Anzahl der verwendeten Tiere

Im Rahmen dieser Studie kam eine vergleichsweise geringe Zahl von Tieren (3-5 Tiere je Versuchsgruppe) zum Einsatz, wodurch individuelle Effekte einen vergleichsweise großen Einfluss auf die Ergebnisse haben können, was sich nicht zuletzt in der Variationsbreite zeigte. Durch die räumlichen und technischen Gegebenheiten konnte diese Studie jeweils nur mit maximal vier PL-Tieren und vier K-Tieren zur Bestimmung der prc. endogenen Anflutung (Versuch A) durchgeführt werden. Für die Bestimmung der endogenen N-Ausscheidung über den gesamten Verdauungstrakt (Versuch B) kamen allerdings jeweils fünf PL-Tiere und fünf K-Tiere zum Einsatz. Von ursprünglich fünf eingesetzten PL-Tieren verweigerten zwei Individuen (Tier 85 und 108) ab dem fünften bzw. sechsten Tag die Futteraufnahme. Bei den genannten Tieren staute sich der Chymus vor der Caecumfistel an, so dass Passagestörungen und klinisch erkennbare Abdominalschmerzen auftraten. Aus Gründen des Tierschutzes wurden die beiden Tiere folglich aus dem Versuch genommen, wodurch sich die ursprüngliche Anzahl der PL-Tiere (n=5) bei der Kotsammlung (Versuch B) leider auf drei PL-Tiere reduzierte.

4.1.6 Chymussammlung sowie die Kollektion von Harn und Kot (Versuche A, B) 4.1.6.1 Versuch zur Bestimmung der prc. endogenen N-Abgaben

- Einfluss des Kollektionszeitraums (mögliche Unterschiede zwischen Tag und Nacht)

Um Rückschlüsse auf postileale Prozesse ziehen zu können, muss die tägliche endogene N-Anflutung des tagsüber (12 h) gesammelten Chymus und der nachts (12 h) gewonnenen Digestaprobe mit der täglichen (24 h) endogenen N-Ausscheidung über den Kot verglichen werden. Um zu überprüfen, ob das Hochrechnen der prc. N-Anflutung am terminalen Ileum von 12 Stunden auf 24 Stunden gerechtfertigt ist, wurde der Chymus im Anschluss an das zwölfstündige Sammelintervall (7:00 – 19:00 Uhr) an Tag 5, einmalig im nächtlichen

Diskussion

Zeitraum über einen Zeitspanne von 12 Stunden (19:00 – 7:00 Uhr) gesammelt. Hierbei konnten im Unterschied zu FUENTE-DEGE (2003) keine Unterschiede zwischen der Anflutung der Chymusmasse (uS, TS) am Tag bzw. in der Nacht festgestellt werden.

Werden in Versuch A alle PL-Tiere einbezogen, dann ergeben sich für die Nachtstunden höhere N-Mengen als tagsüber. Wenn die Werte von zwei Ausreißern (PL-Tier 96 am Tag 5 und PL-Tier 106 in der Nacht) nicht mit gerechnet werden, unterscheidet sich die N-Menge bei den PL-Tieren tagsüber und des Nachts lediglich um 6,7 %. Aufgrund individueller Unterschiede bezüglich der Chymusmasse von PL-Tier 96 und PL-Tier 106 erscheint die Berechnung mit nur drei Tieren zulässig. Somit wäre auch die prc. N-Abgabe der PL-Tiere zwischen Tag und Nacht auf nahezu gleichem Niveau. Infolgedessen war eine Hochrechnung der prc. N-Anflutung von 12 h auf 24 h bei K- und PL-Tieren gerechtfertigt.

4.1.7 Analytik

4.1.7.1 Messung der NH₃ –Konzentration im Chymus

Im Laufen des Versuches kamen Zweifel an der Messung der NH₃-Konzentration im Chymus nach dem Prinzip der ionenselektiven Messung mit einer Membran (NH₃-Sonde) auf. Vor diesem Hintergrund wurden der Einfluss der Chymusviskosität und der Kalibrationsbereich bei der Messung der NH₃–Konzentration überprüft. Zum einen nahm die TS-Konzentration (g/kg uS) im Chymus der PL-Tiere im Unterschied zur Kontrollgruppe im zeitlichen Verlauf der Chymussammlung deutlich zu (s. Anhang 5), zum anderen waren die Chymusmassen (g TS/12h) am terminalen Ileum der PL-Tiere vier- bis fünffach höher als die der Kontrollgruppe.

Die nativen Chymusproben waren auch nach Verdünnung mit destilliertem Wasser (1:5) bei den PL-Tieren deutlich visköser als jene der K-Tiere. Zur Überprüfung des Einflusses der Chymusviskosität auf die Ergebnisse der Messung der NH3–Konzentration erfolgte in einem Versuch eine Verdünnung einzelner exemplarisch ausgewählter Chymusproben von PL-Tieren mit destilliertem Wasser, die so weit verdünnt wurden (1:5 und 1:25), dass der Chymus der PL-Tiere eine geringere Viskosität aufwies als jener der K-Tiere. Obwohl die TS-Konzentrationen im Chymus der PL-Tiere nur 2-3-fach höher waren, als die der K-Tiere, wurde keine 2-3 fach höhere Verdünnung der ersten Verdünnungsstufe (1:5) gewählt (1:10;

1:15), sondern zur Absicherung eine fünffach höhere Verdünnungsstufe (1:25).

Diskussion

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Aus beiden Verdünnungsstufen (1:5, 1:25) konnten nach Zulage identischer Mengen an Ammoniumchlorid, vergleichbare NH3–Konzentrationen im Chymus bestimmt werden.

Daher konnte ein Einfluss der höheren Chymusviskosität auf die Messung der NH3 – Konzentration an sich ausgeschlossen werden (s. Tabelle 56).

Tabelle 56: NH₃ –Konzentration (mmol/l) bei unterschiedlicher Viskosität im Chymus der PL-Tiere erzielt durch Verdünnung (1:5; 1:25) mit destilliertem Wasser

NH3 –Konzentration in mmol/l

PL-Tiere

Verdünnung 97 116

1 : 5 (2 g Chymus + 8 ml Wasser) 0,33 0,79 1 : 25 (1 ml der 1: 5 Verdünnung + 8 ml Wasser) 0,39 0,81

Die Verdünnung 1:25 wurde aus der ersten Verdünnungsstufe (1:5) gewonnen

Im ersten Durchgang zur Bestimmung der prc. endogenen N-Mengen erfolgte vor jeder NH₃ -Messreihe eine Kalibrierung des digitalen mV-Meters mittels dreier Standardlösungen (NH₄Cl: (mmol/l): 10^-2, 10^-3, 10^-4) zur Erstellung einer Kalibrationsgeraden aus diesen drei Messpunkten. Weil sich einige Werte bei den PL-Tieren außerhalb des Kalibrationsbereichs befanden, erfolgte bei den nachfolgenden Messreihen im zweiten Durchgang die Kalibration mit einer vierten Standardlösung (10^-5 mmol/l), so dass die Kalibrationsgerade um einen vierten Messpunkt erweitert wurde. Die Kalibrationsgeraden verliefen linear (Ausnahme an Tag 6: dort geringer Anstieg der Geraden zwischen der dritten und vierten Verdünnungsstufe) linear, so dass die Werte, die im ersten Durchgang außerhalb des Kalibrationsbereichs lagen, durch Extrapolation nachträglich kalkuliert werden konnten.

Die Überprüfung des Einflusses der Chymusviskosität und des Kalibrationsbereichs ergab, dass die Anwendung einer Sonde mit Membran zur Messung der NH3-Konzentration im Chymus zulässig war.

4.1.7.2 Harnstoffkonzentration im ilealen Chymus

In dieser Studie wurde auch die Konzentration von Harnstoff bestimmt, der wesentlicher Bestandteil der NPN-Fraktion des Ileumchymus ist und über den Pankreassaft, die Galle und den Dünndarm sezerniert wird (BERGNER et al. 1986) und dessen Anteil etwa 3-5 % an der gesamten N-Anflutung am terminalen Ileum beträgt (MOUGHAN u. SCHUTTERT 1991;

MINER-WILLIAMS et al. 2009). In diversen exemplarisch ausgesuchten Chymusproben der

Diskussion

K- und PL-Tiere bei N-freier Ernährung konnte Harnstoff mit dem hier zur Verfügung stehenden kommerziellen Testsatz (Harnstoff CT^®, Hitado Diagnostic Systems, Möhnesee) nicht nachgewiesen werden. Die vom Hersteller angegebene Nachweisgrenze wurde durch Enteiweißung um ein Fünffaches erhöht (Verdünnung von 1: 5). Daraus ergab sich die Nachweisgrenze (50 mg/l) des hierbei angewendeten Testsatzes zur Bestimmung der Harnstoffkonzentration im Chymus. Weil der Harnstoffgehalt mit dieser Methode im ilealen Chymus bei den K- und PL-Tieren nicht detektiert werden konnte, ist davon auszugehen, dass der in den Dünndarm sezernierte Harnstoff durch die Ureaseaktivität im Darmlumen sofort zu Ammoniak bzw. Ammonium umgesetzt würde.

4.1.8 Berechnungen

4.1.8.1 Berechnungen der Kotmengen

Bei der Berechnung der Kotmengen wurde ein fehlender Kotabsatz mit Null in die Berechnung einbezogen, so dass der tägliche Mittelwert neben der Kotmasse pro Defäkation je Tag auch ganz erheblich durch die Anzahl, bzw. den Anteil der Tiere mit Kotabsatz beeinflusst wurde. Daher wurde, wenn ein Tier über die Dauer von einem oder zwei Tagen keinen Kot absetzte, der nachfolgende Tag mit Kotabsatz mit den vorherigen Tagen ohne Kotabsatz gemittelt (s. Anhang 31-38). Dieses Verfahren kam sowohl für die Kotmengen als auch für die endogene N-Ausscheidung, nicht aber für die TS- und N-Konzentrationen zur Anwendung. Ohne diese Berechnungsgrundlage wäre eine statistische Auswertung der Kotsammlung zur Bestimmung der Kinetik der N-Ausscheidung der drei PL-Tiere aufgrund des an einzelnen Tagen fehlenden Kotabsatzes nicht möglich gewesen. Von Nachteil bei dieser Berechnungsmethode ist allerdings, dass die mittleren Werte der Kotmenge und der Rp-Ausscheidung von zwei oder drei Tagen von den ursprünglichen Werten einzelner Tage ohne Kotabsatz abweichen. Darüber hinaus verbleibt bei einem fehlenden Kotabsatz die Digesta länger (teilweise über mehrere Tage) im Darmtrakt als bei einem frequenteren Kotabsatz. Eine verzögerte Passage der stärkereichen Digesta hat vermutlich einen Effekt auf die N-Metabolisierung durch Mikroben bzw. die N-Resorption. So wird z. B durch die Diffusion von Harnstoff in das Darmlumen entlang des Konzentrationsgradienten die bakterielle N-Fixierung beeinflusst (WILLIAMS et al. 2001).

Diskussion

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4.1.8.2 Ausgangswerte für die Kinetik der N-Verluste und Vergleich der „Basalwerte“ bei der Kotsammlung

Die faecale N-Ausscheidung war bei den PL-Tieren aufgrund der vergleichsweise großen Kotmenge eines einzelnen Tieres (PL-Tier 80) am Tag 1 mehr als doppelt so hoch (5,52 ± 2,64 g/d) als am Tag 2-4 (im Mittel: 2,19 ± 0,75 g/d). Der in den ersten drei Tagen entnommene Kot stammte aufgrund der Passagezeit (4-5 Tage) der Digesta durch den Dickdarm aus dem Alleinfutter zur Erhaltung, so dass statt des Tages 1, an dem die Kotmenge der PL-Tiere eine hohe Standardabweichung (s. Tabelle 44) aufwies, die mittlere N-Ausscheidung (Rp-N-Ausscheidung) der Tage 2 und 3 als Ausgangswert für die Beschreibung der Kinetik zu Grunde gelegt wurde (s. Anhang 38). Zum Vergleich der N-Ausscheidung zu Beginn der Sammlung mit den „Basalwerten“ der endogenen N-Verluste über den gesamten Verdauungstrakt wurde bei den K-Tieren Tag 7 und bei den PL-Tieren Tag 8 verwendet, da an diesen Tagen jeweils mindestens drei Tiere jeder Gruppe Kotabsatz aufwiesen, was an keinem anderen Tag (ab Tag 4) der Fall war (Anhang 30 und 31). Anhand der ermittelten N-Konzentration und berechneten N-Ausscheidung zeigte sich, dass ab dem Tag 7 in beiden Gruppen „Basalwerte“ der endogenen N-Verluste über den Kot erreicht waren, daher war es gerechtfertigt Tag 7 und 8 gegenüber zustellen.

4.1.8.3 Berechnung der Basalwerte bzw. unvermeidlichen N-Verluste über Harn und Kot Beginnend ab Tag 3 war die N-Ausscheidung über den Harn relativ konstant, schwankte jedoch an den Tagen 3 bis 6 bei den K-Tieren zwischen 1,6 und 3,2 g N/d und bei den PL-Tieren zwischen 1,8 und 2,9 g N/d, so dass die unvermeidlichen N-Verluste (Basalwerte) über den Harn aus dem Mittelwert der Tage 3 bis 6 errechnet wurden.

Die Basalwerte der N-Ausscheidung über Kot und Harn wurden aus den N-Verlusten über den Kot (Versuch B) und den N-Verlusten über den Harn (Versuch A), der parallel zur Chymuskollektion gesammelt wurde, berechnet. Dieses Prozedere weicht daher von vergleichbaren Studien (OTTO et al. 2003) ab, in denen die N-Verluste zeitgleich über die Faeces und den Harn bestimmt wurden, ohne dem Tier zusätzlich Chymus zu entnehmen. In diesem Zusammenhang stellt sich die Frage, ob die tägliche Entnahme etwa der Hälfte des ilealen Chymus zu einer Beeinflussung der N-Verluste über den Harn führt.

Diskussion

Ein hoher Einstrom fermentierbarer Kohlenhydrate hat eine Zunahme der mikrobiellen Fermentation und einen höhern Transfer kleinmolekularer N-Metabolite (Harnstoff) in den Dickdarm zur Folge. Das Abbauprodukt des in den Darm sezernierten Harnstoffs (NH3) ist dabei die wichtigste N-Quelle für Bakterien im Dickdarm (LEVRAT et al. 1991b).

Wenn viel Substrat (Kohlenhydrate oder Rohfaser) in den Dickdarm gelangt, nimmt die bakterielle N-Fixierung zu, so dass mehr Stickstoff über den Darm als über den Harn ausgeschieden wird. Obwohl bei den PL-Tieren des Nachts (mit Ausnahme von Tag 5) signifikant höhere Chymusmassen vom Dünndarm in den Dickdarm flossen, war die Harnstoff- und N-Ausscheidung über den Harn bei beiden Gruppen auf gleichem Niveau.

Infolgedessen war der Einfluss durch die Entnahme der Chymusmassen bei dieser Untersuchung eher als gering einzuschätzen.

4.1.9 Harnsammlung

Bei der Kollektion des Harns traten vereinzelt Schwierigkeiten (Harnabsatz während der Reinigung der Fisteln und Käfige sowie Verunreinigungen der Harnproben) bei der Gewinnung der Proben auf, so dass drei Werte in die statistische Auswertung nicht mit einbezogen werden konnten. Im nächtlichen Zeitraum von Tag 1 spielte K-Tier 69 mit der Tränke, so dass Tag 1 lediglich in Bezug auf die absolute Harnmenge (sowie den Harnstoff- und N-Gehalt) nicht mit einbezogen wurde. Am Tag 3 setzte das selbe Tier während der Fütterung und Reinigung der Fisteln vollständig Harn ab, der nicht quantifiziert werden konnte. Zusätzlich war der Harn des PL-Tieres 108 am Tag 2 mit Chymus verunreinigt, so dass von diesem Tag nur die Harnmenge ausgewertet werden konnte. Der Ausschluss dieser drei Werte der zuvor erwähnten Tage hatte jedoch keinen erkennbaren Einfluss auf die Ergebnisse der Harnstoff– und der N-Ausscheidung.

Hingegen wurden bei den Tag- und Nachtvergleichen (Angaben je 12-Stundenintervall) keine ganzen Tage, sondern nur 12-Stundenintervalle der betroffenen Tiere aus der statistischen Berechnung ausgeschlossen. Bei den K-Tieren 69 und 99 sowie den PL-Tieren 106 und 108 wurde am Tag 2 im Intervall 8.00-20.00 Uhr der Harn versehentlich nicht quantifiziert. Zur Berechnung der Harnmenge dieses Tages wurden ein Mittelwert aus den verbleibenden fünf Intervallen (8.00-20.00 Uhr) verwendet und mit dem Intervall 20.00-8.00 Uhr von Tag 2, dem

Diskussion

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Tag, an dem die Harnmenge von 8.00-20.00 Uhr fehlte, addiert. Dies hatte ebenfalls in beiden Gruppen keine Auswirkungen auf die Kinetik der Harnstoff– und der N-Ausscheidung.