Interpretation der Zymogramme

Die alphabetische Bezeichnung der Genorte und die numerische Bezeichnung der Enzymvari-anten eines Genortes sind durch deren Wandergeschwindigkeiten vorgegeben. Der Genort eines Enzymsystems, dessen Enzyme aufgrund des Stromfeldes am schnellsten durch das Gel migrieren, wird mit A bezeichnet, der Genort mit den zweitschnellsten Enzymvarianten mit B usw. Desgleichen wird die schnellste Enzymvariante eines Genortes mit 1 bezeichnet, die zweitschnellste mit 2 etc.

Bei den folgenden Abbildungen ist der anodische Teil oben, so daß eine Wanderung der En-zyme von unten nach oben vorzustellen ist. Des weiteren sind für eine Interpretation der Zy-mogramme Kenntnisse über die Quartärstrukturen der Enzyme erforderlich.

Abb. 4.3 Vereinfachte schematische Darstellung der Zymogramme von homozygoten bzw. heterozygoten Individuen, bei welchen ein monomeres, dimeres bzw. te-trameres Enzym von einem Genlocus kodiert wird (aus HATTEMER et al. 1993)

Bei einer monomeren Struktur besteht ein von einem Genlocus kodiertes Enzym aus einem Polypeptid. Homozygote Individuen kodieren im Falle einer monomeren Quartärstruktur ein Alloenzym, heterozygote zwei Alloenzyme. Auf den Zymogrammen sind ein Band bzw. zwei Bänder zu sehen (s. Abb. 4.3). Dimere Enzyme werden aus zwei Polypeptiden gebildet. Ho-mozygote Individuen kodieren ein Alloenzym, bei Heterozygotie und zufallsmäßiger Aggre-gation der Polypeptide werden drei Alloenzyme von einem Genlocus kodiert. Auf dem Zy-mogramm sind drei Banden sichtbar, wobei die mittlere Bande ein sogenanntes Hybridenzym

darstellt. Bei tetrameren Strukturen bestehen die Enzyme aus vier Polypeptiden. Auf dem Zymogramm zeigen Heterozygote ein Muster aus fünf Banden, von denen die mittleren drei Hybridbanden sind (HATTEMER et al. 1993).

Bei den folgenden Abbildungen von Zymogrammen ist der anodische Teil oben, so daß man sich eine Wanderung der Enzyme von unten nach oben vorzustellen hat.

AP - Aminopeptidasen Trennsystem Ashton.

Abb. 4.4 Zymogramme und schematische Darstellung für das Enzymsystem AP mit Be-zeichnung der Enzymvarianten für den Genort AP-B. Die Trennung erfolgte mit dem Puffersystem Ashton.

AP (Ashton)

B22 B22 B23 B12 B13 B33 B33 B33 B24

B

D C

B Zone

Trennsystem Histidin-Citrat

Abb. 4.5 Zymogramme und schematische Darstellung für das Enzymsystem AP mit Be-zeichnung der Enzymvarianten für den Genort AP-D. Die Trennung erfolgte mit dem Puffersystem Histidin-Citrat.

AP (Histidin-Citrat)

B

D C Zone

Das monomere Enzymsystem AP zeigt vier Zonen, von denen die Zonen AP-A und –C in der Regel nur eine schwache Intensität aufwiesen, so daß auf deren Auswertung verzichtet wer-den mußte. Für die Auswertung des Genortes AP-B wurde das Trennsystem Ashton bevor-zugt. Das Trennsystem Histidin-Citrat zeigte eine bessere Trennung der Enzymvarianten, aber auch störende Nebenbänder, die eine sichere Identifizierung erschwerten (s. B-Zone in Abb.

4.5). Für den Genort AP-D gelang eine Auftrennung der Enzyme nur mit dem Trennsystem Histidin-Citrat; mit dem Trennsystem Ashton war an diesem Genort die Trennung so gering, daß dieser monomorph erschien.

Für Genort AP-B wurden vier Enzymvarianten gefunden, von denen keine für eine der beiden Lindenarten spezifisch ist. Ebenfalls vier Varianten besitzt der Genort AP-D. Während die Enzymvarianten AP-D1 und -D2 bei Winterlinden beobachtet werden konnten, traten die Va-rianten AP-D3 und -D4 nur bei Sommerlinden auf. Bei Hybriden aus Winter- und Sommer-linde sind auf den Zymogrammen beide dieser artspezifischen Enzymvarianten zu sehen.

FDH – Formiatdehydrogenase

Abb. 4.6 Zymogramme und schematische Darstellung für das Enzymsystem FDH mit Bezeichnung der Enzymvarianten.

FDH

A36 A35

A12 A23 A33

A13 A55

A22 A33 A33

A Zone

Eine Anfärbung der Gele auf FDH zeigte generell eine schwache Intensität. Sicht- und aus-wertbar war lediglich eine Zone, für die sechs Enzymvarianten gefunden wurden. Für die ge-netische Analyse und Pollenelterbestimmung wurden die Varianten FDH 5 und 6 zusammen-gefaßt, da eine Unterscheidung nicht immer eindeutig herbeizuführen war.

Die Enzymvarianten FDH 5 und 6 sind artspezifisch für die Winterlinde, die Varianten FDH 1, 2 und 4 für Sommerlinde.

MDH – Malatdehydrogenase

Abb. 4.7 Zymogramme und schematische Darstellung für das Enzymsystem MDH mit Bezeichnung der Enzymvarianten für die Genorte MDH-B, -C und –D.

MDH

Das dimere Enzymsystem MDH besitzt bei der Linde mindestens vier Genorte. Die Zone(n) oberhalb der gestrichelten Linie in Abb. 4.7 zeigten keine auswertbare Variation. Obwohl es sich vermutlich um mindestens zwei Genorte handelt, die Interlocushybridbänder bilden, wird dieser Bereich als A-Zone definiert. Für die genetische Analyse wurde bei dem Enzymsystem MDH nur der Genort MDH-D verwendet, da auch die variablen Genorte MDH-B und –C In-terlocushybridbänder bilden und eine Identifizierung der Genotypen B12 und B22, bzw. C12 und C22 nur anhand von Intensitätsunterschieden möglich ist. Wenn aus Blatt- oder Knospengewebe Enzyme extrahiert wurden, ist eine Unterscheidung unproblematisch (s. Abb.

4.7) und die Enzymmuster in den Nachkommen der betreffenden Linden bestätigten die

kor-gershausen war eine Bestimmung der Enzymvarianten in den Zonen MDH-B und –C mög-lich. Bei Samen waren diese Intensitätsunterschiede dagegen weniger stark ausgeprägt. Da auf eine mit Unsicherheiten belastete Identifizierung der Varianten zu verzichten wurde, gehen die Genorte deshalb nur über einen Mustervergleich in die Bestimmung von Selbstbefruch-tungsraten und Polleneltern ein. Alle drei Genorte weisen jeweils zwei Enzymvarianten und keine artspezifischen Allele auf.

MNR – Menadionreduktase

Abb. 4.8 Zymogramme und schematische Darstellung für das Enzymsystem MNR mit Bezeichnung der Enzymvarianten.

MNR

A Zone

A11 A12 A22 A13 A33 A34

Nach Anfärbung auf das tetramere Enzymsystem MNR wurde eine Zone mit vier Enzymvari-anten sichtbar. Dabei erwiesen sich die EnzymvariEnzymvari-anten MNR 3 und 4 artspezifisch für Win-terlinde und die Varianten MNR1 und 2 für Sommerlinde.

PGI – Phosphogluco-Isomerase

Abb. 4.9 Zymogramme und schematische Darstellung für das Enzymsystem PGI mit Bezeichnung der Enzymvarianten für die Genorte PGI-B und –C.

PGI

Die A-Zone des Enzymsystems PGI (in Abb. 4.9 nicht abgebildet) deutete eine Variation der Enzyme an, die jedoch aufgrund der Unschärfe der Muster nicht ausgewertet werden konnte.

Dagegen sind die Muster der Genorte PGI-B und –C klar und, nach anfänglichen Schwierig-keiten, sehr gut auszuwerten. Die anfänglichen Schwierigkeiten waren begründet durch die Bildung von Interlocushybridbänder zwischen den Genorten PGI-B und –C sowie der Exis-tenz eines Nullallels am Genort PGI-C, dessen als C2 bezeichnetes Enzym sich phänotypisch nur über Intra- und Interlocushybridbänder auf dem Zymogramm nachweisen läßt. Für die Winterlinde konnten bislang für den Genort PGI-B drei und für PGI-C zwei Enzymvarianten entdeckt werden.

Unter den Enzymvarianten der Sommerlinde wurden gänzlich andere Muster gefunden (ohne

PGM - Phosphglucomutase

Abb. 4.10 Zymogramme und schematische Darstellung für das Enzymsystem PGM mit Bezeichnung der Enzymvarianten für die Genorte PGM-A, –B, -C und –D.

PGM

Für die Winterlinde konnten beim monomeren Enzymsystem PGM vier Genorte ausgewertet werden. Dabei zeigten sich für die Zonen A und –C je zwei Enzymvarianten, für PGM-B und –C je drei. Die Enzymvariante PGM-D1 ist ein für die Sommerlinden artspezifisches Enzym. Die drei in der Abb. 4.10 ganz rechts zu sehenden Muster sind Enzymvarianten der Sommerlinde, welche teilweise mit denen der Winterlinde identisch, zum Teil artspezifisch sind. Das vierte Zymogramm von links ist eine Hybride; neben typischen Enzymvarianten der Winterlinde besitzt es auch die Variante D1, welche artspezifisch für die Sommerlinde ist. Für

die meisten artspezifischen Enzyme der Sommerlinde erfolgte noch keine Benennung; dazu bedarf es einer speziell auf die Vererbungsanalyse der Sommerlinde abgestimmten Untersu-chung.

SKDH - Shikimatdehydrogenase

Abb. 4.11 Zymogramme und schematische Darstellung für das Enzymsystem SKDH mit Bezeichnung der Enzymvarianten für den Genort SKDH-B

SKDH

B A

B34 B44 B24 B23 B33 B47 B16

B14

B

B34 B33 B44 B44

Zone

Anfänglich wurde bei dem monomeren Enzymsystem SKDH auch die A-Zone für die popula-tionsgenetische Analyse und die Bestimmung von Selbstbefruchtungsrate und Polleneltern eingesetzt. In den Nachkommenschaften einzelner Winterlinden traten jedoch Unstimmigkei-ten auf, die bis zum Abschluß der Laborphase ungeklärt blieben. Der Genort SKDH-B ent-schädigt dafür mit einer großen Variation von sieben Enzymen, von denen die Varianten 1 bis 4 artspezifische Enzyme der Winterlinde und die Varianten 5 bis 7 artspezifisch für

Sommer-der Zymogramme. Erst nach Untersuchung zahlreicher Nachkommenschaften wurde heraus-gefunden, daß ein homozygot vorliegendes Enzym als Doppelbande erscheint und daß bei Heterozygoten, je nach Wandergeschwindigkeit der Enzyme, Dreifach- oder Vierfach-Bänder zu sehen waren. Zusätzlich erschwert wurde die Interpretation der Zymogramme durch die entgegengesetzte Intensität der Doppelbänder: Bei Verwendung von Blatt- oder Knospenge-webe stellt sich bei den Enzymen das untere Band als Hauptband und das obere als Neben-band dar; bei den Samen verhält es sich genau umgekehrt (s. Abb. 4.2!).