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3.8 Feingewebliche Untersuchungen

3.8.3 Immunhistochemie

3.8.3.2 Kontrollen

Als Positivkontrolle für den Nachweis von Kollagen Typ I wurde Aorta und Sehne vom Rind mitgeführt, für den Nachweis von Kollagen Typ III diente bovine Haut, die jeweils aus dem Sektionsgut des Instituts für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover stammte. Außerdem wurden Negativkontrollen mitgeführt, um die Existenz unspezifischer Bindungen beurteilen zu können. Hierbei wurde im Falle vom Kollagen Typ I-Nachweis der Primärantikörper durch Balb/c Mäuseaszites (BioLogo Dr. Hartmut Schultheiß e.K., Kronshagen) in der Verdünnung 1:1000 in

PBS mit 1% BSA ersetzt. Beim Nachweis von Kollagen Typ I wurde für die Negativkontrollen statt des Primärantikörpers Kaninchenserum 1: 3000 verdünnt verwendet.

3.8.4 Auswertung der Histologie und Immunhistochemie

3.8.4.1 Lichtmikroskopisch

Für die lichtmikroskopische Untersuchung stand das Mikroskop Axiostar Plus der Fa.

Zeiss, Deutschland zur Verfügung. Die HE-gefärbten Schnitte jeder Biopsie wurden verblindet von 2 unabhängigen Untersuchern semiquantitativ nach einem etablierten Score (ASTROM und RAUSING 1995) (s. Tab. 3.10) in 10- und 40-facher Vergrößerung beurteilt. Die Ergebnisse der Untersucher wurden für die weitere Auswertung gemittelt. Zur Beurteilung wurden folgende 5 Parameter herangezogen:

1. Faserstruktur (0 = linear 3 = kurze Fasern mit Unterbrechungen)

2. Faseranordnung (0 = regelmäßige Anordnung 3 = kein Muster erkennbar) 3. Morphologie der Sehnenzellkerne (0 = flach 3 = rund)

4. Variationen in der Zelldichte (0 = einheitlich 3 = hohe regionale Variabilität) 5. Vaskularisation (0 = keine 3 = hoch)

Die einzelnen Parameter wurden nach dem in Tab. 3.10 dargestellten Prinzip graduiert.

Tab. 3.10: Semiquantitaiver 4 – Punkte Score Score Beschreibung

0 Normales Erscheinungsbild 1 Geringgradig abnormal 2 Mittelgradig abnormal 3 Hochgradig abnormal

Abb. 3.12: Beispielhafte Bilder für die Graduierung des Parameters

„Faserstruktur“

Histologische Schnittpräparate zweier Sehnenbioptate, HE-Färbung, Vergrößerung 40x

a: F 1672/10: Score 0 b: F 6335/10: Score 3

Abb. 3.13: Beispielhafte Bilder für die Graduierung des Parameters

„Faseranordnung“

Histologische Schnittpräparate zweier Sehnenbioptate, HE-Färbung, Vergrößerung 40x

a: F 1672/10: Score 0 b: F 6384/11: Sore 3

a b

a b

Abb. 3.14: Beispielhafte Bilder für die Graduierung des Parameters

„Morphologie der Sehnenzellkerne“

Histologische Schnittpräparate zweier Sehnenbioptate, HE-Färbung, Vergrößerung 40x

a:F 6263/10: Score 0 b: F1672: Score 3

Abb. 3.15: Beispielhafte Bilder für die Graduierung des Parameters

„Zellkerndichte“

Histologische Schnittpräparate zweier Sehnenbioptate, HE-Färbung, Vergrößerung 40x

a: F 6384/11: Score 0 b: F 2489/09: Score 3

a b

a b

Abb. 3.16: Beispielhafte Bilder für die Graduierung des Parameters

„Vaskularisation“

Histologische Schnittpräparate zweier Sehnenbioptate, HE-Färbung, Vergrößerung 40x

a: F6264/10: Score 0 b: F 6384/11: Score 3

Durch Addition der einzelnen Score-Werte aller 5 Parameter ergab sich ein Gesamt-Score-Wert für den jeweiligen HE-Schnitt.

Außerdem wurden die strukturelle Integrität und die metabolische Aktivität der Sehnenbioptate durch Addition der Score-Werte für die jeweils zugehörigen Parameter [(strukturelle Integrität: Faserstruktur (Score-Werte von 0 = linear bis 3 = kurze Fasern mit Unterbrechungen) und –anordnung (Score-Werte von 0 = regelmäßig bis 3 = kein Muster erkennbar); metabolische Aktivität: Morphologie der Sehnenzellkerne (Score-Werte von 0 = flach bis 3 = rund), Variationen in der Zelldichte (Score-Werte von 0 = einheitlich bis 3 = hohe regionale Variabilität) Vaskularisation (Score-Werte von 0 = keine bis 3 = hoch)] beurteilt.

Die Zwischenwerte für die strukturelle Integrität und die metabolische Aktivität wurden addiert und ergaben die histologische Gesamtbeurteilung.

3.8.4.2 Morphometrie

Die immunhistochemisch gefärbten Schnitte wurden für die morphometrisch- quantitative Auswertung bei 2- und 10-facher Vergrößerung mittels einer an das

a b

Mikroskop angeschlossenen Videokamera (Color View II, 3,3 Megapixel CCD, Soft Imaging System, Münster, Deutschland) digital fotografiert. Mit Hilfe des Programmes analySYS® 3.1. (Soft Imaging System GmbH, Münster, Deutschland) wurde durch manuelles Umfahren der gesamten auswertbaren Gewebeanschnittsfläche eine sogenannte region of interest (ROI) festgelegt.

Innerhalb dieser ROI wurde die Fläche mit positivem (braunen) Farbsignal in Relation zur gesamten ROI ermittelt und das Ergebnis in Prozent angegeben. Der Schwellenwert für das Farbsignal wurde durch den Untersucher festgelegt, wie zuvor beschrieben (ULRICH et al. 2006; KUMMERFELD et al. 2012)

3.9 Statistische Auswertung

Die Auswertung der Daten erfolgte mit Hilfe des Statistikprogramms SAS®, Version 9.3 (SAS Institute, Cary, NC, USA) im Institut für Biometrie, Epidemiologie und Informationsverarbeitung der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover.

Alle Werte in den Graphen wurden als arithmetische Mittelwerte mit Standardfehler (±SEM) dargestellt.

Die Annahme auf Normalverteilung wurde mittels Kolmogorov-Smirnov-Test geprüft.

Bei Ablehnung von Normalverteilung fanden verteilungsfreie nichtparametrische Verfahren Anwendung.

Um die Unterschiede der ordinalskalierten Parameter Lahmheitsgrad, Umfangsvermehrung, Druckempfindlichkeit und Hautoberflächenwärme zwischen den Gruppen stratifiziert nach dem Untersuchungszeitpunkt zu überprüfen, wurde der Fisher`s exact test angewendet.

Um die Unterschiede dieser Parameter innerhalb einer Gruppe zwischen den Untersuchungszeitpunkten zu untersuchen kam der Permutationstest für gepaarte Beobachtungen zur Anwendung.

Der Einfluss der Gruppen und der Untersuchungszeitpunkte auf die Ultraschallparameter (T-CSA, TL-CSA, %T-Lesion, TES, TFAS) wurde mit Hilfe einer zweifaktoriellen Varianzanalye für unabhängige Stichproben überprüft.

Um zu überprüfen, ob sich die Mittelwerte der untersuchten Parameter innerhalb einer Gruppe an den einzelnen Untersuchungstagen unterschieden, fand der Student`s t-Test für verbundene Stichproben Anwendung.

Um die Unterschiede zwischen den beiden Gruppen an den entsprechenden Untersuchungstagen zu ermitteln, wurde der t-Test für unabhängige Stichproben verwendet.

Für die Irrtumswahrscheinlichkeit p wurden folgende Signifikanzstufen festgesetzt:

p>0,05 - nicht signifikant (n.s.) p<0,05 - signifikant (*)

p<0,01 - hoch signifikant (**) p<0,001 - höchst signifikant (***)

Um die Präzision der Auswertung der Sehnenbioptate (HE) zwischen verschiedenen Untersuchern zu überprüfen wurde die Intra-Klassen-Korrelation (intra-class correlation coefficient rho, pIC) berechnet. Zur Untersuchung der Varianz zwischen verschiedenen Untersuchern (inter observer reliability) wurde jede Biopsie einmal von zwei Untersuchern analysiert.

Mit Hilfe der Varianzkomponentenanalyse wurde die Variation zwischen den Untersuchern hinsichtlich der Parameter, die analysiert wurden, bestimmt. Im Idealfall einer perfekten Korrelation erhält jeder Untersucher die gleichen Ergebnisse (Fehlervarianz σ2e = 0, pIC = 1). Eine Korrelation > 0,75 wird als exzellente, eine Korrelation ≤ 0,75 und ≥ 0,4 als gute bis ausreichende und eine Korrelation < 0,4 als schlechte Übereinstimmung gewertet (FLEISS 1986).

4 ERGEBNISSE

4.1 Befunde der Erstuntersuchung 4.1.1 Klinische Untersuchung

Bei der Auswertung wurden die erkrankten Gliedmaßen als voneinander unabhängige Extremitäten betrachtet, so dass Pferde mit bilateralen Sehnenschäden jeweils als zwei „Fälle“ ausgewertet wurden, wobei jeweils eine Seite als Kontrolle diente.

4.1.1.1 Lahmheit der Gliedmaßen mit OBS Schaden

Von 17 Gliedmaßen waren bei der Erstuntersuchung sechs Gliedmaßen, d.h. fünf Pferde (35,29%) lahmfrei (ein Pferd davon mit bilateral erkrankten oberflächlichen Beugesehnen), weitere fünf Gliedmaßen von fünf Pferden (29,4%) zeigten eine geringgradig undeutliche Lahmheit. Fünf Gliedmaßen (29,4%) waren mit einer geringgradig deutlichen Lahmheit behaftet und eine Gliedmaße eines Pferdes (5,8%) zeigte eine mittelgradige Lahmheit.

In der mit ACS behandelten Gruppe (insgesamt n = 10 Gliedmaßen) befanden sich vier lahmfreie Gliedmaßen von vier Pferden (40%), vier Gliedmaßen von vier Pferden (40%) mit einer geringgradig undeutlichen Lahmheit und zwei Gliedmaßen von zwei Pferden (20%) mit einer geringgradig deutlichen Lahmheit (Abb. 4.1). In der Kontrollgruppe (insgesamt n = 7 Gliedmaßen) waren bei der Erstuntersuchung zwei Pferde (28,6%) lahmfrei, ein Pferd (14,3%) zeigte eine geringgradig undeutliche Lahmheit und drei Pferde (42,9%) waren geringgradig deutlich lahm. Ein weiteres Pferd (14,3%) zeigte eine mittelgradige Lahmheit.

Abb. 4.1: Lahmheitsgrad zum Zeitpunkt der Erstuntersuchung

0 = keine Lahmheit, 1 = geringgradig undeutliche Lahmheit, 2 = geringgradig deutliche Lahmheit, 3 = mittelgradige Lahmheit

4.1.1.2 Umfangsvermehrung

Vierzehn der 17 untersuchten oberflächlichen Beugesehnen zeigten zum Zeitpunkt der Erstuntersuchung eine geringgradige Umfangsvermehrung, zwei Sehnen waren mittelgradig verdickt und eine oberflächliche Beugesehne zeigte eine hochgradige Umfangsvermehrung (Abb. 4.2).

In der mit ACS behandelten Gruppe waren acht oberflächliche Beugesehnen (80%) geringgradig, eine (10%) mittelgradig und eine (10%) hochgradig verdickt. In der Kontrollgruppe waren sechs Sehnen (85,7%) geringgradig sowie eine Sehne (14,3%) mittelgradig umfangsvermehrt.

0 1 2 3 4 5

0 1 2 3

Lahmheitsgrad

Anzahl der Gliedmaßen

ACS Kontrolle

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

1 2 3

Grad der Umfangsvermehrung

Anzahl der Gliedmaßen

ACS Kontrolle

Abb. 4.2: Grad der Umfangsvermehrung der oberflächlichen Beugesehnen zum Zeitpunkt der Erstuntersuchung

1 = geringgradig umfangsvermehrt, 2 = mittelgradig umfangsvermehrt, 3 = hochgradig umfangsvermehrt

4.1.1.3 Druckempfindlichkeit

Alle erkrankten Sehnen waren über ein normales Maß hinaus druckempfindlich. Es wurde an sieben Sehnen eine geringgradige, an neun eine mittelgradige und an einer eine hochgradige Schmerzreaktion ausgelöst (Abb. 4.3).

Der ACS Gruppe waren vier (40%) geringgradig, fünf (50%) mittelgradig und eine (10%) hochgradig dolente Sehnen zugehörig. In der Kontrollgruppe reagierten drei (42,8%) Sehnen geringgradig und vier (57,1%) mittelgradig druckdolent auf die Palpation.

0 1 2 3 4 5 6

1 2 3

Grad der Druckempfindlichkeit

Anzahl der Gliedmen

ACS Kontrolle

Abb. 4.3: Druckempfindlichkeit zum Zeitpunkt der Erstuntersuchung

1 = geringgradig schmerzhaft, 2 = mittelgradig schmerzhaft, 3 = hochgradig schmerzhaft

4.1.1.4 Wärme

Es konnte insgesamt elfmal eine geringgradig und viermal eine mittelgradig erhöhte Hauttemperatur über der oberflächlichen Beugesehne festgestellt werden. Bei zwei Gliedmaßen war die Hautoberfläche der palmaren Metakarpalregion normal temperiert (Abb. 4.4).

In der ACS-Gruppe waren acht (80%) Gliedmaßen geringgradig und eine (10%) Gliedmaße mittelgradig vermehrt warm. Eine (10%) weitere hatte eine normale Hautoberflächentemperatur. In der Kontrollgruppe konnte jeweils bei drei (42,8%) Gliedmaßen eine geringgradig und mittelgradig vermehrte Wärme festgestellt werden. Eine (14,2%) Gliedmaße zeigte keine vermehrte Wärme.

0

Abb. 4.4: Wärme zum Zeitpunkt der Erstuntersuchung

0 = keine vermehrte Wärme; 1 = geringgradig vermehrte Wärme, 2 = mittelgradig vermehrte Wärme

4.2 Befunde der Nachuntersuchungen 4.2.1 Entwicklung des Lahmheitsgrades

Insgesamt gab es keinen Unterschied bezüglich des durchschnittlichen Lahmheitsgrades zwischen den beiden Gruppen (p>0,05).

Sowohl in der Kontrollgruppe als auch in der mit ACS behandelten Gruppe sank der durchschnittliche Lahmheitsgrad nach der Erstuntersuchung, so dass ab Tag 37 keine Gliedmaße mehr mit Lahmheit behaftet war. Von den 6 (60%) Gliedmaßen in der ACS-Gruppe, die mit Lahmheit behaftet waren, verschwand die Lahmheit bei vier Gliedmaßen nach 12 Tagen, bei einer nach 23 Tagen und einer nach 37 Tagen.

In der Kontrollgruppe war bei 4 Gliedmaßen die Lahmheit nach 12 Tagen nicht mehr vorhanden. Bei einer Gliedmaße zeigte sich keine Besserung zwischen dem 12. und 23. Tag.

Der durchschnittliche Lahmheitsgrad in der ACS-Gruppe unterschied sich zwischen Tag 1 und Tag 12 (p<0,05), und blieb im Laufe der weiteren Untersuchungen auf einem ähnlichen Niveau (p>0,05) (Abb.4.5). In der Kontrollgruppe trat der

Unterschied zu Tag 1 erst an Tag 37 auf (p<0,05), die nachfolgenden Untersuchungen unterschieden sich ebenfalls nicht voneinander (p>0,05).

Untersuchungszeitpunkte (d)

Werte (±SEM) mit unterschiedlichen Buchstaben innerhalb einer Gruppe unterscheiden sich signifikant (p<0,05). (hellblauer Pfeil = 1. Sehnenbiopsie, T1; roter Pfeil = intraläsionale Injektion von ACS / Kontrolle, T2/3; dunkelblaue Pfeile = Sehnenbiopsien, T37 + T191; T = Tag).

4.2.2 Entwicklung der Umfangsvermehrung der Sehnen

Zwischen den beiden Gruppen wurde zu keinem Zeitpunkt ein Unterschied bezüglich der durchschnittlichen Umfangsvermehrung der Sehnen beobachtet (p>0,05) (Abb.

4.6).

Ein Rückgang der Schwellung war erstmalig bei einer (10%) Sehne aus der ACS-Gruppe an Tag 12 zu sehen, bei der Kontrollgruppe konnte ein Schwellungsrückgang erstmals an Tag 79 bei einer (14,3%) Gliedmaße beobachtet werden. Aus der mit ACS behandelten Gruppe erlangten 7 (70%) Sehnen ihre ursprüngliche Stärke wieder, aus der Kontrollgruppe 3 (42,9%).

Der Grad der Schwellung war in der ACS-Gruppe ab Tag 79 geringer als zu allen vorherigen Untersuchungszeitpunkten (p<0,05) und blieb ab dem 79. Tag auf einem gleichen Niveau (p>0,05). Innerhalb der Kontrollgruppe lag kein Unterschied bezüglich der Umfangsvermehrung vor.

Untersuchungszeitpunkte (d)

Abb. 4.6: Entwicklung der Umfangsvermehrung beider Gruppen im Verlauf der Nachuntersuchungen

Werte (±SEM) mit unterschiedlichen Buchstaben innerhalb einer Gruppe unterscheiden sich signifikant (p<0,05). (hellblauer Pfeil = 1. Sehnenbiopsie, T1; roter Pfeil = intraläsionale Injektion von ACS / Kontrolle, T2/3; dunkelblaue Pfeile =

4.2.3 Entwicklung der Druckdolenz

Die durchschnittliche Druckdolenz der Sehnen unterschied sich zwischen der Prüf- und Kontrollgruppe zu keinem Zeitpunkt (p>0,05) (Abb. 4.7).

Die Druckempfindlichkeit der Sehnen nahm in beiden Gruppen bis zum 23. Tag ab (p<0,05) und blieb dann während des restlichen Beobachtungszeitraumes auf dem gleichen Niveau (p>0,05). Der Verlauf der Druckdolenz der Sehnen in der Kontrollgruppe entspricht dem der ACS-Gruppe mit der Ausnahme, dass sich die Untersuchungstage 12 und 23 hier nicht voneinander unterschieden (Kontrollgruppe:

p>0,05).

Werte (±SEM) mit unterschiedlichen Buchstaben innerhalb einer Gruppe unterscheiden sich signifikant (p<0,05). (hellblauer Pfeil = 1. Sehnenbiopsie, T1; roter

Pfeil = intraläsionale Injektion von ACS / Kontrolle, T2/3; dunkelblaue Pfeile = Sehnenbiopsien, T37 + T191; T = Tag).

4.2.4 Entwicklung der Hautoberflächenwärme im Bereich der OBS Zwischen den beiden Gruppen lagen keine Unterschiede vor (p>0,05) (Abb. 4.8).

In beiden Gruppen war an Tag 23 eine Abnahme der Hautoberflächenwärme im Vergleich zu Tag 1 zu verzeichnen (p<0,05). Die Wärmebefunde blieben zwischen Tag 23 und 191 auf einem ähnlich niedrigen Niveau (p>0,05).

Untersuchungszeitpunkte (d)

Abb. 4.8: Entwicklung der Hautoberflächenwärme im Bereich der OBS während des Untersuchungszeitraumes

Werte (±SEM) mit unterschiedlichen Buchstaben innerhalb einer Gruppe unterscheiden sich signifikant (p<0,05). (hellblauer Pfeil = 1. Sehnenbiopsie, T1; roter

Pfeil = intraläsionale Injektion von ACS / Kontrolle, T2/3; dunkelblaue Pfeile = Sehnenbiopsien, T37 + T191; T = Tag).

4.2.5 Ergebnisse der ultrasonographischen Untersuchungen

Es konnte festgestellt werden, dass bei tiefen Außentemperaturen die Qualität der Ultraschallbilder gemindert war.

4.2.5.1 Lokalisation der Läsion

Der Bereich der Sehne, in dem die Echotextur zum Zeitpunkt der Erstuntersuchung am stärksten verändert war (Maximal Injury Zone, MIZ), war in der Mehrheit der Fälle (41,17%) in der Zone 2b lokalisiert (Tab. 4.1.). Die Zonen 1a, 3b und 3c waren in keinem Fall betroffen.

Tab. 4.1: Echographisch ermittelte Lokalisation der Sehnenveränderungen in den Gruppen

Lokalisation ACS-Gruppe Kontrollgruppe Gesamt

1a 0 0 0

1b 3 (30%) 3 (42,85%) 6 (35,29%)

2a 0 3 (42,85%) 3 (17,64%)

2b 6 (60%) 1 (14,3%) 7 (41,17%)

3a 1 (10%) 0 1 (5,88%)

3b 0 0 0

3c 0 0 0

4.2.5.2 Art der Sehnenläsionen

Alle Pferde zeigten unterschiedliche Veränderungen der oberflächlichen Beugesehne:

• Fokale Läsionen mit verringerter Echogenität innerhalb oder am Rand der oberflächlichen Beugesehne (Kernläsion, randständige Läsionen)

• Diffuse Veränderungen der Echotextur mit teils hypo- teils normoechogenem Echobesatz (diffuse Läsionen)

Damit waren folgende Veränderungen vergesellschaftet:

• Vergrößerung des Sehnenquerschnittes / dorso-palmare Verdickung der Sehne

• Abweichungen von der regulären Anordnung der Sehnenfaserbündel

Es wurde eine Einteilung in Kernläsionen (Abb. 4.9), randständige Läsionen (Abb.

4.10) und diffuse Tendopathien (Abb. 4.11) vorgenommen.

Abb. 4.9: Beispielhafte Ultrasonogramme einer OBS mit Kernläsion Die Pfeile stellen die Läsionsbegrenzungen dar.

a: Transversalebene Zone 2b, F4793/10; b: Sagittalebene Zone 2, F4793/10 a b

Abb. 4.10: Beispielhafte Ultrasonogramme einer OBS mit randständiger Läsion Die Pfeile stellen die Läsionsbegrenzungen dar.

a: Transversalebene, Zone 2a, F6383/11; b: Sagittalebene Zone 2, F6383/11

Abb. 4.11: Beispielhafte Ultrasonogramme einer OBS mit diffusen Veränderungen

Die Pfeile stellen die Läsionsbegrenzungen dar.

a: Transversalebene Zone 2b, F6335/10; b: Sagittalebene Zone 2, F6335/10

a b

a b

Bei sieben (41,17%) Sehnenschäden handelte es sich um Kernläsionen der oberflächlichen Beugesehne (Tab. 4.2), bei fünf (29,41%) um randständige Defekte.

Fünf mal (29,41%) lagen diffuse Tendopathien vor.

Tab. 4.2: Art der Sehnenläsionen in Abhängigkeit von den Gruppen Art der

Sehnenläsion ACS-Gruppe Kontrollgruppe Gesamt

Kernläsion 5 (50%) 2 (28,57%) 7 (41,17%)

Randläsion 2 (20%) 3 (42,85%) 5 (29,41%)

Diffuse

Tendinopathie 3 (30%) 2 (28,57%) 5 (29,41%)

4.2.5.3 Gesamte Fläche der oberflächlichen Beugesehne (Total Cross Sectional Area, T-CSA)

Zu keinem Untersuchungszeitpunkt konnten Unterschiede (p>0,05) der T-CSA innerhalb beider Gruppen sowie zwischen der ACS- und der Kontrollgruppe festgestellt werden (Abb. 4.12).

Untersuchungszeitpunkte (d)

1 12 23 37 51 79 107 135 163 191

T-CSA (mm2 )

0 400 600 800 1000 1200

ACS-Gruppe Ktr.-Gruppe

Abb. 4.12: Entwicklung der gesamten Fläche der oberflächlichen Beugesehne in der ACS - und der Kontrollgruppe im Verlauf der Untersuchungen (±SEM) (hellblauer Pfeil = 1. Sehnenbiopsie, T1; roter Pfeil = intraläsionale Injektion von ACS / Kontrolle, T2/3; dunkelblaue Pfeile = Sehnenbiopsien, T37 + T191; T = Tag).

4.2.5.4 Summe aller sonographisch dargestellten Läsionsquerschnittsflächen (Total Lesion Cross-Sectional Area, TL-CSA)

Es konnte zu keinem Zeitpunkt Unterschiede (p>0,05) in der Summe aller sonographisch dargestellten Läsionsquerschnittsflächen (TL-CSA) zwischen den beiden Gruppen erhoben werden (Abb. 4.13).

Das Absinken der TL-CSA war innerhalb der ACS-Gruppe ab dem 79.

Untersuchungstag bis zum letzten Untersuchungstag (Tag 191) signifikant (p<0,05) gegenüber der ersten Untersuchung (Tag 1).

In der Kontrollgruppe blieben die Werte während des gesamten Untersuchungszeitraumes auf einem ähnlichen (p>0,05) Niveau.

Untersuchungszeitpunkte (d)

Abb. 4.13: Entwicklung der Summe aller sonographisch dargestellten Läsionsquerschnittsflächen (TL-CSA) in der ACS- und der Kontrollgruppe im Untersuchungszeitraum

Werte (±SEM) mit unterschiedlichen Buchstaben innerhalb einer Gruppe unterscheiden sich signifikant (p<0,05). (hellblauer Pfeil = 1. Sehnenbiopsie, T1; roter Pfeil = intraläsionale Injektion von ACS / Kontrolle, T2/3; dunkelblaue Pfeile = Sehnenbiopsien, T37 + T191; T = Tag).

4.2.5.5 Prozentualer Anteil der Summe der Läsionsquerschnittsflächen an der Summe der Querschnittsflächen aller 7 Untersuchungsebenen (Percent Total Lesion, %T-Lesion)

An den Tagen 79, 107 und 163 war die %T-Läsion in der ACS-Gruppe geringer (p<0,05) als in der Kontrollgruppe (Abb. 4.14). Zu den übrigen Zeitpunkten wurden keine Unterschiede (p>0,05) zwischen den Gruppen festgestellt.

Innerhalb der ACS-Gruppe war die %T-Läsion ab dem Untersuchungstag 79 signifikant kleiner (p<0,05) als an den ersten beiden Untersuchungszeitpunkten (Tag 1 und 12), und blieb dann bis Tag 191 auf einem konstant (p>0,05) niedrigem Niveau. In der Kontrollgruppe waren über den gesamten Untersuchungszeitraum keine Unterschiede (p>0,05) bezüglich der %T-Läsion erkennbar.

Untersuchungszeitpunkte (d)

Abb. 4.14: Entwicklung der %T-Läsion in der ACS- und der Kontrollgruppe im Untersuchungszeitraum

*

Percent total lesion (%) = prozentualer Anteil der Summe der Läsionsquerschnittsflächen an der Summe der Querschnittsflächen aller 7 Untersuchungsebenen.

Werte (±SEM) mit unterschiedlichen Buchstaben innerhalb einer Gruppe unterscheiden sich signifikant (p<0,05). Mit Stern gekennzeichnete Werte unterscheiden sich zwischen den Gruppen signifikant (p<0,05). (hellblauer Pfeil = 1.

Sehnenbiopsie, T1; roter Pfeil = intraläsionale Injektion von ACS / Kontrolle, T2/3;

dunkelblaue Pfeile = Sehnenbiopsien, T37 + T191; T = Tag).

4.2.5.6 Echogenität der Läsionen (Total Echo Score, TES)

Zwischen den Gruppen war an den Untersuchungstagen 79 und 107 der Echogenitätsscore in der ACS-Gruppe geringer (p<0,05) als in der Kontrollgruppe (Abb. 4.15). Zu den übrigen Zeitpunkten bestand kein Unterschied (p>0,05) hinsichtlich der Echogenität der Läsionen zwischen den Gruppen.

In der ACS-Gruppe war die Echogenität im Vergleich zur Erstuntersuchung erstmals ab Tag 23 erhöht (p<0,05). Sie blieb an den Untersuchungstagen 79 -191 auf einem ähnlichen Niveau (p>0,05) und war signifikant höher (p<0,05) als zu den ersten 4 Untersuchungstagen (Tag 1-37).

In der Kontrollgruppe stellte sich eine Erhöhung der Echogenität (p<0,05) im Vergleich zur Erstuntersuchung an den Untersuchungstagen 79 und 135 – 191 ein.

Untersuchungszeitpunkte (d)

Abb. 4.15: Entwicklung des summierten Echogenitätsscores der ACS- und der Kontrollgruppe im Untersuchungszeitraum

Werte (±SEM) mit unterschiedlichen Buchstaben innerhalb einer Gruppe unterscheiden sich signifikant (p<0,05). Mit Stern gekennzeichnete Werte unterscheiden sich zwischen den Gruppen signifikant (p<0,05). (hellblauer Pfeil = 1.

Sehnenbiopsie, T1; roter Pfeil = intraläsionale Injektion von ACS / Kontrolle, T2/3;

dunkelblaue Pfeile = Sehnenbiopsien, T37 + T191; T = Tag).

4.2.5.7 Faserbündelanordnung (Total Fibre Alignement Score, T-FAS)

Es konnte zu keinem Untersuchungszeitpunkt Unterschiede (p>0,05) im T-FAS zwischen den beiden Gruppen festgestellt werden (Abb. 4.16).

In der ACS-Gruppe erhöhte (p<0,05) sich der Anteil paralleler Faserbündel im Vergleich zum ersten Untersuchungstag ab Tag 79. Am letzten Untersuchungstag

normoechogen anechogen

(Tag 191) war der Anteil paralleler Faserbündel hier im Vergleich zu den ersten 8 Untersuchungszeitpunkten am höchsten (p<0,05).

In der Kontrollgruppe wurde ab Tag 135 eine Verbesserung der Faserbündelanordnung im Vergleich zum Ausgangswert (Tag 1) festgestellt (p<0,05).

Untersuchungszeitpunkte (d)

Abb. 4.16: Entwicklung der Faserbündelanordnung in der OBS in der ACS- und der Kontrollgruppe im Untersuchungszeitraum

Werte (±SEM) mit unterschiedlichen Buchstaben innerhalb einer Gruppe unterscheiden sich signifikant (p<0,05). (hellblauer Pfeil = 1. Sehnenbiopsie, T1; roter Pfeil = intraläsionale Injektion von ACS / Kontrolle, T2/3; dunkelblaue Pfeile = Sehnenbiopsien, T37 + T191; T = Tag).

4.3 Biopsieentnahme

4.3.1 Vorbereitung der Pferde zur Biopsieentnahme

Jede Sehne wurde insgesamt dreimal bioptiert. In einem Fall (F 1672/10) war in der Biopsiekanülenaussparung direkt nach der Bioptatentnahme makroskopisch kein Sehnengewebe erkennbar, so dass diese Sehne erneut bioptiert wurde.

Die Entnahme von insgesamt 51 Bioptaten erfolgte 17 mal (33,33%) unter Verwendung einer Oberlippenstrickbremse, fünf mal (9,8%) mit Sedierung und 29 mal (56,86%) mit Hilfe beider Maßnahmen.

4.3.2 Ergebnisse der klinischen Untersuchung unmittelbar nach der Bioptatentnahme

4.3.2.1 Schmerzreaktion

Bei 40 (78,43%) der 51 Bioptatentnahmen reagierten die Patienten mit keiner oder nur einer minimalen Abwehrreaktion (Grad 1) (Abb. 4.17). Neunmal (17,64%) wurde eine geringgradige Schmerzreaktion festgestellt (Grad 2) und zweimal (3,92%) zeigte sich eine mittelgradige Schmerzreaktion (Grad 3). Es kam bei keinem Pferd zu einer starken Abwehrreaktion (Grad 4) oder zu einer Schonung der Gliedmaße (Grad 5) nach dem Eingriff.

0 5 10 15 20 25 30 35 40

n (Bioptatentnahmen)

1 2 3 4 5

Grad der Schmerzreaktion

Abb. 4.17: Schmerzreaktion bei der Bioptatentnahme (n = 51)

1 = keine oder nur sehr geringgradige Schmerzreaktion; 2 = geringgradige Schmerzreaktion; 3 = mittelgradige Schmerzreaktion; 4 = hochgradige Schmerzreaktion; 5 = hochgradige Schmerzreaktion mit Schonung der Gliedmaße

4.3.2.2 Blutungen nach der Bioptatentnahme

Bei 25,49% der Bioptatentnahmen kam es nicht zu einer Blutung (Abb. 4.18). Bei der Mehrheit der Probanden (58,82%) trat an der Bioptatentnahmestelle eine geringgradige Blutung auf. Mittelgradige Blutungen, die bei Anbringen des Zehenpolsterverbandes stoppten, wurden in acht Fällen (15,68%) beobachtet. Eine hochgradige Blutung wurde in keinem Fall beobachtet.

40

9

2 0 0

0 5 10 15 20 25 30

n (Bioptatentnahmen)

1 2 3 4

Grad der Blutung

Abb. 4.18: Blutungen nach Bioptatentnahme (n = 51)

1 = keine Blutung, 2 = geringgradige Blutung, 3 = mittelgradige Blutung, 4 = hochgradige Blutung

4.4 Ergebnisse der lichtmikroskopischen Untersuchung

Es wurden insgesamt 51 Bioptate feingeweblich untersucht. Von diesen Bioptaten waren 47 (92,15%) Proben auswertbar, die übrigen vier enthielten lediglich Haut und Unterhautgewebe.

Bei den Proben, die kein Sehnengewebe enthielten, handelte es sich drei mal um eine Biopsie an Tag 1 (2 Kontrollsehnen, 1 ACS-Sehne), und einmal um eine Biopsie an Tag 37 (Kontrollsehne). Histologisch war an der äußeren Seite der Hautanschnitt mit Epidermis, Dermis, Drüsen- und z.T. Haaranschnitten und Unterhautbindegewebe sichtbar (n = 22), sofern bei der Biopsieentnahme auf ein Einstechen des Stilettes in die Haut vor Auslösung des Biopsieentnahmegerätes verzichtet wurde. Der distale Anteil bestand aus Sehnengewebe.

4.4.1 Faserstruktur

Zwischen den beiden Gruppen sowie innerhalb der ACS-Gruppe und der Kontrollgruppe konnten zu keinem Zeitpunkt Unterschiede hinsichtlich der Faserstruktur erhoben werden (p>0,05).

4.4.2 Faseranordnung

Zwischen beiden Untersuchungsgruppen bestand zu keinem Zeitpunkt ein Unterschied (p>0,05) (Abb. 4.19).

In der ACS-Gruppe war die Faseranordnung in den Bioptaten von Tag 191 (3.

Biopsie) signifikant regelmäßiger (p<0,05) als in den Bioptaten von Tag 1 (1.

Biopsie). Innerhalb der Kontrollgruppe war dieser Unterschied (p<0,05) zwischen den Bioptaten von den Tagen 37 und 191 erkennbar.

Abb. 4.19: Faseranordnung der Bioptate beider Gruppen zu allen drei Biopsiezeitpunkten

Werte (±SEM) mit Stern unterscheiden sich signifikant (p<0,05). Score: 0 = regelmäßige Anordnung der Fasern 3 = kein Muster erkennbar; T = Tag; T1 = Tag der Erstuntersuchung

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3

1. Biopsie (T1) 2. Biopsie (T37) 3. Biopsie (T191)

Score Ktr.-Gruppe

ACS-Gruppe

*

*

Abb. 4.20: Histologische Schnittpräparate zweier Sehnenbioptate eines Pferdes aus der ACS-Gruppe (F 1672/10), HE-Färbung, Vergrößerung 40x a: Tag 1, irreguläre Faseranordnung, kein Muster erkennbar; b: Tag 191, regelmäßige Faseranordnung

4.4.3 Zellkernmorphologie

Die Zellkernmorphologie war in den Bioptaten von Tag 37 in der Kontrollgruppe signifikant rundlicher (p<0,05) als in den Bioptaten der ACS-Gruppe (Abb. 4.21).

Die Morphologie der Zellkerne blieb innerhalb der ACS-Gruppe zu allen Biopsiezeitpunkten auf einem ähnlichen Niveau (p>0,05). Innerhalb der Kontrollgruppe unterschied sich die Form der Zellkerne zwischen Tag 37 und 191 (p<0,05). Während die Zellkerne in den Gewebeproben der 2. Biopsie noch rundlich waren, kam es zum Zeitpunkt der 3. Biopsie zu einer deutlichen Abflachung.

a b

Abb. 4.21: Zellkernmorphologie innerhalb der Bioptate beider Gruppen zu allen drei Biopsiezeitpunkten

Werte (±SEM) mit Stern unterscheiden sich signifikant (p<0,05).

Score: 0 = flache Zellkerne 3 = runde Zellkerne; T = Tag; T1 = Tag der Erstuntersuchung

Abb. 4.22: Histologische Schnittpräparate zweier Sehnenbioptate des Tag 37, HE-Färbung, Vergrößerung: 40x

a: Kontrollgruppe (F6384/11), die Zellkerne sind rund; b: ACS-Gruppe (F4793/10), die Zellkerne sind flach. Pfeile: Zellkerne

a: Kontrollgruppe (F6384/11), die Zellkerne sind rund; b: ACS-Gruppe (F4793/10), die Zellkerne sind flach. Pfeile: Zellkerne