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Experimente zur Orientierung des Polyamids im Komplex mit DNA

7.   IN VITRO ‐E XPERIMENTE MIT  DNA

7.2  Experimente zur Orientierung des Polyamids im Komplex mit DNA

 

Zur Überprüfung der Orientierung des Hairpin‐Polyamids in der minor groove sollte eine  Fluoreszenz‐Titration  durchgeführt  werden,  wobei  ausgenutzt  wird,  dass  DABCYL  mit  Fluorescein  ein  Quench‐Paar  bildet.  Dazu  wurde  das  DABCYL‐markierte  Molekül  141  hergestellt, und ein DNA‐Duplex am 5´‐Ende mit Fcn markiert. 

 

Die beiden DNA‐Stränge wurden so gewählt, dass sie jeweils eine Länge von 25 Basen haben  und dabei keinerlei Selbstkomplementarität besitzen[VII]

 

Tabelle 7‐1: Physikalische Eigenschaften und Sequenzen der verwendeten DNA‐Stränge 

  Sequenz  Gegenion MW [g/mol]  Tm [°C]

DNA 1  5´‐Fcn‐TTGGC‐CGCAG‐TGTTA‐TCGCT‐CATGG‐3´ Na+ 8217  61

DNA 2  5´‐Cy5‐CCATG‐AGCGA‐TAACA‐CTGCG‐GCCAA‐3´ Na+ 8179  61

 

Der zweite Strang ist mit Cy5 markiert, um in späteren Experimenten zur DNA‐Spaltung die  entstehenden Fragmente auch sequenzieren zu können. 

 

Die  beiden  einzelnen  Stränge  werden  kurz  vor  dem  Einsatz  in  den  entsprechenden  Experimenten hybridisiert und ergeben dabei folgenden Duplex: 

 

5´‐Fcn‐TTGGC‐CGCAG‐TGTTA‐TCGCT‐CATGG‐3´ 

    3´‐AACCG‐GCGTC‐ACAAT‐AGCGA‐GTACC‐Cy5‐5´ 

146 

Abbildung 7‐9: Der für die Bindungs‐ und Spaltexperimente verwendete DNA‐Duplex. Die Bindesequenz des  Polyamides ist rot markiert.  angefärbte  Gel  in  Abbildung 7‐10  zeigt  das  Ergebnis  dieser Untersuchung, wobei  kein  signifikanter Lauf‐Unterschied zwischen dem DNA‐Duplex in Lane 3 und DNA‐Duplex plus  141 in Lane 4 zu sehen ist. 

Die Bindung ist somit durch Gelelektrophorese nicht eindeutig nachzuweisen. 

VII geprüft in silico mit RNAstructure; http://rna.chem.rochester.edu/ 

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Lanes 

1  2  3  4 

 

DNA 1  DNA 2  146  146 + 141 

Abbildung 7‐10: Gel‐Elektrophorese von DNA 146 und 141 unter nativen Bedingungen, um eine Bindung des  Polyamids an die DNA per Band‐Shift nachzuweisen. Es ist jedoch kein signifikanter Shift zu erkennen, und  daher ist durch dieses Experiment eine Bindung nicht eindeutig nachweisbar. Die Banden wurden durch Silber‐

Färbung sichtbar gemacht. 

 

Um doch noch einen Hinweis auf die bindenden Eigenschaften von 141 zu erhalten, sollte  eine Mischung aus der Duplex‐DNA und dem Polyamid 141 massenspektrometrisch per  LILBID untersucht werden. 

 

Dabei wurde die DNA 146 jeweils mit 0.25, 0.5, 0.75, 1 oder 2 eq. 141 gemischt und  anschließend untersucht. Die Abbildung 7‐11 zeigt ab einer Menge von 0.75 eq. 141 die  stetige Zunahme eines Peaks bei m/z ~ 17500, welcher für den Komplexes aus dem Duplex  146 und einem Molekül 141 steht (in der Abbildung markiert durch einen roten Balken). Im  selben Maße wird der Peak für den freien Duplex 146 bei m/z ~ 16000 (symbolisiert durch  einen grünen Balken) immer kleiner. Die beiden Balken (rot und grün) zwischen m/z 7500  und 10000 stehen dabei für die doppelt geladenen Moleküle. 

 

Der Nachweis des Komplexes von 146 und 141 ist die notwendige Voraussetzung für das  folgende Experiment zur Bestimmung der Orientierung von 141 in der minor groove. 

   

 

Abbildung 7‐11: LILBID‐MS‐Analyse einer Mischung des DNA‐Duplexes 146 und 141. Die Menge der DNA ist in  allen 5 Experimenten gleich; die rote Zahl rechts gibt jeweils die Äquivalente von 141 an. Man kann hier einen  das Entstehen eines Peaks bei etwa 17.5k (roter Balken, DNA‐Duplex plus 141) und die Abnahme des Peaks bei  etwa 16k (grüner Balken, DNA‐Duplex) beobachten. 

 

Um zunächst auszuschließen, dass frei diffundierendes 141 einen Quench‐Effekt ausübt,  wurde die erste Titration ohne DNA und nur gegen Fcn durchgeführt. 

Wie man nun aus der Grafik in Abbildung 7‐12 entnehmen kann, übt freies 141 keinen  Quench‐Effekt aus, denn die Fluoreszenz bleibt über die gesamte Titration konstant. 

   

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Abbildung 7‐12: Kontroll‐Titration von 141 gegen Fluorescein (20 nM) zum Ausschluss eines Quench‐Effektes  von nicht an DNA‐komplexiertem Polyamid. 

 

Die Abbildung 7‐13 zeigt 2 Titrationen, in deren Verlauf die Fluoreszenz mit zunehmender  Konzentration von 141 immer weiter abnimmt. Es ließ sich hier also ein Quench‐Effekt  nachweisen. Die Kurven sinken allerdings bis unter einen Wert als 0.5 ab, was für un‐

spezifische Bindungen an die DNA ab einer bestimmten Konzentration von 141 spricht. 

Aus diesen Daten kann gefolgert werden, dass das Polyamid 141 in N→C‐Richtung an die  Sequenz 5´‐TGTTA‐3´ bindet. 

 

 

Abbildung 7‐13: Fluoreszenz‐Titration von 141 und dem Fluorescein‐markierten DNA‐Duplex (100 nM). Die y‐

Achse wurde zur einfacheren Darstellung auf 1 normiert.   

0 5000 10000 15000 20000

Fluoreszenz

0 5000 10000 15000 20000

Fluoreszenz

c(Polyamid) [nM]

7.3 Experimente zur DNA‐Spaltung   

Ein geeignetes Modell‐System für den Nachweis der DNA‐Spaltung und zur Bestimmung der  Reaktivität ist die Umwandlung von supercoiled Plasmid‐DNA (Form I) in die nicked‐ bzw. 

open‐circle‐Form (Form II), oder sogar in die linearisierte DNA (Form III).  

Diese „superspiralisierten“ Plasmide weisen durch ihre – verglichen mit normaler, offen‐

kettiger B‐Form‐DNA – unübliche DNA‐Konformation eine höhere Reaktivität bezüglich der  Phosphodiester auf, als normale B‐Form DNA sie besitzt. Durch Spaltung von einem der  beiden DNA‐Stränge kann sich die DNA entwinden und so die zuvor vorhandene Spannung  vermindern. Diese Entspannung führt zu einem anderen DNA‐Konformer (hier Form II), das  eindeutig durch Agarose‐Gel‐Elektrophorese von der Form I unterschieden werden kann.  

 

Für ein typisches Experiment wird eine Mischung aus dem pUC19‐Plasmid (einem high‐copy‐

number Plasmid) und dem jeweiligen Spaltreagenz bei vorher definierten Parametern wie  pH,  Puffer,  Temperatur  und  Zeit  inkubiert,  und  die  Reaktion  anschließend  gelelektro‐

phoretisch analysiert. Die Gele lassen sich danach photographisch mit einer geeigneten  Software auswerten, und die Spalteffizienz quantifizieren (es soll hier erwähnt werden, dass  Form II und Form III stets addiert wurden, um die Gesamt‐Spaltung zu bestimmen).  

Dieses System ist literaturbekannt und kam auch in Vorgängerarbeiten schon zum Einsatz. Es  soll aus den genannten Gründen beibehalten werden. 

 

Eine  Erweiterung  der  Spalt‐Experimente  stellt  die  Verwendung  von  normaler,  linearer  Duplex‐DNA dar, die statt Plasmid‐DNA mit den Spalt‐Reagenzien inkubiert wird. In den  Vorgängerarbeiten konnte solch ein Doppelstrang bislang noch nicht gespalten werden, bzw. 

wurde noch nicht als Substrat eingesetzt. 

 

Es  soll  an  dieser  Stelle  darauf  hingewiesen  sein,  dass  die  Ergebnisse  aus  den  hier  vorgestellten Experimenten letztlich zu einer Schlussfolgerung bezüglich der Reaktivität der  Verbindungen  führen,  und  ob  oder  wie  die  eine  oder  andere  Verbindung  in  Zukunft  weiterentwickelt werden soll. Um darüber eine Aussage treffen zu können, muss man die  vorhandenen  Daten  sehr  kritisch,  sorgfältig  und  vorsichtig  betrachten,  da  diese  Versuchsreihen wesentlich fehleranfälliger und schwieriger in der Reproduktion (verglichen  z.B. mit NMR) sind.  Um  dem Leser  ein  Maximum  an Transparenz  zu  bieten,  wie  die  jeweiligen  Schlussfolgerungen  entstanden  sind,  wurde  für  die  nächsten  Seiten  eine  ungewöhnliche  Darstellung  der  Daten  gewählt,  bei  der  sowohl  alle  Gel‐Bilder  und  verschiedene graphische Darstellungen zu sehen sind, die die Ergebnisse nicht auf einen  einzigen Zahlenwert reduzieren.