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4.   M OLEKULARE  E RKENNUNG IN DER KLEINEN  F URCHE

4.1  Hintergründe und Evolution

 

Für kleine Moleküle sind verschiedene Möglichkeiten der DNA‐Erkennung bekannt[49]

• Interkalation zwischen Nukleobasen‐Paaren 

• Bildung von Tripel‐Helices in der großen Furche 

• sogenannte Zinkfinger‐Proteine, die ebenso in der großen Furche binden 

• Bildung von Komplexen in der kleinen Furche mit kleinen Molekülen wie Netropsin  und Distamycin (gilt nur für die B‐Form der DNA) 

 

Hier  soll  nur  das  letzte  Gebiet  näher  beleuchtet  werden,  auf  dem  vor  allem  in  der  Arbeitsgruppe von Peter B. Dervan intensiv geforscht wird.  

   

4.1 Hintergründe und Evolution   

Schon vor längerer Zeit hat man bei Naturstoffen wie Netropsin 41 und Distamycin 42 eine  besondere Präferenz für A,T‐reiche DNA‐Sequenzen festgestellt. Besonders interessant sind  die  beiden  Moleküle,  und  vor  allem  Distamycin,  weil  sie  u.  a.  durch  Transkriptions‐

Inhibierung vielfältige Wirkungen entfalten: sie wirken gegen Bakterien, Malaria, Pilze und  Viren, wobei sie leider durch ihre hohe Toxizität nur von beschränktem Nutzen sind. 

 

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Abbildung 4‐1: Die Naturstoffe Netropsin 41 und Distamycin 42 sind die Basis der Arbeiten von P. B. Dervan zur  Darstellung sequenzselektiver Polyamide. 

   

28 4. MOLEKULARE ERKENNUNG IN DER KLEINEN FURCHE

Das erste Molekül,  welches detailliert charakterisiert  wurde, war das  Netropsin. NMR‐

Experimente  zeigten  direkte  Wechselwirkungen  zwischen  Protonen  auf  der  konkaven  Molekülseite mit den Adenosin‐Bausteinen der DNA[50,51]

 

 

Abbildung 4‐2: Schematische Darstellung des Komplexes von Netropsin mit der DNA‐Sequenz AATT. Die Kreise  mit  den  Punkten  repräsentieren  freie  Elektronenpaare  am  N3  der Purine  und am  O2 der  Pyrimidine  (entnommen aus [51]). 

 

Diese Erkenntnis wurde durch eine Kristallstruktur von Netropsin mit einem Tetramer der  Sequenz AATT bestätigt[52]

Das Distamycin stellt eine homologe Verbindung zu Netropsin dar. Der Unterschied liegt in  der Anwesenheit eines dritten Pyrrol‐Ringes und der Abwesenheit einer zweiten Amidin‐

Funktionalität. Die Bindungsaffinität ist jedoch annähernd dieselbe. Auch für das Distamycin  hat man eine Röntgenstruktur aufklären können[53]

Man  hat  Untersuchungen  an  Distamycin  durchgeführt,  welche zu einem  Komplex von  Distamycin mit einem DNA‐Duplex führten, der die Tetramer‐Sequenz AATT enthält[54,55].  Man variierte dann die DNA‐Sequenz und erhielt ein erstaunliches Ergebnis: Mit dem Penta‐

mer AAATT bildete Distamycin einen 2:1‐Komplex. Dies wurde dann von D. E. Wemmer  durch NOE‐NMR‐Experimente weiter untersucht. Man kam zu der Erkenntnis, dass sich bei  kleinen Konzentrationen 1:1‐Komplexe bilden, sich aber bei höheren Konzentrationen 2:1‐

Komplexe bilden, bei denen zwei Distamycin‐Moleküle antiparallel nebeneinander in der  kleinen Furche gebunden sind[56], was zu einer Aufweitung der kleinen Furche um 3,5 bis 4 Å  führt[57]

Bei Studien an der Sequenz ATATA fand man heraus, dass sich 2:1‐Komplexe schon bei  kleinen Konzentrationen von Distamycin bilden. Man schätzte, dass die Bindungskonstante  des zweiten Distamycins etwa 100fach höher liegen musste als die des ersten. Die Sequenz  AAAAA bildete erst 2:1‐Komplexe, nachdem jede Helix einfach mit Distamycin komplexiert  war[58]

 

Abbildung 4‐3: 1:1‐Komplex von Distamycin und DNA (links) und zum Vergleich der 2:1‐Komplex (rechts). 

Man erkennt rechts deutlich eine Aufweitung der kleinen Furche (entnommen aus [57]). 

 

Mit  Netropsin  beobachtete  man  keine  2:1‐Komplexe,  was  durch  die  beiden  positiv  geladenen Enden des Moleküls erklärt wird: befänden sich 2 Netropsin‐Moleküle in der  kleinen Furche, wären die positiven Ladungen  sowohl bei paralleler  als  auch bei anti‐

paralleler Orientierung benachbart, was zu elektrostatischer Abstoßung führt. 

 

 

Abbildung 4‐4: Distamycin‐Derivat mit Imidazol‐Einheiten gebunden an das Pentamer TGTCA. 

 

Mit diesen Erkenntnissen kam natürlich die Frage auf, wie man die Sequenzerkennung auf  die anderen Nukleobasen ausweiten könnte. Die Gruppen von Dickerson[59] und Lown[60] 

schlugen vor, Pyrrol‐Einheiten (Py) durch Imidazol‐Einheiten (Im) zu ersetzen, um auch an C‐

G‐Paare binden zu können[61]

30 4. MOLEKULARE ERKENNUNG IN DER KLEINEN FURCHE

Die Gruppe von P. B. Dervan führte Affinitätsspaltungs‐ und Footprinting‐Experimente mit  Distamycin‐Derivaten durch[51]  um so  die  Affinitäten  der  Verbindungen  zu  bestimmen. 

Weitere Studien führten zu dem Ergebnis, dass man mit dem Py/Im‐Paar C‐G, mit dem  Im/Py‐Paar G‐C erkennen kann. 

Um nun eine DNA wirklich sequenzspezifisch auslesen zu können, musste man noch A‐T von  T‐A unterscheiden können. Wieder war es die Gruppe von Dervan, die Modifikationen an  den Heterozyklen vornahm und letztendlich Hydroxypyrrol einsetzte, um in Kombination mit  Pyrrol A‐T von T‐A unterscheiden zu können[62,63]

Mit diesen Heterozyklen hat man nun ein Repertoire, mit dem man Polyamide so herstellen  kann, dass sie an vorgegebene DNA‐Sequenzen binden. Die Affinität und Spezifität ist hierbei  mit DNA‐bindenden Proteinen vergleichbar[64]

 

 

Abbildung 4‐5: Links ein Polyamid, welches jede der 4 möglichen Basenpaare erkennen kann (Donor‐Akzeptor‐

Wechselwirkungen sind gestrichelt eingezeichnet); rechts sind freie Elektronenpaare und Wasserstoffbrücken‐

Donoren der einzelnen Nukleobasen gezeigt (entnommen aus [63]). 

 

Zusammengefasst hat man die folgenden Korrelationen herausgefunden: 

 

Tabelle 4‐1: Übersicht über die jeweiligen Heterozyklen‐Paare und deren Bindungspräferenz (+ = begünstigt, ‐ =  ungünstig) 

  G‐C  C‐G  T‐A  A‐T 

Im/Py  +

Py/Im  +

Hp/Py  +

Py/Hp  +

   

Aus der Erkenntnis, dass distamycinartige Amide 2:1‐Komplexe mit DNA‐Duplexen bilden,  entstand die Idee, 2 Moleküle aneinander zu kuppeln. Dervan´s Gruppe hat diese Arbeiten  erfolgreich durchgeführt[65,66] und verwendet nun GABA‐Linker, um die Amid‐Stränge zum  Polyamid zu verbinden, weil der GABA‐Linker für die Bildung einer Hairpin‐Struktur in der  minor  groove  die  optimale  Länge  aufweist.  Diese  Modifikation  hat  zu  einer  weiteren  Erhöhung der Affinität um ca. das 100fache geführt. 

 

 

Abbildung 4‐6: Im‐Py‐Py‐γ‐Py‐Py‐Py‐β‐Dp‐Polyamid, welches an die Sequenz 5´‐TGTTA‐3´ bindet. 

 

Ein  Nebeneffekt dieses GABA‐Linkers  ist die  Selektivität für A/T‐Basenpaare, die durch  sterische Repulsion mit der exozyklischen Amino‐Funktion von Guanin erklärt wird[67]

Solche Hairpin‐Polyamide haben genauso wie zwei einzelne antiparallel gebundene Ver‐

bindungen eine N→C‐ Orientierung in Bezug auf die 5´→3´‐Richtung der DNA. 

Diese Chemie wurde immer weiter entwickelt; so hat die Gruppe um P. Dervan etwa den  GABA‐Linker mit einer zweiten Amino‐Funktion versehen, um noch andere Moleküle – wie  etwa ein zweites Hairpin‐Polyamid ‐ daran zu kuppeln. Daneben erhöht diese Amino‐Gruppe  die  Affinität  des  Polyamids  zur  DNA  und  gleichzeitig  verhindert  sie  durch  sterische  Wechselwirkung eine falsche Orientierung in der minor groove, die bei einigen Molekülen  beobachtet wurde[68,69]

Um diese Chemie auch  für biologische Anwendungen attraktiv  zu  gestalten, muss  die  Bindungsstelle möglichst selten in der DNA vorkommen. Sie sollte daher nicht zu kurz sein. 

Das von Dervan verwendete Standard‐Polyamid bindet mit den Beiträgen von GABA und β‐

Alanin aber nur  an 6 Basenpaare. Die  Erweiterung  auf längere  Bindungssequenzen ist  zunächst durch Verlängerung der Polyamid‐Kette erforscht worden. So sind viele Distamycin‐

Derivate hergestellt worden, die 4, 5 oder gar 6 Pyrrol‐Einheiten enthielten. Man erkannte  dabei, dass die Moleküle mit 4 oder 5 Pyrrol‐Einheiten besser, die mit 6 Pyrrolen jedoch 

32 4. MOLEKULARE ERKENNUNG IN DER KLEINEN FURCHE

schlechter an DNA binden. Die Ursache hierfür ist in der Krümmung des Polyamids zu  suchen, welche ab 6 Pyrrol‐Einheiten nicht mehr mit der Krümmung der DNA in der kleinen  Furche überein stimmt, was zu einer niedrigeren Affinität führt[70]

Man hat dann einige Pyrrol‐Einheiten durch das flexible  β‐Alanin ersetzt und so 16 Basen‐

paare adressieren können[71]. Ein anderer Ansatz ist die Verbindung von 2 Hairpin‐Poly‐

amiden, womit die Erkennung auf 10 Basenpaare ausgeweitet werden konnte[72,73,74]

Diese und weitere Versuche[75] zur Steigerung der Affinität bzw. der Länge der Bindungs‐

sequenz sind in Abbildung 4‐7 in der von Dervan gebräuchlichen Kurzdarstellung aufgelistet. 

c) Hairpin mit β‐Ala  d) U‐Pin

 

 

4.0*109  4.4*108

 

e) H‐pin  f) Homodimer

4.3*1010  1.4*1010  

 

g) Tandem‐Hairpin: turn‐to‐turn  h) Tandem‐Hairpin: turn‐to‐tail

7.5*1010  3.2*1010  

Abbildung 4‐7: Die verschiedenen Polyamid‐Strukturen im Überblick: die schwarzen Kreise stehen für Imidazol,  weiße Kreise für Pyrrol, Rauten für β‐Alanin, gebogene Linien bedeuten Linker (im Fall von d und e) über die  Ring‐Stickstoffe verbrückt. Die Zahlen unter den Abbildungen sind die Ka in M‐1Abbildungen und Werte  entnommen aus [63]. 

 

Über dieses systematische Vorgehen[76] unter Einbeziehung von strukturbasiertem Liganden‐

design ist es Dervan gelungen, die bisher vielversprechendste Methode zu entwickeln, um  doppelsträngige DNA sequenzspezifisch auszulesen. 

   

4.2 Weiterführende Experimente   

Das  eigentliche  Ziel  von  P.  Dervan  ist  die  Manipulation  der  Gen‐Expression  unter  Zuhilfenahme der Polyamide. Dabei sind sowohl die Unterdrückung als auch die Verstärkung  der Transkription von Interesse. Die Polyamide sind auch von anderen Arbeitsgruppen aufge‐

griffen und für die eigenen Zwecke geeignet derivatisiert worden. 

 

 

Abbildung 4‐8: Einflussnahme auf die Gen‐Expression: speziell designte Polyamide können die Transkription  sowohl verhindern als auch verstärken. Beim oberen Pfeil werden natürliche Aktivatoren und TFs durch  Polyamide verdrängt bzw. blockiert. Beim unteren Pfeil werden natürliche Aktivatoren durch künstliche  Polyamid‐TFs ersetzt (entnommen aus [63]). 

 

Die vielfältigen Einsatzgebiete sollen hier (in einer nicht vollständigen Übersicht) kurz darge‐

stellt  werden.  Eine  vollständigere  Übersicht  ist  in  einem  Review  von  P.  Dervan  zu  finden[77,78]

   

4.2.1 Unterdrückung der Gen‐Expression   

DNA‐bindende  Proteine  sind  oft  an  der  Regulation  der  Transkription  beteiligt.  Solche  Proteine  werden  Transkriptionsfaktoren  (TF)  genannt  und  sind  lohnende  Ziele  der  Manipulation, weil es wesentlich weniger onkogene Transkriptionsfaktoren als onkogene  Signaling‐Proteine gibt.