Inhibitoren des Proteasoms

Inhibitoren des Proteasoms sind essentiell zur Untersuchung des proteolytischen Mechanismus des Proteasoms, die allgemeine Funktionsweise des gesamten Ubiquitin-Proteasom-Systems, dessen Substrate und davon abhängige biologische Prozesse. Die heute bekannten Einflüsse auf biologische Systeme legt die Verwendung von Inhibitoren des Proteasoms als Medikamente in verschiedenen Bereichen nahe.

Biologische Effekte von Proteasom-Inhibitoren. Inhibition des Proteasoms führt zu zahlreichen Veränderungen in der Zelle.^[69] Werden Zellen bereits kurzzeitig Proteasom-Inhibitoren ausgesetzt, führt dies zur Akkumulation von geschädigten oder fehlgefalteten

Proteinen und einer heat shock response. Außerdem kommt es zu einer Induktion von Genen, die Proteasom-Untereinheiten kodieren. Werden Zellen länger einer Proteasom-Inhibition ausgesetzt, wird deren Zelltod durch Apoptose induziert. Hierbei ist auffällig, dass sich stark vermehrende Zellen besonders empfindlich auf Proteasom-Inhibitoren reagieren. Die Induktion der Apoptose durch Proteasom-Inhibition wird auf die Stabilisierung des Tumorsuppressors p53 oder die Unterdrückung einer Aktivierung von NF-NB zurückgeführt.

NF-NB ist ein potenter Inhibitor der Apoptose, wobei dessen Suppressor INBD ein Substrat des Proteasoms darstellt.^[75] Velcade^® (Millenium Pharmaceuticals, Inc. And Johnson &

Johnson Pharmaceutical Research, L.L.C.) ist das erste Medikament, dessen Wirkung auf einer Inhibition des Proteasoms beruht.^[75] Es wird zur Behandlung von Multipler Myeloma eingesetzt und der Einsatz gegen weitere Formen von Krebs wird untersucht. Bei dem Wirkstoff handelt sich um die Dipeptidboronsäure Bortezomib (41, Abb. 23).

Selektive Inhibition der Untereinheiten E1,E2 bzw. E5 . Obwohl das 20S-Proteasom mehrere aktive Zentren besitzt, kann dessen Aktivität signifikant reduziert werden, ohne jedes einzelne Zentrum zu inhibieren.^[69] Tatsächlich führt gewöhnlich schon die Inhibition oder Mutation der E5-Untereinheit (CL) eine starke Reduktion der Geschwindigkeit des Proteinabbaus herbei, auch derjenigen durch die E1- oder E2-Untereinheiten bevorzugt katalysierten Umsetzungen (PGPH, TL). Umgekehrt gilt dies nicht. Weiterhin sind die meisten Inhibitoren des E5-Zentrums aufgrund dessen CL-Aktivität stärker hydrophobe Substanzen und daher auch verstärkt zellpermeabel, im Gegensatz zu den Inhibitoren mit geladenen Resten der beiden anderen Zentren. Aufgrund der Hierarchie der proteolytischen Zentren sowie der relativ leichten Überführung von Inhibitoren der E5-Untereinheit ins Zellinnere zielt die Inhibition des Proteasoms oftmals auf eine Inhibition des CL-aktiven Zentrums ab. Ob synthetischen oder natürlichen Ursprungs, die meisten der bekannten Proteasom-Inhibitoren interagieren vor allem mit der E5-Untereinheit und haben für gewöhnlich wesentlich schwächere Effekte auf andere Zentren. Es werden jedoch auch andere Beispiele berichtet.

Unselektive Proteasom-Inhibitoren. Es existieren verschiedene Inhibitoren für das Proteasom, zu welchen letztlich auch der Calpain-Inhibitor I (36) zählt (IC50 (CL) = 15 PM, IC50 (PGPH) = 45 PM,^[76] Abb. 22). Dieser und andere Inhibitoren dieser Art hemmen das Proteasom jedoch unselektiv und sind ursprünglich Inhibitoren von Serin- und Cystein-Proteasen. Der Calpain-Inhibitor I war einer der ersten Inhibitoren des Proteasoms. Er diente im Wesentlichen zur Erforschung dessen Proteolyse-Eigenschaften. Im Komplex mit dem Proteasom nimmt er eine ausgedehnte Konformation ein. Er besetzt einen Spalt zwischen

E-Faltblättern in der jeweiligen Untereinheit. Dabei handelt es sich um die Taschen S1-S3.

Die drei Seitenketten des Inhibitors bilden folgende Wechselwirkungen zu ihrer Umgebung:

die Seitenkette des Norleucins mit der inhibierten Untereinheit, das terminale Leucin mit der benachbarten Untereinheit und das mittlere Leucin weist aus der aktiven Tasche heraus. Der Aldehyd ist als Hemiacetal an das katalytische Thr1 gebunden (Abb. 25A). Der Inhibitor bindet in einer ausgestreckten Konformation als Hemiacetal an Thr1O^J in eine durch eine Schleife von zwei E-Faltblättern ausgeprägte Tasche. Wie von ihrer oft peptidischen Gestalt zu erwarten, dehnen sich mit Ausnahme von Homobelactosin C alle bekannten Inhibitoren wie der Calpain-Inhibitor I in Richtung der S-subpockets aus.

Tripeptidaldehyde. Der Mangel an Spezifität von Calpain-Inhibitor I konnte durch einige Modifikationen in seiner Struktur verringert werden. Als Beispiel dafür sei Aldehyd MG132 (37, Abb. 22) genannt, der zehnmal selektiver vs. Calpain und wesentlich potenter (IC50 <

1.0 μM) hinsichtlich des Proteasoms ist.

NH

HN

NH O

O

O

36 Calpain-Inhibitor I

O N

H

HN

NH O

O

O

37 MG132

O O

HN

NH O

O

O NH O

NH O₂NN

NH₂ NC

HN

NH O

O

O NH O

N H O₂NN

NH₂ N

O

O

7

38 IC₅₀ = 0.02 μM

R = H, Ki = 12 nM

R = NHSO₂Ph, Ki = 1.1 nM R = NHCO₂tBu, Ki = 2.2 nM R = NH₂,Ki = 67 nM

R

39a₁ 39b 39c 39d

Abb. 22. Tripeptidaldehyde und D-Ketoamide als Inhibitoren des Proteasoms. Die angegebenen Aktivitäten sind CL-Aktivitäten.

Peptidische Aldehyde sind in einem hohen Maße zellpermeabel und binden reversibel als Hemiacetal an Thr1. Ihr Nachteil besteht in ihrer hohen Reaktivität. In Zellen können sie schnell zu inaktiven Säuren oxidiert werden. Alternativ wurden daher stabilere Ketone wie 38 und 39a-d entwickelt.^[77,78] 38 und 39bkönnen bei Konzentrationen < 1 μM die TL-Aktivität nicht inhibieren, erweisen sich jedoch als aktiv gegen die CL-Aktivität und mehr als hundertfach selektiver gegenüber Calpain I.

Peptidboronsäuren. Wenngleich das Boronsäure-Analogon MG262 (40, Abb. 23) von MG132 als Inhibitor des Proteasoms etwa hundertfach potenter als dieser ist (Ki = 18 pM), weisen bereits Peptidboronsäuren, aufgebaut aus nur zwei Aminosäuren (Bortezomib, 41), eine Inhibition von K_i< 1 nM auf. Da auch eine höhere Selektivität und praktische Vorteile wie Löslichkeit und Membranpermeabilität gegeben sind, besitzt diese Gruppe der Proteasom-Inhibitoren ein hohes Potential zur therapeutischen Anwendung.

Das p-Orbital des Boratoms interagiert mit dem einsamen Elektronenpaar des Sauerstoffs der Hydroxygruppe aus Thr1 (Abb. 25B). Die Bindung ist zwar reversibel, die Dissoziationsrate aber so niedrig, dass die Inhibition tatsächlich für Stunden irreversibel ist. Das Konzept der

„Retro-Sequenz“ wurde in Boronsäure 42(IC₅₀ (CL) = 53 μM) verwirklicht.^[76]

B OH OH N N

O N HN O

O

N

N N

H

N B

OH OH

O O

41Bortezomib

O N

H

HN

NH B O

O

O

40 MG262

OH OH

42

Abb. 23. Peptidboronsäuren als Proteasom-Inhibitoren.

Peptidvinylsulfone und -vinylester. Einige peptidische Vinylsulfone sind Proteasom-Inhibitoren und reagieren irreversibel mit dem active site-Threonin. Die Vinylsulfongruppe erfährt im aktiven Zentrum durch Wasserstoffbrücken eine zusätzliche Aktivierung und wird von Thr1O^J als Michael-Akzeptor angegriffen (Abb. 25C). In Abwesenheit bestimmter Enzyme sind diese Inhibitoren relativ inert, weisen aber einen Mangel an Spezifität auf und hemmen ebenso Cystein-Proteasen, für deren Inhibition sie ursprünglich entwickelt wurden.

Ein Beispiel höherer Selektivität ist NLVS (43, Abb. 24), das man erhält, wenn die Z-Schutzgruppe im Vinylsulfon-Analogon von MG132 gegen eine 3-Nitro-4-hydroxy-5-iodphenylacetyl-Gruppe ausgetauscht wird. Die Selektivität des Inhibitors wird durch den Peptidrest gesteuert.

Eine analoge Reaktivität wird auch im Fall von Vinylestern wie 44 angewendet.^[79] Ester 44 ist hochpotent und zeigt eine gewisse Selektivität zwischen den einzelnen Untereinheiten (IC50 (CT) = 1.83 μM, IC50 (TL) = 0.095 μM, IC50 (PGPH) > 10 μM) sowie anderen Proteasen.

NH

HN

NH S

H₂N O O

O O

N O

NH

HN

NH S

H₂N O O

O H O

N

OH O

NH

HN

NH O

O

O

43 NLVS I

HO

NO₂

S O

O N

H

HN

NH O

O

O

O O

O NH₂ Br

44

O O

O O

45 46

NH NH H₂N

Abb. 24. Irreversible Proteasom-Inhibitoren: Vinylsulfone 43,45 und 46 sowie Vinylester 44.45 ist E2-selektiv, 46 inhibiert auch E1 und E5.

Vinylsulfon 45 inhibiert nur die TL-Aktivität (E2).^[80] 45 kann selbst bei einer Konzentration von 100 μM die Zentren E1 und E5 nicht besetzen. In Vinylsulfon 46 befinden sich andere Reste P3 und P4 bei sonst gleicher Struktur. 46 kann zwischen den Untereinheiten nicht unterscheiden und inhibiert unselektiv E1, E2 und E5. Dies zeigt, dass selbst vom aktiven Threonin entfernte Zentren starken Einfluss auf die Spezifitäten der Untereinheiten besitzen.

HN

O H O

H₃N O

Proteasom N

H B

HO OH

O

NH₃

O

Proteasom

NH S

O O O

Proteasom H₂N O

A B C

Abb. 25. Wechselwirkung der Inhibitoren mit den katalytischen Threoninen im Proteasom. A) Aldehyd, B) Boronsäure, C) Vinylsulfon.

Epoxyketone. Epoxomicin 47 und Eponemycin 48 sind natürliche D-Ketoepoxide aus einem Stamm von Actinomyceten (Abb. 26). Sie inhibieren das Proteasom mit der höchsten bekannten Selektivität. Die Kristallstruktur des Hefe-20S-Proteasoms, komplexiert mit Epoxomicin, lässt einen Morpholinring zwischen dem aktiven Thr1 und dem Epoxyketon erkennen (Abb. 26, III, Abb. 27). Der Sechsring entsteht unter Angriff des N-terminalen Threonins mit seiner Hydroxygruppe auf die Carbonylfunktion (I) sowie durch die

Ringöffnung anhand des nukleophilen Angriffs der Aminfunktion des Threonins auf das Epoxid (II).

N N

H

HN

NH O

O

O

O

O O

OH 47 Epoxomicin

HN

NH O

O O

O OH

48 Eponemycin

OH

HO H₂N

HN O

Proteasom H

O H

NH O

O H₂N

O N

H O

HN NH

OH OH O

HN Proteasom NH

O O

O

Proteasom H

I II III

Abb. 26. Epoxyketone47 und 48 als Proteasom-Inhibitoren und ihr Bindungsmechanismus mit Thr1.

Dieser besondere Mechanismus erklärt die hohe Spezifität der Epoxyketone. Aufgrund des Fehlens eines freien benachbarten N-Terminus zur nukleophilen Gruppe in Cystein- oder Serin-Proteasen ist eine analoge Reaktion dort nicht möglich. Während Epoxomicin vor allem mit dem CL-aktiven Zentrum reagiert, unterscheidet Eponemycin nicht zwischen den verschiedenen Zentren.

E-Lactone.Lactacystin (49, Abb. 28A) ist ein Metabolit aus Streptomyceten. Im neutralen bis leicht basischen Medium wird es spontan in ein clasto-Lactacystin-E-lacton (Omuralide) überführt. Im Gegensatz zu Lactacystin sind Zellmembranen permeabel bezüglich des E-Lactons. Dieses E-Lacton ist die eigentliche aktive Komponente, reagiert mit Thr1 in den aktiven Zentren und liegt als Ester gebunden vor (Abb. 28A).

Hierbei inhibiert es bevorzugt die E5-Untereinheit, die beiden anderen Untereinheiten nur mit geringer Geschwindigkeit. Der Grund dafür liegt in den Abweichungen der S1-Taschen jener Untereinheiten.

A

C B

Abb. 27. A) Epoxomicin (47, orange) gebunden an das katalytische Thr1 (gelb) in der E5-Untereinheit (solid ribbon, blau) (PDB: 1G65). B) Epoxomicin in der aktiven Tasche der E5-Untereinheit.

GaussConolly Oberfläche (MOE 2005.06). Blaue Oberfläche: hydrophil, grüne Oberfläche: hydrophob.

C) Morpholinring gebildet aus dem Epoxomicin (orange) und Thr1 (gelb).

Durch die Isopropyl-Seitenkette des E-Lactons wird ein Valin oder Leucin imitiert. Diese Seitenkette kann mit der Aminosäure Met45 wechselwirken. Im Fall von E oderE2 ist dies nicht möglich, durch polare Seitenketten wird die Verweilzeit des E-Lactons am aktiven Zentrum verkürzt und eine Reaktion mit Thr1 unwahrscheinlicher. Die Inhibition durch das E -Lacton wird als irreversibel betrachtet, der J-Lactamring verdrängt ein zur Abspaltung des Esters notwendiges Wassermolekül an Thr1. Langsame Hydrolyse des Inhibitor-Enzym-Adduktes kann jedoch durchaus erfolgen (t_1/2 = 20 h). Lactacystin ist ein wesentlich selektiverer Inhibitor als z.B. die Peptidaldehyde, aber auch viel weniger stabil.

Homobelactosin C (50, Abb. 28B) gehört ebenfalls zur Gruppe der E-Lactone.^[81] Es handelt sich dabei um ein Derivat des Naturstoffes Belactosin C aus Streptomyceten.

Homobelactosin C inhibiert selektiv die CL-Aktivität (E5) des Proteasoms. Omuralide bzw.

Homobelactosin C besetzen mit ihrem Isopropyl- bzw. Butylrest die Tasche S1 (Abb. 28C).

Mit seinen anderen Resten füllt Homobelactosin C jedoch die Taschen der S’-Seite, während sich alle weiteren Inhibitoren mit bekannter Kristallstruktur in die S-Taschen fortsetzen.

NH O

OH O

S OH

NH O O HO

49 Lactacystin

-NAcCys NH

O

OH

O O

clasto-Lactacystin-E-Lacton (Omuralide)

Proteasom-Thr1

NH O

OH O O

OH

HN H₂N

O Proteasom Ester-Addukt

HN H

N N O H

O

O O O O

O O

50 Homobelactosin C

A

B C

Abb. 28. A) Reaktion von Lactacystin 49 zum clasto-Lactacystin-E-lacton und Ringöffnung durch das Proteasom. B) Struktur von Homobelactosin C. C) Homobelactosin C (50, orange) besetzt mit dem sek-Butylrest die S1-Tasche, der Rest des Moleküls füllt die S’-Taschen (PDB: 2FNY). GaussConolly Oberfläche (MOE 2005.06). Blaue Oberfläche: hydrophil, grüne Oberfläche: hydrophob, graue Oberfläche: exponiert.

Genannt werden sollen auch E-Lactame des Typs von Verbindung 51 (Abb. 29).^[82] Es handelt sich hierbei um Inhibitoren der E5-Untereinheit (IC50 (CL) = 20 nM). Massenspektrometrisch wurde eine kovalente Bindung zu dieser Untereinheit nachgewiesen, und ein ähnlicher Bindungsmechanismus mit Thr1 wie im Fall der E-Lactone liegt nahe.

TMC-95A – ein nicht-kovalent bindender Inhibitor. Eine Reihe von Verbindungen TMC-95 aus Apiospora montagnei besitzt gegenüber der E5-Untereinheit des Proteasoms eine inhibierende Aktivität im niederen nanomolaren Bereich (IC₅₀ (CL) = 2.3 nM), inhibiert jedoch auch die TL- und PGPH-Aktivität. Die Wirkung von TMC-95A (52, Abb. 29) beruht im Gegensatz zu anderen Inhibitoren nicht auf seiner Modifikation durch das N-terminale Threonin selbst, sondern auf zahlreichen Wasserstoffbrücken, die zwischen TMC-95A und den aktiven Zentren des Proteasoms gebildet werden.

O N H

HN O

O

NH O

NH O 51

NH

HO NH

HO

NH

O

O NH

O CH₃

H OH O

NH O

CONH₂

O

CH₃ CH₃

52 TMC-95A

Abb. 29.E-Lactam 51 und TMC-95A 52.51 gilt als kovalenter Inhibitor. 52 bindet nicht-kovalent an die aktive Tasche des Proteasoms.

Die Anordnungen im Komplex mit dem Proteasom sind ähnlich wie bei den Aldehyd-Inhibitoren. Die Propylen-Seitenkette reicht in die S1-Tasche, die Asparagin-Seitenkette des Inhibitors ragt weit in die S3-Tasche was die unterschiedlichen Selektivitäten in Hinsicht auf die einzelnen aktiven Untereinheiten im Proteasom erklärt. Aufgrund der Ringspannung in TMC-95A kommt dieses in gebundenem Zustand in der gleichen Konformation wie im ungebunden vor, wodurch dieser bei Komplexierung des Proteasoms keine Einschränkung in den inneren Freiheitsgraden erfährt.

Richtlinien zur Synthese von Proteasom-Inhibitoren. Nicht-kovalent bindende Inhibitoren wie TMC-95A erscheinen für eine medizinische Anwendung besonders interessant, da sie aufgrund einer reversiblen Bindung möglicherweise weniger zytotoxisches Potential besitzen könnten. Prinzipiell können jedoch auch kovalent bindende Inhibitoren reversibel mit dem Proteasom verknüpft sein.

Es existiert eine Anzahl von Tripeptid-Inhibitoren, die eine gute Selektivität bezüglich des Proteasoms und dessen Untereinheiten besitzen. Diese Sequenzen können je nach Anforderung in weiteren Entwicklungen übernommen bzw. darauf aufgebaut werden.

Hierüber lässt sich weitgehend die Zellgängigkeit der Inhibitoren bestimmen.

Im Dokument Synthese von beta-Sekretase- und Proteasom-Inhibitoren (Seite 35-43)