus Gesamtspaltung abzüglich Hintergrund (= „Δ“). 

168  7. IN VITRO‐EXPERIMENTE MIT DNA

7.3.9.4 Einfluss von Metall‐Ionen auf die DNA‐Spaltung   

Wie auch schon bei den Molekülen 45 und 95 sollte auch bei 46 untersucht werden, wie sich  die An‐ bzw. Abwesenheit von Metall‐Ionen bei den Spalt‐Experimenten bemerkbar macht. 

Dazu wurde pUC19‐Plasmid‐DNA in Anwesenheit von EDTA oder MgCl2 in je 4 verschiedenen  Konzentrationen mit 46 inkubiert. 

 

In der Abbildung 7‐83 sieht man zunächst die Kontrollen (Lane 1 bis 3), gefolgt von 4 Proben,  in denen zusammen mit 46 zwischen 1 und 10 mM EDTA anwesend war. Die letzten 4 Lanes  zeigen 46 mit absteigenden Konzentrationen von MgCl2. 

 

Während die ersten beiden Kontrollen annähernd keine open‐circle‐DNA zeigen, sieht man  in Lane 3 die normale durch 46 induzierte Spaltung, die man erhält, wenn nichts anderes  neben der Verbindung anwesend ist. Ab Lane 4 kann man erkennen, dass die Spaltmenge bei  hohen Konzentrationen von EDTA stark abnimmt, um dann wieder anzusteigen, wenn man  die Menge von EDTA reduziert. Im Gegensatz dazu scheint MgCl2 eher einen inhibitorischen  als  einen  aktivierenden  Einfluss  auf  die  Spaltung  auszuüben,  wie  die  letzten  4  Lanes  anzeigen. 

 

1  2  3  4  5 6 7 8 9 10 11 

 

Kontrolle 0 h  Kontrolle 20 h  46 (10 µM)  20 h  46 (10 µM)  EDTA (10 mM) 20 h  46 (10 µM)  EDTA (5 mM) 20 h  46 (10 µM)  EDTA (2 mM) 20 h  46 (10 µM)  EDTA (1 mM) 20 h  46 (10 µM)  MgCl2 (10 mM) 20 h  46 (10 µM)  MgCl2 (5 mM) 20 h  46 (10 µM)  MgCl2 (2 mM) 20 h  46 (10 µM)  MgCl2 (1 mM) 20 h 

Abbildung 7‐83: Agarose‐Gel von pUC19‐Plasmid‐DNA, die unter Zusatz verschiedener Konzentrationen von  EDTA bzw. MgCl₂ mit 46 inkubiert wurde. Oben im Bild: open‐circle‐DNA (Form II), unten supercoiled‐DNA  (Form I). 

   

Im  Falle  von  EDTA  ‐welches  bei  10  mM  im  tausendfachen  Überschuss  bezüglich  46  vorhanden ist‐ wäre die Verminderung dadurch zu erklären, dass der Chelator als negativ  geladenes  Molekül  mit  positiven  Ladungen  wechselwirken  kann,  wie  sie  eben  in  46  vorhanden sind. Damit würde die Attraktion zwischen 46 und der Plasmid‐DNA stark gestört,  was zur Abnahme der Spaltmenge führt. 

Solch eine elektrostatische Wechselwirkung ist eben auch bei Zugabe von MgCl2 möglich, da  das Mg als Dikation ‐welches ebenso im hohen Überschuss vorliegt‐ mit den Phosphaten der  DNA  interagiert  und  die  Ladungen  dort  neutralisiert.  Dies  führt  dann  dazu,  dass  der  Polyamid‐Teil nicht mehr oder nur begrenzt an die DNA binden kann. 

 

Dieses Experiment wurde dann zur Bestätigung der Daten  nochmals durchgeführt. Die  Analytik in Abbildung 7‐84 sieht der aus dem vorangegangenen Experiment recht ähnlich. 

 

1  2  3  4 5 6 7 8 9 10  11 

 

Kontrolle 0 h  Kontrolle 20 h  46 (10 µM)  20 h  46 (10 µM)  EDTA (10 mM), 20 h  46 (10 µM)  EDTA (5mM), 20 h  46 (10 µM)  EDTA (2 mM), 20 h  46 (10 µM)  EDTA (1 mM), 20 h  46 (10 µM)  MgCl2 (10 mM), 20 h  46 (10 µM)  MgCl2 (5 mM), 20 h  46 (10 µM)  MgCl2 (2 mM), 20 h  46 (10 µM)  MgCl2 (1 mM), 20 h 

Abbildung 7‐84: Agarose‐Gel von pUC19‐Plasmid‐DNA, die unter Zusatz verschiedener Konzentrationen von  EDTA bzw. MgCl2 mit 46 inkubiert wurde. Oben im Bild: open‐circle‐DNA (Form II), unten supercoiled‐DNA  (Form I). 

 

Wieder kann man bei zunehmender Konzentration von EDTA einen Abfall in der Aktivität von  46  beobachten,  während die  Menge  der  open‐circle‐DNA  bei  Anwesenheit  von MgCl2  beträchtlich unterdrückt wird. 

Eine  zweite  Reproduktion ist in  Abbildung  7‐85  gezeigt, und  bestätigt  bei qualitativer  Betrachtung die bisherigen Erkenntnisse. 

 

   

170  7. IN VITRO‐EXPERIMENTE MIT DNA

1  2  3  4  5 6 7 8 9 10 11 

 

Kontrolle 0 h  Kontrolle 20 h  46 (10 µM)  20 h  46 (10 µM)  EDTA (10 mM), 20 h  46 (10 µM)  EDTA (5mM), 20 h  46 (10 µM)  EDTA (2 mM), 20 h  46 (10 µM)  EDTA (1 mM), 20 h  46 (10 µM)  MgCl2 (10 mM), 20 h  46 (10 µM)  MgCl2 (5 mM), 20 h  46 (10 µM)  MgCl2 (2 mM), 20 h  46 (10 µM)  MgCl2 (1 mM), 20 h 

Abbildung 7‐85: Agarose‐Gel von pUC19‐Plasmid‐DNA, die unter Zusatz verschiedener Konzentrationen von  EDTA bzw. MgCl2 mit 46 inkubiert wurde. Oben im Bild: open‐circle‐DNA (Form II), unten supercoiled‐DNA  (Form I). 

 

Zusammenfassend  sind  in  Tabelle  7‐29  zunächst  alle  Daten  für  die  Experimente  in  Anwesenheit von EDTA aufgeführt: 

 

Tabelle 7‐29: Übersicht über die experimentell ermittelten Spaltmengen für die Inkubation mit EDTA, die  errechneten Mittelwerte (∅) und die dazugehörigen Standardabweichungen (σ). 

EDTA [mM] Exp. 1 [%]  Exp. 2 [%] Exp. 3 [%] ∅ [%] σ [%] 

0  43.3  35.9 37.5 38.9 3.2 

1  34.2  33.8 35.1 34.4 0.5 

2  44.5  30.5 31.8 35.6 6.3 

5  25.0  22.2 24.7 24.0 1.3 

10  19.0  15.4 22.5 19.0 2.9 

 

In  der  Spalte,  die  die  Mittelwerte  enthält,  kann  man  sehr  schön  den  Einfluss  des  zugegebenen EDTAs erkennen, denn die gebildete Menge von open‐circle‐DNA verringert  sich immer weiter mit zunehmender EDTA‐Konzentration. Bei 10 mM EDTA erreicht die  Menge der Form II‐DNA mit 19.0 % gerade noch die Hälfte des Wertes, der bei Abwesenheit  von EDTA erreicht wird. Gerade bei größeren Konzentrationen von EDTA ist eine erhöhte  Wahrscheinlichkeit  gegeben,  dass  46  mit  EDTA  ein  Ionenpaar  bildet,  und  so  der  Spaltreaktion entzogen wird. 

 

Interessant ist hierzu auch die Abbildung 7‐86, die nochmals den Trend des EDTA‐Einflusses  grafisch veranschaulicht: 

   

 

Abbildung 7‐86: Grafische Darstellung des Mittelwertes und der Standardabweichung von 10 µM 46 mit  pUC19‐Plasmid‐DNA. Die Graphen weisen bis auf einen Ausreißer eine gute Konsistenz auf, und beschreiben  eine Abnahme der Spaltmenge mit zunehmender Konzentration von EDTA. 

 

Eine äquivalente Übersicht für die MgCl2‐abhängigen Daten findet sich in Tabelle 7‐30: 

 

Tabelle 7‐30: Übersicht über die experimentell ermittelten Spaltmengen für die Inkubation mit MgCl2, die  errechneten Mittelwerte (∅) und die dazugehörigen Standardabweichungen (σ).  Menge der open‐circle‐DNA mit 10.3 % nur noch etwa ein Viertel des Wertes, bei dem MgCl2  abwesend ist. Betrachtet man dazu die Darstellung in Abbildung 7‐87, so verdeutlicht die  Grafik nochmals eindrucksvoll den allgemeinen Trend der Bildung von open‐circle‐DNA bei  steigender MgCl2‐Konzentration. 

 

172  7. IN VITRO‐EXPERIMENTE MIT DNA

 

Abbildung 7‐87: Grafische Darstellung des Mittelwertes und der Standardabweichung von 10 µM 46 mit  pUC19‐Plasmid‐DNA. Die Graphen weisen bis auf einen Ausreißer eine gute Konsistenz auf, und beschreiben  eine starke Abnahme der Spaltmenge schon bei kleinen MgCl2‐Konzentrationen. 

 

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sowohl EDTA als auch MgCl2 ‐mit unterschiedlicher  Stärke‐  die  Bildung  von  open‐circle‐DNA  vermindern,  wobei  die  Substanzen  jeweils  unterschiedlich mit DNA bzw. 46 interagieren, weil sie verschiedene Ladungen aufweisen. 

Es ist anzunehmen, dass MgCl2 schon bei relativ geringen Konzentrationen die negativen  Ladungen des Phosphat‐Rückgrats neutralisiert, und somit die elektrostatische Attraktion  von 46 an DNA zumindest teilweise unterbindet. 

 

Anders bei EDTA, denn dieses Molekül ist im Gegensatz zu den positiven Mg²⁺‐Ionen negativ  geladen, und wird daher mit der ebenfalls negativ geladenen DNA kein Ionenpaar bilden. Es  ist daher anzunehmen, dass dies eher mit 46 geschieht, und die Menge von Form II‐DNA auf  diese Weise reduziert wird. 

Zusätzlich kann man sagen, dass die beobachtete Spaltung nicht durch eingeschleppte,  hydrolytisch spaltende Metall‐Kontaminationen verursacht sein kann, da EDTA diese Ionen,  wenn vorhanden, komplexiert und so der Reaktion entzieht. 

Im Dokument Sequenzselektive, metallfreie DNA-Spalter auf der Basis von Bisguanidiniumalkoholen (Seite 178-185)