N- Fraktion im Dünndarmsekret
3. Eigene Untersuchungen 1 Material und Methoden
3.1.6 Entnahme von Blutproben
3.1.7.2 Kotsammlung Versuchsdesign
Die Kotsammlung erfolgte aus organisatorischen Gründen in zwei Durchgängen. Das Versuchsdesign war in beiden Durchgängen identisch. Die Tiere wurden bis einschließlich des Abends vor dem Versuchsbeginn mit dem Alleinfutter zur Erhaltung (HF) gefüttert (s.
Abbildung 7). Am Morgen (7.00 Uhr) des ersten Versuchstages erhielten die Tiere dann erstmalig die N-freie Diät (s. Tabelle 17).
Tabelle 17: Übersicht über den Versuchsablauf in der Phase der Kotkollektion
1 Aus organisatorischen Gründen erfolgte keine Blutprobennahme bei den Tieren 69, 99, 106 und 108.
Tag Futter Maßnahmen Kotkollektion
bis -4 HF PL-Tiere: Kreon® -Substitution -
-3 HF ab Tag -3: Verzicht auf Kreon® bei PL-Tieren bis Tag 11 -
-2 HF -
-1 HF Wägung der Tiere; Blutprobenentnahme1 -
0-10 N-frei X
10 N-frei Wägung der Tiere; Blutprobenentnahme1 X
11 HF PL-Tiere: Kreon® -Substitution -
Eigene Untersuchungen – Material und Methoden
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Über die gesamte Dauer des Versuches wurde diese Prozedur (morgendliche und abendliche Fütterung mit der N-freien Diät) beibehalten. Die Sammlung der Faeces erfolgte mehrmals täglich über einen Zeitraum von zehn Tagen. Hierzu wurde der von den Tieren abgesetzte Kot in Plastiktüten gesammelt.
Probenaufbereitung
Nach Bestimmung der Kotmasse (Ermittlung der Masse an ursprünglicher Substanz) erfolgte die Homogenisierung der Kotprobe. Anschließend wurde eine aliquote Probe von 3-5 g aus dem homogenisierten Material entnommen, in ein Probenröhrchen überführt und direkt der Analyse zugeführt (Bestimmung der N- bzw. Rp-Konzentration im ursprünglichen Material).
Die restlichen Faeces kamen zur Asservierung und um die Gefriertrocknung zu ermöglichen über einen Zeitraum von mindestens drei Tagen in einen Gefrierraum bei -20° C. Zur weiteren Aufbereitung wurde der Kot in gefrorenem Zustand grob zerkleinert, in Plastikschälchen mit Deckeln überführt und nach Bestimmung der Einwaage über die Dauer von vier Tagen gefriergetrocknet (Vakuumgefriertrocknungsanlage Alpha 1-4, Firma Christ®, Osterode). Nach erneuter Bestimmung der Masse zur Ermittlung des Trockensubstanz-Gehaltes erfolgte anschließend eine Vermahlung der Kotproben unter Verwendung der oben genannten Messermühle zu einem homogenen Pulver.
3.1.8 Analyseverfahren
Nach den Vorschriften der VDLUFA in der Fassung von NAUMANN und BASSELER (2004) wurden in den verwendeten Futtermitteln (Erhaltungsfutter und N-freie Diät) Trockensubstanz und Rohnährstoffe (Rohfett, Rohprotein, Rohfaser, Rohasche) mittels Weender Futtermittelanalyse sowie Stärke und Zucker bestimmt (s. Übersicht 1).
Die im Chymus, Harn und Kot analysierten Parameter sind in Übersicht 2 dargestellt.
Die Analyse bezüglich Reinprotein- und Aminosäurenkonzentration erfolgte ebenfalls nach den Vorschriften der VDLUFA. Nur im frischen, d.h. nicht-konservierten Chymus fand die Bestimmung des pH-Wertes und des NH3-Gehaltes statt.
Zusätzlich wurde am dritten Tag eine Probe des nativen Chymus zur mikrobiologischen Untersuchung entnommen und an das Institut für Mikrobiologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover weitergeleitet.
Eigene Untersuchungen – Material und Methoden
Übersicht 1: Angewandte Untersuchungsverfahren mit Erläuterungen
Untersuchungsmethode Besonderheiten
Masse (uS) Wägung
Trockensubstanz (TS) Rohasche (Ra)
Rohprotein (Rp) Rohfaser (Rfa) Rohfett (Rfe)
Weender Analyse (Vorschriften der VDLUFA)
Stärke Polarimetrie (Vorschriften der VDLUFA) Zucker LUFF-SCHORL (Vorschriften der VDLUFA)
NH3 ionenselektives Messverfahren
pH Potentiometer im nativen Chymus
Dichte Masse / Volumen
mikrobiol. Unters. kulturell im nativen Chymus
Harnstoff Kolorimetrie (enzymatisch) Messung bei pH 7
Aminosäuren Ionenaustauschchromatographie
Reinprotein BARNSTEIN (Vorschriften der VDLUFA) durch Fällung Übersicht 2: Ermittelte Parametern in den Proben (Chymus, Kot und Harn)
● Futter: − TS-Gehalt ● Chymus: − uS-Masse − Ra-Gehalt − TS-Gehalt 2
− Rp-Gehalt − Rp- und Reinproteingehalt 2 − Rfa-Gehalt − NH3-Gehalt 1
− Rfe-Gehalt − AS-Gehalt 2, 4 − Stärke-Gehalt − Mikrobiologie 3 − Zucker-Gehalt − pH
● Kot u. Harn − uS-Masse ● Harn: − Harnstoffgehalt − TS-Gehalt − Dichte
− Rp-Gehalt
Kollektionsphasen der Chymussammlung: 0-4; 4-8; 8-12 h; der Harnsammlung: 12h; der Kotsammlung: 24 h
1Messung im unkonservierten Chymus vor den Intervallen 0-4; 4-8; 8-12 h
2 zur Analyse gelangte eine aliquotierte Teilprobe
3mikrobiologische Untersuchung des Chymus einmalig am 3. Tag 6-8 h postprandial
4 Aminosäuren wurden an Tag 1 und Tag 7 im Chymus bestimmt
Eigene Untersuchungen – Material und Methoden
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Trockensubstanz nach Gefriertrocknung und Weender-TS
Nach Ermittlung der Menge der ursprünglichen Substanz (unter Beachtung der Säurezugabe der Chymusproben) und einer Zwischenlagerung bei -20° C wurden die Chymus- bzw.
Kotproben in einer Vakuumgefriertrocknungsanlage (alpha 1-4, Firma Christ®, Osterode) über einen Zeitraum von drei bzw. vier Tagen bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Danach erfolgte die Auswaage der gefriergetrockneten Proben. Aus dem Verhältnis der Einwaage zur Auswaage wurde der Trockensubstanzgehalt berechnet. Nach Zerkleinerung der Proben in einer Mühle (Retsch Grindomix®, Hahn) wurde eine geringe Menge (0,6 g) in einen Tiegel eingewogen und bis zur Gewichtskonstanz über einen Zeitraum von acht Stunden bei 103° C in einem Trockenschrank nachgetrocknet. Nach erneuter Auswaage der Probe wurde anhand der Gewichtsdifferenz die Restfeuchte ermittelt und der TS-Gehalt berechnet.
Rohasche (Ra)
Zur Bestimmung des Ra-Gehaltes erfolgte eine sechsstündige Veraschung der Probe im Muffelofen bei 600° C. Anhand der Masse des verbleibenden Rückstandes konnte unter Berücksichtigung der Einwaage die Rohaschekonzentration errechnet werden.
Rohfett (Rfe)
Die Analyse der Rohfettkonzentration erfolgte nach Aufschluss der Probe mit konzentrierter Salzsäure (Kochen über einen Zeitraum von 30 Minuten). Anschließend wurde die Probe filtriert, der Filter im Trockenschrank bei 80° C getrocknet und einer sechsstündigen Fettextraktion mittels Petroläther im Soxhletapparat unterzogen. Nach Abdestillation des Petrolethers im Rotationsverdampfer [Rotavapor R-114®, Firma Büchi, Flawil (Schweiz)] bei 80° C und anschließender Trocknung des Kolbens konnte die extrahierte Fettmenge erfasst und unter Berücksichtigung der Einwaage die Rohfettkonzentration im Probenmaterial berechnet werden.
Rohprotein (Rp)
Die Bestimmung des Rp-Gehaltes (= N x 6,25) der Proben erfolgte mittels N-Bestimmung mit dem vollautomatischen Analysengerät Vario Max CNS® (Elementar Analysensysteme, Hanau). Dazu wurden ca. 250 mg Chymus, Kot oder Futter, respektive
Eigene Untersuchungen – Material und Methoden
500 mg Harn mit 200 mg Wolframoxid versetzt und dem Gerät zugeführt, welches nach dem Prinzip der katalytischen Rohrverbrennung unter Sauerstoffzufuhr und hohen Temperaturen (1140 °C) arbeitet. Stickstoff wurde an den Adsorptionssäulen von den anderen Komponenten getrennt und von einem Wärmeleitfähigkeitsdetektor bestimmt.
Rohfaser (Rfa)
Das Probenmaterial wurde nach Bestimmung der Einwaage mit 1,25-prozentiger Schwefelsäure und 1,25-prozentiger Natronlauge jeweils 30 Minuten in einem Rohfaserbestimmungsgerät [Fibertec System M1020 Hot Extraktor®, Firma Tecator, Höganäs (Schweden)] gekocht. Der Rückstand wurde über Nacht bei 103° C getrocknet und ausgewogen. Die noch aus Rohfaser und Rohasche bestehende Probe wurde anschließend in einem Muffelofen bei 550° C über einen Zeitraum von acht Stunden verascht. Die Masse der verbleibenden Probe (Rohasche) wurde nach erneuter Rückwaage von der Masse der vorigen Auswaage subtrahiert. Aus der daraus resultierenden Rohfasermenge wurde unter Einbeziehung der Einwaage die Rohfaserkonzentration berechnet.
Stärke
Die Bestimmung der Stärke erfolgte polarimetrisch nach Säurehydrolyse.
Zucker
Die Bestimmung des Gesamtzuckergehaltes erfolgte nach der Methode von LUFF-SCHOORL nach Inversion.
NH3
Die Messung der NH3-Konzentration im nativen Chymus erfolgte nach dem Prinzip der ionenselektiven Messung und wurde mittels eines digitalen mV-Meter der Firma Knick (Berlin) in Verbindung mit einer NH3-Sonde (IS 570-NH3®
, Philips, Kassel) durchgeführt.
Dabei wurden 2 g Chymus im Verhältnis 1:4 mit destilliertem Wasser versetzt, kräftig geschüttelt und bei 5000 U min-1 (g = 2803) über einen Zeitraum von 15 Minuten zentrifugiert. Drei Milliliter des Überstandes wurden in ein Glasgefäß überführt und mit 300 µl Reagenz, welches aus einmolarer NaOH und 0,1 mol/l EDTA bestand, versetzt. In
Eigene Untersuchungen – Material und Methoden
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dieses Gemisch wurde die NH3-Elektrode schwenkend eingetaucht und der Messwert nach 5 min abgelesen. Mit Hilfe einer aus vier Messpunkten bestehenden Kalibrationsgeraden (ermittelt durch eine Verdünnungsreihe von Ammoniumchlorid in destilliertem Wasser;
0,01 mol/l; 0,001 mol/l; 0,0001 mol/l; 0,00001 mol/l) konnte anhand der gemessenen Spannung die NH3-Konzentration der Probe ermittelt werden.
pH-Wert
Die Bestimmung des Wertes im unverdünnten Chymus erfolgte mit einem digitalen pH-Meter des Herstellers Mettler Toledo®, Zaventem (Belgien).
Dichte
1 ml Harn wurde in einen austarierten Tiegel pipettiert. Die ermittelte Einwaage wurde durch das Volumen dividiert.
Keimzahlen
Die Bestimmung der Gesamtkeimzahl und Keimdifferenzierung erfolgten mittels kultureller Verfahren im Institut für Mikrobiologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover.
Harnstoff (Bestimmung im Harn)
Die Analyse des Harnstoffs erfolgte enzymatisch-kolorimetrisch durch Einsatz eines kommerziellen Testsatzes (Harnstoff CT®, Hitado Diagnostic Systems, Möhnesee). Vor Analyse des mit Schwefelsäure konservierten Harns wurde der pH-Wert auf pH 7 mit einmolarer Natronlauge (NaOH) eingestellt.
Aminosäuren
Die Analyse der Aminosäuren erfolgte mittels Amino-Acid-Analyzer LC 3000® (Biotronic, Berlin) nach Hydrolyse und Oxidation nach dem Prinzip der Ionenaustauschchromatographie.
Dabei fand kein Nachweis von Tryptophan statt.
Eigene Untersuchungen – Material und Methoden
Reineiweiß
Zur Bestimmung von Reineiweiß wurde die Methode nach BARNSTEIN angewandt. Bei diesem Verfahren werden in wässriger Lösung befindliche Eiweißverbindungen mit Kupferhydroxid gefällt. Nach Trennung der leichten, löslichen Stickstoffverbindungen von den Eiweißverbindungen durch Extraktion mit heißem Wasser, werden die in Lösung gegangenen Eiweißverbindungen zur Fällung gebracht. Nach Filtration des Rückstands erfolgten die weiteren Analysenschritte nach dem Kjeldahlverfahren.
Gesamteiweiß und Harnstoff im Serum
Gesamteiweiß und Harnstoff im Serum wurden im Labor der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule mittels ABX Pentra 400® (Horiba Diagnostics, London) bestimmt.