Labordiagnostische Verfahren

Für die diagnostische Absicherung einer LI-Infektion stehen verschiedene Möglichkeiten zur Verfügung. Derzeit kommen Antikörpernachweis im Serum, PCR in Kot und Gewebe und immunhistologische Untersuchungen in Gewebsschnitten zum Einsatz (Tab. 3).

Die verschiedenen Tests können unterschiedliche epidemiologische Aspekte klären.

Ein serologisch positiver Befund zeigt einen vorangegangenen Kontakt mit LI an, während Nachweise wie PCR oder Immunhistochemie eine derzeitig bestehende Infektion belegen (GUEDES 2004).

2.4.3.1 Indirect Immunofluorescent Antibody Test (IFAT) und Immunperoxidase Monolayer Assay (IPMA)

Der erste serologische Test zum Nachweis von LI war ein indirekter Immunfluoreszenztest (immunofluorescence antibody test (IFAT)) (LAWSON et al.

1988). Dieser dient dem Nachweis von IgM- und IgG-Antikörpern. In verschiedenen Experimenten zeigte sich beim Nachweis einer Infektion eine höhere Sensitivität (90 %) und Spezifität (96 %) im Vergleich zur PCR. Maternale Antikörper konnten in diesen Experimenten für eine Dauer von bis zu 6 Wochen nachgewiesen werden

Literaturübersicht

(BAKKER et al. 2000; DÜNSER et al. 2000; FOURCHON et al. 2000; MORTIMER et al. 2000; JUST et al. 2001; GUEDES et al. 2002b).

Die Sensitivität und Spezifität wurden für den IPMA mit 89 % und 100 % angegeben (KNITTEL et al. 1998; GUEDES et al. 2002a).

Der IFAT reagierte nicht bei Tests mit Seren von Schweinen, die mit Brachyspira (B.) pilosicoli, B. innocens, B. hyodysenteriae, Salmonella (S.) Typhimurium, S.

cholerasuis, Campylobacter (C.) mucosalis, und C. hyointestinalis infiziert waren.

Ebenso zeigte auch der IPMA keine Kreuzreaktionen in Tests mit B. pilosicoli, B.

hyodysenteriae, Escherichia coli (K88), C. mucosalis, C. jejuni, und C. coli (KNITTEL et al. 1998; GUEDES et al. 2002a).

2.4.3.2 Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Verschiedene ELISAs wurden untersucht und validiert. Ein Ganzzell-ELISA gewährleistet eine Sensitivität von 98 % und eine Spezifität von 99,3 % (BOESEN et al. 2005b). Als Antigen wurde LI, ID # 15540 (Boehringer Ingelheim) verwendet BOESEN et al. 2005b). KROLL et al. (2005a) entwickelten einen LPS-ELISA dieser zeigte in einer Infektionsstudie eine hohe Spezifität von 100% und eine Sensitivität von 99,5%. Das Antigen für diesen ELISA wurde ebenfalls aus einer Kultur von ID # 15540 aufgereinigt. Desweiteren existiert ein Blocking-ELISA welcher eine Sensitivität und Spezifität von 96,46 % resp. 98,68 % gewährleistet (KELLER et al.

2006). Seit 2006 ist der Blocking-ELISA unter der Bezeichnung Enterisol®Ileitis-ELISA (bioScreen, Münster/Svanova Biotech AB, Uppsala, Schweden) kommerziell erhältlich. Mit diesem Testkit kann der LI-Antikörpertiter sowohl im Serum als auch im Plasma bestimmt werden (KELLER et al. 2006).

2.4.3.3 Polymerase Chain Reaction (PCR)

Die Spezifität der PCR zum Nachweis von LI in Kotproben liegt bei nahezu 100 % (JONES et al. 1993c). Die Sensitivität dieser Technik liegt zwischen 39 und 72 % bei experimentell infizierten Tieren (KNITTEL et al. 1998; GUEDES et al. 2002b). Die PCR kann verwendet werden, um Erreger ausscheidende Tiere, zu identifizieren.

Allerdings ist es nicht möglich, mit LI infizierte Tiere welche den Erreger nicht ausscheiden, zu erkennen (JORDAN et al. 1999). Für ein positives PCR-Ergebnis

Literaturübersicht

al. 1993a, b, c). Die Probennahme ist entscheidend für die PCR-Diagnose.

Kotproben von 0,1 g zeigten in einer Studie deutlich mehr positive Ergebnisse (21 %) als bei einer entsprechenden Probennahme mit Rektaltupfern (11 %) (JACOBSON et al. 2006). In experimentellen und Feldstudien wurde gezeigt, dass die Tiere 1-2 Wochen, bevor sie serokonvertierten, den Erreger ausschieden (GUEDES et al.

2002b; GUEDES u. GEBHART 2003b). Nach JENSEN et al. (2005) kann zwischen Erregerausscheidung und Serokonversion sogar ein Zeitraum von 2-6 Wochen liegen. Der Erreger wird etwa 7 Tage nach einer Erstinfektion erstmalig ausgeschieden und ab der 4. Infektionswoche findet nur noch eine intermittierende Ausscheidung statt (POHLENZ 2005). Diese intermittierende Ausscheidung bei subklinisch und chronisch infizierten Tieren kann zu falsch negativen Ergebnissen führen (KNITTEL et al. 1997; JORDAN et al.1999). Einige natürlicherweise im Kot vorkommende Substanzen können durch ihre inhibierende Wirkung auf die PCR ebenfalls zu falsch negativen Ergebnissen führen (LANTZ et al. 2000; JACOBSON et al. 2003). Eine Ausscheidung des Erregers kann auch ohne klinische oder mikroskopische Veränderungen nachgewiesen werden (KNITTEL et al. 1997;

JORDAN et al. 1999).

Im Falle einer subklinischen Lawsonien-Infektion besteht die Möglichkeit, dass eine Besiedelung des Darms stattgefunden hat, diese aber nicht umfangreich genug ist, um eine Diagnose mittels PCR oder Serologie stellen zu können (GUEDES 2004).

Mit der Multiplex-PCR können simultan neben LI noch andere Darmpathogene wie Brachyspira (B.) hyodysenteriae, B. pilosicoli und Salmonella sp. nachgewiesen werden (ELDER et al. 1997; SUH u. SONG 2005; LA et al. 2006; NATHUES 2007).

Zur schnellen Untersuchung großer Probenmengen steht eine real-time-PCR zur Verfügung. Die Nachweisgrenze dieser Methode liegt bei einer LI Zelle pro PCR tube, was einer fäkalen Ausscheidung von 4 x 10⁴ LI Zellen pro Gramm Kot entspricht (LINDECRONA et al. 2002).

2.4.3.4 Histologie

Die Anwendbarkeit der Hämatoxylin-Eosin-Färbung ist auf Fälle, die erkennbare Proliferationen zeigen, beschränkt (GUEDES et al. 2002b). Eine pathohistologische Untersuchung von Sektionsmaterial mittels Hämatoxilin-Eosin-Färbung (HE) zeigt viele falsch negative Ergebnisse (55,6 %) und eine nur mäßige Übereinstimmung mit

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PCR-Ergebnissen (53 %). Sie sollte daher nicht als alleiniges diagnostisches Mittel eingesetzt werden (HUERTA et al. 2003).

Die Warthin-Starry-Färbung (WS) ist eine nicht für LI spezifische Färbemethode. Für eine sichere Diagnose müssen hier die Erreger im apikalen Zytoplasma von proliferierten Enterozyten gefunden werden (GUEDES et al. 2002b). JENSEN et al.

(1997) halten die WS-Färbung nur für verlässlich, wenn Bakterien in eindeutig proliferierten Enterozyten gefunden werden.

Mit einer modifizierten Ziehl-Neelsen-Färbung lassen sich Lawsonien in Darmteilen als Ziehl-Neelsen-positives, gebogenes und säurefestes Stäbchen darstellen. Die Ziehl-Neelsen-Färbung erreicht im Vergleich zur PCR lediglich eine Sensitivität von 55% (DÜNSER et al. 2003). Beide Färbemethoden sind aber nicht spezifisch und erlauben keine sichere Diagnose (ROWLAND 1978)

Mit der Immunhistochemie hingegen ist es möglich, durch spezifisch bindende Antikörper Lawsonien sogar in Fällen starker Nekrosen, wenn die Mukosa vollständig zerstört ist, oder in Fällen, in welchen die Erreger nur noch im Zytoplasma mononukleärer Zellen in der Lamina propria zu finden sind, nachzuweisen (GUEDES et al. 2002b). Bereits 5 Tage nach einer Infektion kann LI mittels Immunhistochemie nachgewiesen werden (GUEDES u. GEBHART 2004).Die Immunhistochemie zeigt im Vergleich zur Warthin-Starry-Silberfärbung eine Sensitivität von 87 % (GUEDES et al. 2002b).

In einer Studie von GUEDES und GEBHART (2004) waren von LI verursachte histologische Veränderungen nur zwischen dem 11. und 29. Tag p.i. zu finden. Bei drei Tieren, die 35 Tage nach Infektion untersucht wurden, waren keine histologischen Veränderungen mehr zu finden. Ebenso ist eine IH-Untersuchung dieser Tiere zu diesem Zeitpunkt negativ verlaufen (GUEDES u. GEBHART 2004).

Entsprechende Ergebnisse lieferten JENSEN et al. (2005), in deren Studie Tiere, die noch 2-6 Wochen vor einer Sektion Erreger ausschieden, zum Zeitpunkt der Sektion keine auf LI hinweisenden pathologischen Veränderungen im Darm zeigten.

2.4.3.5 Immunomagnetic beads und ATP-Biolumineszenz

Eine weitere immunologische Methode ist die Verwendung von spezifischen

„immunomagnetic beads“ und ATP-Biolumineszenz. Hierfür werden sogenannte

„magnetic beads“ mit LI-spezifischen Antikörpern (Lsa A) beschichtet, um damit

Literaturübersicht

immunomagnetische Separation und ATP-Biolumineszenz. Diese Untersuchungen wurden am Kaninchen durchgeführt. (WATARAI et al. 2005).

Tabelle 3: Übersicht zu den diagnostischen Möglichkeiten zum Nachweis von LI und spezifischer Antikörper beim Schwein (nach KROLL et al.

2005b)

Antigen schnelle Methode für hohe Probenzahlen

Methode noch nicht etabliert

WATARAI et al.

(2005)

Literaturübersicht Legende Tabelle 3

HE = Haematoxylin-Eosin-Färbung, WS = Warthin Starry, IH/IFAT = Immunhistochemie und Immunofluorescence Antibody Test, PCR = Polymerase Chain Reaction, IPMA = Immunoperoxidase Monolayer Assay, ELISA = Enzyme Linked Immunosorbent Assay