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Synthese von beta-Sekretase- und Proteasom-Inhibitoren

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Derivatisierung von Peptidaldehyden

Vom Fachbereich Chemie der Technischen Universität Darmstadt

zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktor-Ingenieurs (Dr.-Ing.)

genehmigte Dissertation

eingereicht von

Dipl.-Ing. Hannes Braun aus Pforzheim

Berichterstatter: Prof. Boris Schmidt

Mitberichterstatter: Prof. Harald Kolmar, Prof. Peter-Michael Kloetzel Tag der Einreichung: 26.04.2007

Tag der mündlichen Prüfung: 11.06.2007

Darmstadt 2007

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Bereitschaft zur Diskussion und die nützlichen Anregungen ganz unterschiedlicher Art. Von den vielen Möglichkeiten, die ich als Doktorand hatte, möchte ich mich vor allem für diejenige des Aufenthalts am Trinity College Dublin bedanken.

Gregor Larbig möchte ich für seine Hilfsbereitschaft, die angenehme Atmosphäre im Labor

und die interessanten Diskussionen danken. Daniel Kieser und Stefanie Baumann möchte ich für ihren steten Einsatz für die ganze Gruppe danken. Mein Dank gilt ihnen als auch Verena

Reeg für die kritische und gewissenhafte Korrektur dieser Arbeit. Mahesh Shioorkar, Ali Taghavi, Sumaira Umbreen, Rajeshwar Narlawar, Andrea Zall, Nicole Hoettecke, Frau B. Keenan und allen, die in den letzten Jahren für einige Zeit in der Gruppe mitgearbeitet haben,

danke ich für die das gute Arbeitsklima und die anregenden Gespräche.

Dr. D. G. Lloyd vom Trinity College Dublin und seinen Mitarbeitern Dr. A. Knox und Yang Yidong möchte ich für die freundliche Aufnahme in ihren Arbeitskreis und ihre Unterstützung

danken.

PD Dr. R. Meusinger danke ich für sein Interesse an den analytischen Problemstellungen

meiner Arbeit und seine Hilfsbereitschaft.

Prof. Dr. P.-M. Kloetzel, Dr. U. Kuckelkorn und Prof. Dr. Michael Groll von der

Medizinischen Fakultät der Humboldt-Universität zu Berlin, Universitätsklinikum Charité danke ich für die sehr angenehme und erfolgreiche Zusammenarbeit.

Prof. Dr. L. Marinelli und Dr. V. Limongelli von der Università di Napoli “Federico II” danke

ich für ihr Interesse, ihre Unterstützung und Vorschläge sowie die sehr gute Kooperation.

Dr. M. Brockhaus von der Firma Hoffmann-La Roche danke ich für die Tests meiner

Substanzen in verschiedenen BACE-Assays.

Meinen Praktikanten zur Nebenvertiefung möchte ich für ihr Interesse an meiner Arbeit und ihren Einsatz danken.

Mein besonderer Dank gilt meinen Eltern für ihre Unterstützung während meines gesamten Studiums.

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Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis i Verbindungsverzeichnis ii Abkürzungsverzeichnis iv 1 Einleitung 1 1.1 Die E-Sekretase 2

1.1.1 Die E-Sekretase als Target zur Behandlung des Morbus Alzheimer 4

1.1.2 E-Sekretase-Inhibitoren 7

1.2 Das Proteasom 17

1.2.1 Inhibitoren des Proteasoms 21

1.3 Aufgabenstellung 29

2 Allgemeiner Teil 31

2.1 BACE- und Proteasom-Inhibitoren: Die Zielstrukturen 31

2.2 Synthesen 36

2.2.1 Synthese von Peptidaldehyden 36

2.2.2 E-Iod- und E-Diiodhydrine aus Aldehyden 40

2.2.3 Synthese von BACE-Inhibitoren über E-Iodhydrine 49

2.2.4 Reduzierte Amide 56

2.2.5 Synthese eines (4-Amino-6-carboxyl)-indols 57

2.2.6 D-Ketoamide durch Passerini-Reaktion und Oxidation 59

2.2.7 Studien zur Synthese von Epoxomicin-Analoga 59

2.2.8 Weitere Synthesen 63

2.3 Biologische Daten der Inhibitoren 64

2.3.1 Potentielle BACE-Inhibitoren 64

2.3.2 Potentielle Proteasom-Inhibitoren 68

2.4 Zusammenfassung 70

2.5 Schlussfolgerungen und Ausblick 71

3 Experimenteller Teil 75 3.1 Allgemeine Anmerkungen 75 3.2 Allgemeine Arbeitsvorschriften 76 3.3 Synthesen 80 4 Literaturverzeichnis 141 5 Anhang 146

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Verbindungsverzeichnis

Es sind die Produkte (fett gedruckte Nummern) mit der entsprechenden Seitenzahl im Experimentellen Teil aufgelistet.

Produkt: Seite: (S,R)-7 121 (S,S)-7 120 37 85 63 101 64 139 69 80 70 80 71 81 72 81 73 82 74 82 75 83 76 83 77 84 78 84 79 86 80 87 81 88 82 86 83 87 84 88 85a 89 85b 89 85c 89 85d 90 85e 90 86a 91 86b 91 88 92 89a 93 89b 94 89c 96 89d 98 90a 93 90b 95 90c 96 90d 98 91a 94 91b 95 91c 97 91d 98 92 99 93 100 (S,R)-94 101 (S,S)-94 101 (S,R)-95 102 (S,S)-95 102 (S,R)-96 104 (S,S)-96 104 (S,R)-97 105 (S,S)-97 105 98 106 99 103 (S,S)-99 103 101 106 103 107 104 108 105 108

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108 109 109 109 110 110 111 110 (S,R)-112 111 (S,S)-112 111 113 112 (S,R)-114 113 (S,S)-114 113 115 114 116 114 (S,R)-117 115 (S,S)-117 115 118 116 119 117 (S,R)-125 118 (S,S)-125 117 126 119 127 119 128 120 133 122 134 122 135 123 137a 124 137b 126 138a 124 138b 126 139a 125 139b 127 140a 125 140b 127 141 128 143 128 144 129 145 129 146 130 147 130 148 131 149 132 152 132 153 133 154 134 155 134 156 135 160 137 161 136 162 136 163 136 164 138 166 139 167 140

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Abkürzungsverzeichnis aa Aminosäure AE          Amyloid-E-Peptid Abb. Abbildung abs. absolut Ac Acetyl AD Alzheimerkrankheit AMC 7-Amino-4-methylcoumarin ApoE Apolipoprotein E APP amyloid precursor protein Ar Aromat

ATP Adenosintriphosphat

BACE E-site amyloid precursor protein cleaving enzyme

Bn Benzyl

Boc tert-Butyloxycarbonyl

BrAAP branched chain amino acid preferring BSA bovine serum albumin

CatD Cathepsin D

CHO Chinese hamster ovary cells CL chymotrypsin-like d Dublett DABCO 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octan DC Dünnschichtchromatographie de Diastereomerenüberschuss DIPEA Diisopropylethylamin DMADMF Dimethoxy-N,N-dimethylmethanamin DMF N,N-Dimethylformamid DMSO Dimethylsulfoxid

d.r. Verhältnis der Diastereomere ds Diastereoselektivität

EA Elementaranalyse

EDAC 1-Ethyl-3-(3´-dimethylaminopropyl)carbodiimid˜HCl EE Essigsäureethylester

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EI Elektronenstoßionisation Elan Elan Pharmaceuticals, Inc. eq. Äquivalent/e

ESI Elektrosprayionisation Et Ethyl

FRET fluorescence resonance energy transfer ges. gesättigt

Glaxo GlaxoSmithKline H Hexan

halbges. halbgesättigt

HEK human embryonic kidney cells

HFIPA 1,1,1,3,3,3-Hexafluoropropan-2-yl-acrylat HOBt N-Hydroxybenzotriazol˜H2O

3-HQD 3-Hydroxychinuclidin

HPLC high performance liquid chromatography HSQC heteronuclear single quantum correlation IBX 2-Iodoxybenzoesäure

IC50 Konzentration des Inhibitors, welche die halbe Aktivität des Proteins bewirkt

J Kopplungskonstante

Ki Dissoziationskonstante konz. konzentriert

LC liquid chromatography

LMP low molecular weight proteins

logP dekadischer Logarithmus des Verteilungskoeffizienten

M Molekül m Multiplett

MCPBA 3-Chlorperbenzoesäure Me Methyl

MS Massenspektrometrie MSD Merck Sharp & Dome NFT neurofibrillary tangles NMR nuclear magnetic resonance NOE nuclear Overhauser effect

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PDB protein data bank PG Schutzgruppe

PGPH post glutamyl peptide hydrolyzing Ph Phenyl Pr Propyl q Quartett quant. quantitativ R Rest Ref. Referenz Rf Retentionsfaktor

RLBA radioligand binding assay RT Raumtemperatur

s Singulett

SNAAP small neutral amino acid preferring Suc Succinimid t Triplett TEMPO 2,2,6,6-Tetramethylpiperidinyloxid TFA Trifluoressigsäure THF Tetrahydrofuran TL trypsin-like TMS Tetramethylsilan

TPSA topological polar surface area Tween Polyoxyethylensorbitanmonolaurat X Halogen Z Benzyloxycarbonyl            DD        spezifischer Drehwert E-ICD E-Isocupreidin G           chemische Verschiebung

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Verzeichnis der Aminosäuren A Ala Alanin C Cys Cystein D Asp Asparaginsäure E Glu Glutaminsäure F Phe Phenylalanin G Gly Glycin H His Histidin I Ile Isoleucin K Lys Lysin L Leu Leucin M Met Methionin N Asn Asparagin P Pro Prolin Q Gln Glutamin R Arg Arginin S Ser Serin T Thr Threonin V Val Valin W Trp Tryptophan Y Tyr Tyrosin

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1 Einleitung

Fast ein Drittel der 50 weltweit meistverkauften Medikamente sind Enzym-Inhibitoren.[9] Enzym-Inhibition stellt damit eine wichtige Strategie in der Entwicklung von Wirkstoffen dar. Die Unterteilung von Enzymen erfolgt in sechs Klassen: Oxidoreduktasen, Transferasen, Hydrolasen, Lyasen, Isomerasen und Ligasen. Eine Unterklasse zu den Hydrolasen bilden die Peptidasen. Zu diesem Begriff synonym gebraucht werden die Bezeichnungen Peptid-Hydrolase oder Protease.[10] Die Peptidasen lassen sich in zwei weitere Kategorien unterteilen. Exopeptidasen spalten kurze Peptide oder Aminosäuren am Ende eines Polypeptids, während Endopeptidasen Schnittspezifitäten innerhalb eines Proteins aufweisen. Eine Gliederung der Endopeptidasen erfolgt nach ihrem Proteolyse-Mechanismus. Man unterscheidet Serin-, Cystein-, Aspartat-, Metallo- und Threonin-Endopeptidasen sowie eine Reihe von Endopeptidasen, die sich keiner dieser Gruppen zuordnen lassen. Das aktive Zentrum (active

site) besteht aus dem eigentlichen katalytischen Zentrum, das von verschiedenen subsites

umgeben ist. Diese Taschen werden nach einem Vorschlag von Schechter und Berger[11] ausgehend von den katalytischen Aminosäureresten der active site mit S1 bis Sn in Richtung des N-Terminus und mit S1’ bis Sn’ in Richtung des C-Terminus des Substratproteins nummeriert. Analog erfolgt die Benennung der Reste des Substrats bzw. der Inhibitoren des Enzyms von P1 bis Pn und P1’ bis Pn’.

Die E-Sekretase und das 20S-Proteasom gehören zu den Peptidasen. Während es sich bei der E-Sekretase um eine Aspartylprotease handelt, bildet das Proteasom den einzigen Vertreter aus der Gruppe der Threonin-Proteasen.[10] Die beiden Enzyme unterscheiden sich in ihrem Vorkommen und besitzen weitgehend unterschiedliche Substrate: Erwartungsgemäß konkurriert die E-Sekretase stärker mit anderen Aspartylproteasen und Proteasom-Inhibitoren hemmen häufig auch Serin- oder Cystein-Proteasen. Auch hinsichtlich einer Anwendung als Target in der Medizinalchemie lassen sich nur wenige Ähnlichkeiten finden. Während eine Inhibition der E-Sekretase zur Behandlung des Morbus Alzheimer dienen soll, wird ein Inhibitor des Proteasoms derzeit in der Krebstherapie erfolgreich angewendet. Da das Proteasom aber eine zentrale Rolle im intrazellulären Proteinabbau spielt, wird ein Zusammenhang mit zahlreichen Krankheiten vermutet. Eine Beteiligung an neurodegenerativen Krankheiten wird diskutiert und gilt in einigen Beispielen als erwiesen.[12] Die Inhibitoren der beiden Proteine lassen sich jedoch oftmals auf Peptidaldehyde als Syntheseintermediate zurückführen.

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1.1 Die E-Sekretase

Die E-Sekretase wird als eines von mehreren Targets zur Behandlung des Morbus Alzheimer untersucht. Im Folgenden soll eine Einführung zu Merkmalen der Alzheimerschen Krankheit, Theorien über Ursachen und daraus folgenden möglichen Therapieansätzen gegeben werden. Es wird schließlich auf die E-Sekretase und ihre Inhibitoren eingegangen.

Der Morbus Alzheimer - Ursachen und Symptome. Die Alzheimer-Demenz (AD) ist eine fortschreitende, neurodegenerative Krankheit des Gehirns.[13] Charakteristische Merkmale sind verschiedene kognitive Symptome (z.B. Gedächtnisverlust, Desorientierung, Verwirrung) und Verhaltensauffälligkeiten (z.B. Schlaflosigkeit, Depressionen, Angstzustände, Unruhe). Die Alzheimerkrankheit verläuft immer tödlich.[14] Begleitet wird die Krankheit von extraneuronalen Amyloid-Plaques und intrazellulären Neurofibrillen (neurofibrillary tangles, NFTs), die post mortem in Gehirnen von Alzheimerpatienten gefunden werden.[15]

Die Alzheimerforschung geht derzeit verschiedenen Ansätzen nach. Zusammen mit der Suche nach dem genetischen Hintergrund werden verschiedene Hypothesen über die Ursachen der Krankheit verfolgt.

Genetische Ursachen der Alzheimerkrankheit. Es kann nur schwer abgeschätzt werden, wie oft AD durch genetische Faktoren ausgelöst wird (familiäre Form der AD) oder es sich um sporadische Fälle handelt, da sich beide Formen phänotypisch stark gleichen und kaum unterscheidbar sind.[13,15] In wenigstens vier Chromosomen (1, 14, 19, 21) konnten Mutationen oder Polymorphismen einiger Gene identifiziert werden, die an der Entstehung der Krankheit beteiligt sind. Mutationen in drei dieser Gene (Presenilin 2[6] auf Chromosom 1, Presenilin 1[6] auf Chromosom 14, APP[16] auf Chromosom 21) verursachen mit nahezu 100%iger Wahrscheinlichkeit AD. Weiterhin stellt das H4 Allel von ApoE ein bedeutendes Risiko dar, an Alzheimer-Demenz zu erkranken. Es lässt sich jedoch nur ein kleiner Teil der Erkrankung durch diese genetischen Ursachen erklären und es müssen daher weitere Risikofaktoren existieren.

Therapie und Medikamente. Beispiele zur Therapie von AD eingesetzter Medikamente sind z.B. Tacrin®, Donepezil®, Rivastigmin® und Galantamin®. Es handelt sich dabei um Acetylcholinesterase-Hemmer mit verschiedenen, teilweise starken Nebenwirkungen. Diese Inhibitoren verlängern die Halbwertszeit von Acetylcholin im Gehirn und bewirken dadurch eine Anhebung der in Gehirnen von Alzheimerpatienten niedrigen Acetylcholin-Konzentration. Die Inhibitoren können das Gedächtnis und die kognitiven Fähigkeiten von

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einigen Alzheimerpatienten mit milder oder moderater AD verbessern. Es muss jedoch festgestellt werden, dass es bis heute keine zugelassenen Medikamente gibt, die tatsächlich die Krankheit verhindern oder aufhalten können. Es können allenfalls die Symptome gemildert werden.

Potential zur Heilung der Alzheimerkrankheit sieht man vor allem in Targets, die in der

amyloid-Hypothese bzw. der tangle-Hypothese beschrieben werden.[15]

Neurofibrilläre Bündel. Intrazelluläre Neurofibrilläre Bündel (NFTs) werden in Gehirnen von Alzheimerpatienten gefunden. Es handelt sich dabei um Ablagerungen des Mikrotubulin-assoziierten Tau-Proteins. Nach dem tangle-Modell wird das Protein abnormal phosphoryliert. Aggregate dieses hyperphosphorylierten Proteins behindern die Funktion von Tau und führen zu einer neuronalen Dysfunktion. Es gibt Hinweise, dass die Bildung von Neurofibrillären Bündeln durch die zweite in Gehirnen von Alzheimerpatienten beobachtete Ablagerung, den Amyloid-Plaques, induziert wird.[15]

Amyloid-Plaques. Das Amyloid-E-Peptid (AE) bildet den Hauptbestandteil der extrazellulären Amyloid-Plaques.[17] AE ist ein proteolytisches Fragment aus dem amyloid

precursor protein (APP) und besteht vor allem aus AE42 und AE40. AE42 ist die stärker hydrophobe Form und neigt verstärkt zur Aggregatbildung, während AE40 die häufiger vorkommende Spezies darstellt. Es ist weder bekannt, über welchen Zeitraum sich die humanen Plaques bilden, noch ist die genaue Folge der aus der Plaque-Bildung resultierenden Ereignisse exakt geklärt. Eine Bedeutung bei der Bildung von Amyloid-Plaques wird auch dem axonalen Transport von APP zugeschrieben.[18] Weiterhin wird im axonalen Transport eine Verbindung zwischen APP, Tau und ApoE4 als Auslöser von AD vermutet.

Aus verschiedenen Beobachtungen resultiert eine Hypothese über eine pathologische Kaskade, eine Sequenz pathogener Schritte, die letztlich zu einer Dysfunktion und dem Absterben von Neuronen sowie einem Neurotransmitter-Defizit führt. Die Kaskade setzt eine veränderte Proteolyse von APP voraus, die eine Akkumulation und die Aggregation von AE42 bewirkt. Es folgt eine Ablagerung von sogenannten diffusen Plaques, an die sich AE40 und andere Proteine anlagern. Als weitere Folgen dieser Ablagerungen werden betrachtet: fortschreitende Schädigung der Neuronen, Unterbrechung der metabolischen und ionischen Homöostase, oxidativer Stress sowie Veränderungen in der Aktivität von Kinasen, was schließlich zur Bildung von NFTs führt.

Die Verhinderung der Bildung von Amyloid-Plaques folgt daher als potentieller Ansatz zur Therapie von AD. Substanzen, die das prinzipiell bewirken können, sind neben

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Aggregationsinhibitoren die Inhibitoren der AE-generierenden Enzyme, der E- und J-Sekretase.

1.1.1 Die E-Sekretase als Target zur Behandlung des Morbus Alzheimer

Der E-Sekretase-Weg. APP bildet den Vorläufer für AE-Peptide und tritt in drei Isoformen auf (APP695, APP751, APP771).[16,17,19] Es ist durch eine einfache transmembrane Domäne an die Membran gebunden, besitzt einen kurzen zytoplasmatischen Abschnitt und eine große

N-terminale Ektodomäne. In diesem Abschnitt kann es entweder von der

D-Sekretase oder der E-Sekretase (BACE-1, E-site amyloid precursor protein cleaving enzyme) prozessiert werden (Abb. 1). Die D-Sekretase schneidet das Protein innerhalb der AE-Domäne (Abb. 2), setzt sAPPD frei und lässt das Fragment C83 an der Zellmembran zurück. Dieses kann von der J-Sekretase einer weiteren Spaltung zu ungefährlichem P3 unterzogen werden. AE entsteht, wenn APP alternativ über die E-Sekretase gefolgt von der J-Sekretase prozessiert wird. Der erste proteolytische Schnitt durch die E-Sekretase lässt das Protein C99 an der Membran zurück und trennt den größten Teil der Ektodomäne ab (sAPPE). Die J-Sekretase generiert nun durch einen weiteren Schnitt im transmembranen Bereich von C99 verschiedene AE-Peptide, wobei AE40 die häufigste Spezies darstellt.

Abb. 1. Vereinfachte Darstellung des D- (rechts) und des E-Sekretase-Wegs (links). Die Enzyme sowie einige Proteine sind an die Membran (horizontales Band) gebunden dargestellt.

sAPPE E-Sekretase (BACE-1) D-Sekretase sAPPD APP C99 C83 J-Sekretase J-Sekretase Amyloid-E-Plaques P3 E E D AE40/42

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Im Bereich der Schnittstellen von APP existieren verschiedene Mutationen, die familiäre AD verursachen. In Abb. 2 ist als ein Beispiel die schwedische Mutation (KMJNL) dargestellt. Diese befindet sich an der Schnittstelle der E-Sekretase und erhöht signifikant die durch die E-Sekretase vermittelte Spaltung. Hierdurch wird mehr C99 generiert, was zu einer gesteigerten Produktion von AE führt. Die E-Sekretase gilt als das geschwindigkeitsbestimmende Enzym bei der Produktion von AE.[20]

BACE-1 schien viele Jahre das ideale Target zur Behandlung von AD zu sein, da APP das einzig bekannte Substrat war. Mittlerweile konnten auch andere Substrate der E-Sekretase nachgewiesen werden,[21,22] weshalb eine Inhibition von BACE-1 kritischer gesehen wird.

KM D1AEFRHDSGYEVHHQK16LVF19F20AEDVGSNKGAIIGLMVGGVV40IA42 TVIV BACE-1 D-Sekretase BACE-2 J-Sekretase

NL schwedische Mutation

Abb. 2. Schnittstellen der D-, E- (BACE-1, BACE-2) und J-Sekretase an der Sequenz von AE bzw. APP. Eingezeichnet ist auch die schwedische Mutation, die zu einer erhöhten Spaltung in der E-Position führt. Proteolyse durch BACE-1 gefolgt von der J-Sekretase führt zum pathogenen AE (Rahmen).

Aufbau und Funktion der E-Sekretase. Man unterscheidet zwischen zwei E-Sekretasen: BACE-1 (auch ASP2 oder Memapsin 2) und BACE-2 (ASP1 oder Memapsin 1).[23] BACE-1 wird im Folgenden BACE genannt. BACE und BACE-2 besitzen eine hohe Ähnlichkeit, es gibt jedoch Differenzen am aktiven Zentrum und BACE besitzt eine zusätzliche Disulfidbrücke. Beide E-Sekretasen bilden einen Zweig der Pepsin-Familie. BACE-2 schneidet APP hinter Phe19 und Phe20 und kann möglicherweise der Entstehung von AE entgegenwirken. BACE (Abb. 3A) besteht aus 501 Aminosäuren und obwohl sie über eine C-terminale transmembrane Domäne verfügt, ist sie eine typische Aspartylprotease. Gebunden an die Membran ist BACE als Homodimer aktiv.[24] Sind Enzym und Substrat membrangebunden, erhöht das die Selektivität und Kinetik der Spaltung.

Ein wichtiges Charakteristikum von BACE ist das flap (Reste 65-79, Abb. 3B). Der Vergleich von Kristallstrukturanalysen inhibitorgebundener und freier BACE ermöglichen Einblick in dessen Funktion. Das flap befindet sich in einer offenen Position, wenn kein Inhibitor an BACE gebunden ist.[25] In diesem Fall werden verschiedene Wasserstoffbrücken im flap sowie mit einem parallel verlaufenden E-Faltblatt beobachtet. Ist ein Inhibitor an das aktive Zentrum gebunden, werden diese Wechselwirkungen aufgehoben und durch jene zum

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Inhibitor kompensiert. Das flap bewegt sich hierbei an seiner Spitze um 4.4 Å auf das aktive Zentrum zu. Der engste Punkt zwischen der Spitze des flap (Thr72) und der gegenüberliegenden Seite (Arg235) beträgt im freien Zustand 6.5 Å. Dem flap wird eine

gatekeeper-Funktion beigemessen, wodurch eine zusätzliche Substratselektivität erreicht

wird. Eine starke Umlagerung in verschiedenen inhibitorgebundenen BACE-Kristallstrukturen zeigt sich außerdem im 10s loop (Reste 9-14, S3-Tasche).[26]

A B

flap

10s loop

Asp228

Asp32

Abb. 3. Elan-Inhibitor (S,R)-7 (orange) kokristallisiert mit BACE (PDB: 1W51). A) Das Enzym dargestellt in solid ribbon (blau). B) Die active site in BACE. Hervorgehoben sind das flap (cyanblau), der 10s loop (violett) und die katalytischen Aspartate (grau).

Der Proteolyse-Mechanismus von BACE bzw. allgemein von Aspartylproteasen ist in Abb. 4 vereinfacht dargestellt. Die Reste Asp32 und Asp228 sind die katalytischen Aspartate in BACE. Sie liegen normalerweise in inhibitorgebundenen Strukturen nahezu koplanar vor. Bei der Proteolyse protoniert ein Asparaginsäure-Rest den Amid-Sauerstoff, während Wasser durch das zweite Aspartat deprotoniert und dadurch für einen nukleophilen Angriff aktiviert wird (I). Das durch diesen konzertierten Angriff aktivierte Amid (II) unterliegt schließlich seiner Spaltung (III).

N H H N N H R H O H O O Asp HO O Asp OH O Asp O O Asp N H H N N H R OH O Asp O O Asp N H OH H2N N H O R O O O O O I II III R' R' O R' HO OH O

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1.1.2 E-Sekretase-Inhibitoren

Die Entwicklung von BACE-Inhibitoren wird in verschiedenen Artikeln[27,28] berichtet und ausführliche Übersichten befinden sich zusätzlich im Anhang[4,6,7]. BACE-Inhibitoren lassen sich als peptidisch oder nicht-peptidisch einordnen sowie nach der Art ihres Übergangszustandsisosters. Ein klassisches Übergangszustandsisoster (Abb. 5) für Inhibitoren von Aspartylproteasen findet man jedoch nur in den Peptidmimetika. Doch auch die Wechselwirkungen anderer Funktionalitäten mit den katalytischen Aspartaten sind in vielen Fällen geklärt. Weiterhin verläuft der Übergang von peptidischen zu nicht-peptidischen Inhibitoren schrittweise, eine exakte Einteilung ist daher in einigen Fällen nicht möglich. Naturstoffe spielen bei der Inhibition von BACE im Gegensatz zu Proteasom-Inhibitoren eine äußerst untergeordnete Rolle, es werden jedoch einige Beispiele berichtet.[29-33] Schließlich gibt es auch BACE-Modulatoren, die außerhalb des aktiven Zentrums an BACE binden und es dadurch hemmen. Ein Beispiel für eine solche Substanz ist das Peptid Ac-ALYPYFLPISAK-NH2 (IC50 = 1.3 μM).[34] N H NH R Hydroxyethylamin N H R Hydroxyethylen N H H N reduziertes Amid N H H N R Hydroxyethylcarbonyl (Statin) N H NH R Hydroxymethylcarbonyl (Norstatin) OH R R R O OH R O O O OH

Abb. 5. Beispiele für Übergangszustandsisostere in BACE-Inhibitoren.

Im Folgenden soll ein allgemeiner Überblick zu BACE-Inhibitoren gegeben werden. Ausführlich behandelt werden die für diese Arbeit wichtige Entwicklung von Isophthalamid-basierten Inhibitoren sowie strukturell verwandte Verbindungen.

Peptidische BACE-Inhibitoren. Als die ersten hochpotenten BACE-Inhibitoren wurden die Heptapeptide 1 (OM99-2, Ki = 1.6 nM) und 2 (OM00-3, Ki = 0.31 nM) von Ghosh und Tang entwickelt (Abb. 6).[35-37] Bei dem Übergangszustandsisoster handelt es sich um ein Leu/Ala-basiertes Hydroxyethylen. Die Spezifität der subsites des aktiven Zentrums spiegelt sich in den korrespondierenden Resten P und P’ wider und wurde durch kombinatorische Substratmischungen bestimmt. Die Inhibitoren konnten mit BACE kokristallisiert werden und es gelang die Strukturbestimmung zu 1.9 Å (1) bzw. 2.1 Å (2, Abb. 7; PDB: 1M4H). 2 nimmt

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eine verstärkt lineare Konformation ein, wodurch seine Enden stärkere Wechselwirkungen mit dem Enzym eingehen können.[38-40]

2 Tang OM00-3 (Ki = 0.31 nM, IC50 (CHO) = 45 μM) H2N H N N H H N HN N H H N O O O OH O NH2 O O CO2H O CO2H 1 Tang OM99-2 (Ki = 1.6 nM) CO2H H2N H N N H H N HN N H H N O O O OH O O CO2H O CO2H CO2H OH O N O N H H N HN N H N O O SO2 OH O O 3 Ghosh (IC50 = 1.4 μM) 4 Hanessian (IC50 = 0.19 μM) H N N H NH O OH O O N H S S

Abb. 6. Peptidische BACE-Inhibitoren.

Diese Kristallstrukturen haben sich bis heute als wegweisend für die weitere Entwicklung von BACE-Inhibitoren erwiesen. Auffällig ist der kleine Rest P1’ (Me) des Hydroxyethylens, obwohl die entsprechende S1’-Tasche in der Kristallstruktur einen größeren Rest in dieser Position erlauben würde. Erklärt wird diese Beobachtung durch Wechselwirkungen der Position mit dem flap und demonstriert dessen gatekeeper-Funktion beim Bindungsvorgang des Inhibitors an das Enzym. Ein größerer Rest P1’ wird auch in anderen Inhibitoren selten beobachtet. Es lässt sich weiterhin erkennen, dass die Hydroxyfunktion wie beabsichtigt von Asp32 und Asp228 koordiniert wird. Weitere zehn Wasserstoffbrücken können zwischen Enzym und Inhibitor beobachtet werden.

Es wurden zahlreiche peptidische BACE-Inhibitoren entwickelt.[6] Dabei konnte die Aktivität bei gleichzeitiger Verringerung des Molekulargewichtes der Inhibitoren gesteigert werden (3).[41] Obwohl das Hydroxyethylen das wichtigste Übergangszustandsisoster dieser Substanzklasse blieb, wurden auch Statine oder Norstatine erfolgreich eingesetzt.[7] Inhibitor

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Abb. 7. Inhibitor 2 OM00-3 (PDB: 1M4H) in der active site von BACE. GaussConolly Oberfläche (MOE 2005.06). Blaue Oberfläche: hydrophil, grüne Oberfläche: hydrophob, graue Oberfläche: exponiert. A) Ein Teil des Inhibitors ist vom flap verdeckt. B) Die Reste Thr72 und Gln73 des flaps sowie Thr329 sind entfernt: Das Hydroxyethylen ist sichtbar.

Isophthalamide und daraus resultierende Strukturen. Aus diesen ersten Ergebnissen entwickelte die Firma Elan Pharmaceuticals Inhibitoren, die auf einem Isophthalamid aufbauen. In vorausgehenden Arbeiten konnten zunächst die N- und C-Termini größerer peptidischer Inhibitoren verkürzt werden.[28,43] Ein Beispiel dafür sind D -Hydroxyaryl-essigsäure-Derivate wie die zellgängige Substanz 5, die eine gute Aktivität besitzt (IC50 = 120 nM, IC50 (HEK) = 4.0 μM, Abb. 8). Kleinere Strukturen wie Hydroxyethylen 6 wurden schließlich durch die Einführung des Isophthalamides ermöglicht,[44] einem Mimetikum für den S3-S2-Abschnitt. Die Aktivität von 6 liegt im niedrigen nanomolaren Bereich (IC50 = 30 nM). Die Eliminierung einer Amidbindung führte zu Hydroxyethylamin

(S,R)-7 (Abb. 9).[45] Der Ersatz des Hydroxyethylens durch das neue Übergangszustandsisoster führte zu einer leichten Senkung der Aktivität (IC50 = 200 nM). Auffällig ist die inverse Konfiguration des sekundären Alkohols. Eine (R)-Konfiguration in Übergangszustandsisosteren von hochaktiven BACE-Inhibitoren wird nur im Fall von Hydroxyethylaminen beobachtet. Yon[46] vermutet, dass in dieser Ausrichtung die Interaktion während der Hydrolyse imitiert wird, gerade bevor die C-N-Bindung des Substratproteins gespalten würde. HO O N H O H N OH F F N H O CO2Me CO2Me 5 Elan (IC50 = 120 nM, IC50 (HEK-293) = 4.0 μM) N O O N H OH N H O 6 Elan (IC50 = 30 nM, IC50 (HEK-293) = 3.0 μM)

Abb. 8. Inhibitoren von Elan Pharmaceuticals: erste Peptidsubstitutionen am N- und C-terminalen Ende.

A B

flap flap

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Von (S,R)-7 konnte eine Kristallstruktur mit BACE angefertigt werden (PDB: 1W50).[46] Das Amin des Übergangszustandsisosters wird durch Asp228 protoniert und sein 3-Methoxybenzyl-Substituent wird in der S2’-Tasche platziert (Abb. 9). Eine n-Propyl-Gruppe besetzt die S3-Tasche und ist in Richtung des Phenylringes in der S1-Tasche ausgerichtet. Insgesamt bilden die Reste P1-P3 eine kontinuierliche Oberfläche. Der zweite n-Propyl-Rest ist von geringerer Bedeutung und in Richtung der Enzymoberfläche orientiert. Es liegen zwei Wasserstoff-brücken zum flap vor. Das Tyr71 des flaps interagiert außerdem in einem T-stacking mit den beiden Phenylringen der Positionen P1 und P2’ des Inhibitors.

Thr232 NH OH Thr72 OH Gln73 NH Gly34 Asp228 Asp32 Gly230 S3 S1 S2‘ N O N H O N H OH O (S,R)-7 Elan (IC50 = 30 nM)

Abb. 9. Hydroxyethylamin (S,R)-7 und dessen dreidimensionale Struktur in BACE (PDB: 1W51). Die Wasserstoffbrücken zum Enzym sind dargestellt. Auf eine Darstellung der Protonen wurde verzichtet.

Im folgenden Schritt wurde ein Sulfonamid in Position 5 des Isophthalamids eingeführt. Beispiele dafür sind die Substanzen 8 und 9 (Abb. 10).[47] Wie in den Kristallstrukturen mit BACE beobachtet werden kann, füllen beide Substanzen mit ihren Sulfonamid-Substituenten die in der Struktur von 6 noch offene S2-Tasche. Der Benzylsubstituent des Sulfonamids in 8 reicht außerdem bis zu Lys321 in der Tasche S4, mit dem er eine Kation-S-Wechselwirkung eingeht. Weiterhin bilden die Sulfonamid-Sauerstoffe beider Substanzen Wasserstoffbrücken zum Enzym (Thr232, Asn233, Arg235). 9 besitzt eine zehnfache Selektivität gegenüber BACE-2 und eine sehr gute zelluläre Aktivität (IC50 = 29 nM).

Die Einführung von Isophthalamid-Derivaten durch die Firma Elan Pharmaceuticals stellt einen Meilenstein in der Entwicklung von BACE-Inhibitoren dar. Während Inhibitoren dieses Typs eine exzellente zellfreie als auch zelluläre Aktivität besitzen, erwiesen sie sich jedoch als ein Substrat des p-Glycoprotein-Transportes (PGP-Pumpe). Es wurden daher verschiedene Ansätze gemacht, diese Eigenschaft der Inhibitoren zu unterbinden, wobei versucht wurde, die Anzahl an Wasserstoffbrückendonoren bzw. -akzeptoren zu verringern. Die weitere Entwicklung dieser Inhibitoren wurde weitgehend von MSD getragen. Coburn beobachtete, dass der Austausch der Amidgruppe in Position 3 des Isophthalamides gegen eine andere

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Funktionalität nicht mit einem bedeutenden Aktivitätsverlust verbunden ist. Schließlich konnte Keton 10 generiert werden. Der Inhibitor zeigt eine hohe Aktivität gegenüber BACE (IC50 = 98 nM). Die Kristallstruktur mit BACE (Abb. 11A, PDB: 2B8V) zeigt, dass der Phenylrest des Ketons die S3-Tasche füllt und wahrscheinlich durch ein S-stacking weiter

stabilisiert wird, während der Keton-Sauerstoff in Richtung des Lösungsmittels zeigt.

H N O N OH H N 11 Coburn (IC50 = 35 nM) H N O N OH H N O 10 Coburn (IC50 = 98 nM) H N O N OH H N O 9 Coburn (IC50 = 15 nM, IC50 (HEK-293) = 29 nM) H N H N O O N H N O NH2 8 MSD WO2005113484 O2S O2S F O2S O2S

Abb. 10. BACE-Inhibitoren von MSD.

Die Aktivität von 10 konnte durch Einführung eines konformativ günstigeren cis-Olefins in Substanz 11 gesteigert werden (IC50 = 35 nM). Auch Olefin 11 verfügt noch über einige Eigenschaften, die zu einem Transport durch das p-Glycoprotein beitragen. Auf der Suche nach neuen Übergangszustandsisosteren wurden diese Ergebnisse zunächst nicht berücksichtigt: Aufbauend auf 9 wurde das Hydroxyethylamin durch ein reduziertes Amid ersetzt, das Isophthalamid blieb erhalten.[49] Substanz 12 zeigt eine Aktivität im unteren nanomolaren Bereich im zellfreien (IC50 = 4 nM) und zellulären (IC50 = 17 nM) Assay (Abb. 12). Eine Reihe ähnlicher Strukturen wurde hergestellt und es zeigte sich eine analoge Aktivität, eine zehnfache Selektivität gegenüber BACE-2 und eine exzellente Selektivität gegenüber Renin (IC50 = 20 μM). Durch Kristallstrukturanalyse konnte gezeigt werden, dass die reduzierten Amide ähnlich wie Hydroxyethylamine in BACE orientiert sind. Schließlich wurden die neuen Elemente in Struktur 13 kombiniert. 13 verfügt über entsprechende Aktivitäten (IC50 = 20 nM, IC50(HEK-293) = 23 nM) und eine verbesserte Zellgängigkeit.

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Abb. 11. Inhibitoren 10 (A, PDB: 2B8V), 15 (B, PDB: 2ISO) und 17 (C, PDB: 2IRZ) kokristallisiert mit BACE. GaussConolly Oberfläche (MOE 2005.06). Blaue Oberfläche: hydrophil, grüne Oberfläche: hydrophob, graue Oberfläche: exponiert. Das über den Liganden liegende flap wurde jeweils entfernt, Asp32 und Asp228 liegen unter den Übergangszustandsisosteren.

H N O N H O H N N O H N F 13 Coburn (IC50 = 20 nM, IC50 (HEK-293) = 23 nM) H N O N H O H N N 12 Coburn (IC50 = 4 nM, IC50 (HEK-293) = 17 nM) O2S O2S

Abb. 12. BACE-Inhibitoren von MSD: reduzierte Amide.

MSD unternahm weitere Versuche zur Eliminierung des Hydroxyethylamins. Rajapakse synthetisierte zunächst das moderat aktive Oxazolin 14 (IC50 = 12 μM, Abb. 13).[50] Davon ausgehend, dass 14 neben seiner linearen Form 15 vorliegt, wurde 15 allein im BACE-Assay getestet und erwies sich als eine im nanomolaren Bereich aktive Substanz (IC50 = 200 nM). Die Analyse des Kokristalles aus BACE und 15 sowie den daraus resultierenden Veränderungen führten zu weniger potenten Ethern, aber schließlich zum aktiveren Ester 16 und Oxadiazol 17. In 15 liegen die Esterfunktion und deren benachbarten Atome koplanar, was deren Ersatz durch ein Oxadiazol zu 17 möglich macht, wobei 17 eine höhere Stabilität bietet.

Das Amin in Substanz 15 interagiert mit dem Rest Gly230 und den beiden katalytischen Aspartaten. Die Hydroxygruppe bzw. die Carbonylgruppe des Esters bilden Wasserstoffbrücken zu Asp32 bzw. zu Gln73 im flap. S1’ wird auch in diesem Beispiel vom Benzylsubstituenten gefüllt. Die Kristallstruktur von 17 mit BACE zeigt eine ähnliche Konformation. Die gesteigerte Aktivität von 17 vs. 15 wird durch die erhöhte Rigidität begründet. Wahrscheinlich treten zudem Wechselwirkungen der Ringstickstoffe mit dem flap auf. Die Kristallstrukturen der MSD-Verbindungen 15 (PDB: 2ISO, Abb. 11B) und 17 (PDB:

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2IRZ, Abb. 11C) zeigen eine orthogonale Orientierung der active site-Aspartate und sind damit die ersten Beispiele einer solchen Anordnung. Weiterhin kann eine stärkere Bewegung des 10s loop im Vergleich zu anderen inhibitorgebundenen BACE-Strukturen beobachtet werden.[26] O N O2S O H N F O NH2 N O2S O H N F O N N

16 Rajapakse (IC50 = 27 nM) 17 Rajapakse (IC50 = 12 nM, IC50 (HEK-293) = 65 nM) NH2 O N O2S O H N F 14 Rajapakse (IC50 = 12 μM) N HO N O2S O H N F 15 Rajapakse (IC50 = 200 nM) O O NH2 OH

Abb. 13. BACE-Inhibitoren von MSD.

Die MSD-Substanz 18[51] sowie ein Inhibitor von Novartis (19)[52] sind Alternativen zu den Isophthalamid-basierten Substanzen (Abb. 14). Sie überbrücken den P3- und den P1-Rest. Die Verwandtschaft von Amin 18 zu Inhibitoren wie 15 oder 17 ist klar erkennbar, während 19 eher einem Hydroxyethylamin einer früheren Stufe von BACE-Inhibitoren gleicht und eine Aktivität wie diese aufweist. Tatsächlich besitzen beide Substanzen nur noch eine Amidbindung. NH O NH2 N O2S O 18 MSD WO2006055434 19 Novartis WO2006074950 (IC50 = 0.04 μM) NH O H N HO N NH

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Weitere Alternativen zu den Isophthalamiden sind in Abb. 15 dargestellt. Glaxo meldete mehrere Patente für Verbindungen wie 20-22 an.[53-55] Auch hier kann auf eine Amidbindung verzichtet werden. Für 21 wird eine Aktivität von IC50 < 10 μM berichtet, eine genaue Angabe existiert nicht.

O N O N H OH N H O H N F F 20 Pfizer WO2006032999 N O N H O F F OH N H N H NH N N S O O O OH N 22 Glaxo WO2005058915 21 Glaxo WO2006040148 (IC50 < 10 μM) N H NH N N S O O O O O 23 Elan (IC50 = 68 μM)

Abb. 15. BACE-Inhibitoren mit Substituenten für das Isophthalamid (20-22) und Isophthalamid 23 mit (S)-konfiguriertem Alkohol.

2007 wurde zum ersten Mal von einem Hydroxyethylamin mit (S)-konfigurierten sekundären Alkohol berichtet.[56] Substanz 23 gleicht strukturell ansonsten eher o.g. reduzierten Amiden (12, 13). Die Verbindung ist im zellfreien BACE-Assay nur schwach aktiv (IC50 = 68 μM). Bis heute konnten aus den peptidischen Leitstrukturen Inhibitoren entwickelt werden, die ein immer größer werdendes Potential für tatsächliche Wirkstoffe besitzen. Dies geschah über die schrittweise Eliminierung dafür ungünstiger Eigenschaften. Ein Großteil ihres peptidischen Ursprungs konnte durch neue Mimetika ersetzt werden. Es gibt jedoch eine Reihe von Ansätzen, die weitgehend unabhängig von den Strukturen der ursprünglichen peptidischen Inhibitoren sind. Einige aktuelle Beispiele werden im Folgenden vorgestellt.

Nicht-peptidische BACE-Inhibitoren. A. Caflisch et al. verfolgten in silico-Methoden für die Identifikation neuer Leitstrukturen.[57] Einige der resultierenden Substanzen wurden in vitro getestet und alle aktiven Substanzen erwiesen sich als 2,4,6-trisubstituierte Triazine, die gebunden an ein Hydrazon vorliegen (Abb. 16). Eine Wasser-vermittelte Wechselwirkung des Hydrazons mit den katalytischen Aspartaten des Enzyms wird aufgrund einer Überlagerung mit einer bekannten BACE-Inhibitor-Kristallstruktur vermutet. Im zellbasierten Assay ist

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Substanz 24 inaktiv, Substanz 25 verfügt über eine geringe Aktivität. Von The Genetics Company wurden weitere Hydrazone als BACE-Inhibitoren vorgestellt (26, 27).[58]

N N N H N N H N N O O OH O 24 Caflisch IC50 = 7 μM N N N H N N H N N O 25 Caflisch IC50 = 11 μM I I HO N N H N N

26 The Genetics Company

WO2006029850 (IC50 < 8 μM, IC50 (HEK-293) < 50 μM)

27 The Genetics Company WO2006029850 (IC50 < 8 μM, IC50 (HEK-293) < 50 μM) Cl Cl N N H I F Cl O Cl N O

Abb. 16. Auf Hydrazonen basierende BACE-Inhibitoren.

Cole und Mitarbeiter (Wyeth) fanden in einem high-throughput screening Substanz 28 (Abb. 17).[59,60] Dies führte zur weiteren Untersuchung von Acylguanidinen als neuartige BACE-Inhibitoren. Eine Kristallstruktur von 28 mit BACE (Daten nicht veröffentlicht) eröffnete Einblick in einige besondere Eigenschaften des Inhibitors. Bemerkenswerterweise bindet der Inhibitor in einer Konformation an BACE mit offenem flap, was bisher nie in einer inhibitorgebundenen BACE-Kristallstruktur beobachtet werden konnte. Die zwei Phenylringe füllen die Taschen S1 und S2’. Der Ersatz eines der Phenylringe durch einen Adamantylrest verursachte eine Steigerung der Aktivität des Inhibitors. Eine weitere Kristallstruktur wurde bestimmt und nachgewiesen, dass der Adamantylrest in der S1-Tasche liegt. Zwei der Guanidin-Stickstoffe gehen eine Wechselwirkung mit den active site-Aspartaten ein, während der dritte Stickstoff in Richtung der S1’-Tasche orientiert ist. Da dieser Stickstoff nicht nennenswert mit der S1’-Tasche interagiert, wurde ein 3-Hydroxypropyl-Rest daran gebunden, was zu der beabsichtigten Steigerung der Aktivität führte (29). Substanz 29 ist im nanomolaren Bereich aktiv (IC50 = 0.24 μM), ungefähr 15 mal weniger potent im BACE-2-Assay, verfügt über eine mehr als 800fache Selektivität gegenüber CatD und weist im zellulären BACE-Assay eine Aktivität von IC50 = 1.8 μM auf. Diphenylimidazol 30 bindet vermutlich in ähnlicher Weise an BACE, besitzt jedoch eine verbesserte Selektivität gegenüber BACE-2. Aminopyridin 31 schließlich bildet einen Ersatz für die

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Guanidin-Gruppe, wobei alle anderen Konzepte beibehalten werden.[60,61] Während auch Verbindung 32 in dieser Reihe genannt werden kann, ist eine Einordnung der Substanz 33 von Hoffmann-LaRoche in diese Gruppe nicht eindeutig.[62]

N N 29 Cole IC50 = 0.24 μM, EC50 (CHO-wt) = 1.8 μM O NH NH2 HO 31 Wyeth US2006173049 (IC50 < 0.1 μM) N Cl O N N N H2N 32 MSD WO2006044497 N N N O F N H S O N N O H2N O N N 30 Wyeth US20050282825 (IC50 < 0.1 μM, >100fache Selektivität BACE-1/BACE-2) O HO O O N 33 Hoffmann-La Roche US2005119329 (IC50 = 11 μM) N N 28 Cole IC50 = 3.7 μM, EC50 (CHO-wt) = 8.9 μM O H2N NH2

Abb. 17. Nicht-peptidische Inhibitoren: Acylguanidine und verwandte Strukturen.

Kraus et al. kreierten eine Reihe von substituierten Phenylpiperazinen.[63,64] Es wurden Chromenyl- (34) oder analoge Coumarinyl-, Naphthyl- und Quinolinyl-Derivate mit Aktivitäten im Bereich von IC50 = 0.05 - 5.0 μM generiert (Abb. 18). Verwandte Substanzen weisen eine zelluläre Aktivität im unteren mikromolaren Bereich auf.

Erwähnt werden soll auch Substanz 35, die in einem Patent von Janssen Pharmaceutica genannt wird.[65] Eine Zuordnung der hochaktiven Substanz fällt schwer. Es können jedoch verschiedene Substrukuren aus anderen Inhibitoren wiedergefunden werden.

O O O O N H N Br N Boc 34 Kraus (IC50 = 0.093 μM) 35 Janssen Pharmaceutica WO2006017836 (IC50 = 0.016 μM) N N NH2 O HN O

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Richtlinien zum Design von BACE-Inhibitoren. Während die Eigenschaften der einzelnen

subsites in BACE gut untersucht sind, stellen Inhibitoren, die mit einer hohen Selektivität

BACE neben anderen Enzymen inhibieren, noch immer eine besondere Herausforderung dar. Probleme in der Selektivität werden vor allem gegenüber anderen Aspartylproteasen beobachtet. Die Aktivitäten der BACE-Inhibitoren werden daher oftmals auch gegenüber BACE-2, Cathepsin D (CatD) und Renin überprüft.

Um aktive Inhibitoren zu erhalten, sollten diese eine Anzahl bestimmter Wechselwirkungen mit BACE eingehen, die bei Inhibitoren verschiedener Strukturen wiederkehrend festgestellt werden können. Die Ergebnisse eines entsprechenden pharmakophoren Modells wurden veröffentlicht (siehe Anhang).[8] Zwischen BACE und CatD bzw. Renin gibt es einige Unterschiede in Größe und Polarität der subpockets, die zu einer Erhöhung der Selektivität ausgenutzt werden können.

Weitere Eigenschaften, die BACE-Inhibitoren besitzen sollten, sind eine hohe Stabilität (nicht-peptidische Strukturen), ein niedriges Molekulargewicht und eine bestimmt Polarität (logP = 2 bis 5) sowie eine TPSA kleiner 100 Å2, was für die orale Verfügbarkeit, den Transport durch die Zellmembran sowie den Transport durch die Blut-Hirn-Schranke[66] notwendig ist.

1.2 Das Proteasom

Intrazellulär sind zwei hauptsächliche Wege der Proteindegradation zu unterscheiden. Zum einen kann diese über die ca. 50 unterschiedliche hydrolytische Enzyme enthaltenden Lysosomen oder aber über das zytosolische Ubiquitin-Proteasom-System verlaufen.[67] In Säugetierzellen verläuft ein Großteil der Hydrolyse über diesen zweiten ATP-abhängigen

pathway, obwohl die Lysosomen lange für den einzigen Ort des Proteinabbaus gehalten

wurden.[68] Das Ubiquitin-Proteasom-System befindet sich in erster Linie im Zytosol und im Nukleus. Die Beteiligung des Proteasoms in dem nach ihm benannten pathway konnte erst in den späten achtziger Jahren nachgewiesen werden.[69]

Das Ubiquitin-Proteasom-System. Das Ubiquitin-Proteasom-System ist eine aus vielen einzelnen Schritten zusammengesetzte Maschinerie, die selektiv spezifische Substrate erkennen und abbauen kann (Abb. 19).[69,70] Ubiquitin markiert die abzubauenden Proteine. In Eukaryoten gliedert sich dieser Vorgang in drei Schritte, wozu drei verschiedene Enzyme E1, E2 und E3 benötigt werden. Ubiquitin wird in einem ATP-abhängigen Prozess aktiviert (E1), auf ein Ubiquitintransportprotein (E2) und schließlich von E3 an ein Substratprotein übertragen. Es existieren wahrscheinlich mehrere hundert verschiedene Enzyme E3 mit der

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Fähigkeit, Signale der Substrate zu deren Abbau zu erkennen, was die hohe Selektivität des Systems erklärt. Ist das Proteinsubstrat monoubiquitinyliert, kann eine Polyubiquitin-Kette, die essentiell für den Abbau einiger Proteine ist, über den gleichen Mechanismus geformt werden. Das resultierende, ubiquitinylierte Protein kann nun von einem proteolytischen Komplex, dem 26S-Proteasom, erkannt und wiederum unter ATP-Verbrauch abgebaut werden. Protein ATP E1, E2, E3 ATP 26S-Proteasom Peptide Protein Ubiquitin Ubiquitin Ubiquitinkette

Abb. 19. Vereinfachte Darstellung des Ubiquitin-Proteasom-Systems.

Aufbau des 26S-Proteasoms.[67,69] Das 26S-Proteasom (ca. 2000 kDa) ist ein Multi-Enzymkomplex, aufgebaut aus dem zentralen 20S-Proteasom (ca. 700 kDa) und zwei peripheren 19S-Komplexen. Der grundsätzliche Aufbau des 20S-Partikels in verschiedenen Organismen ist oft ähnlich und die Untereinheiten verschiedener Proteasomen weisen eine hohe Sequenzhomologie auf. Das 20S-Proteasom ohne Anlagerung weiterer Komplexe kommt als solches nur in Archaebakterien vor und ist in Eukaryoten die proteolytische Schlüsselkomponente des 26S-Proteasoms. Das eukaryotische 20S-Proteasom ist zylindrisch aus zwei identischen Sätzen von je 14 Untereinheiten geformt. Je die Hälfte davon bildet einen Ring aus den Einheiten D1-7 bzw. E1-7. Diese Ringe sind derart zu einem Fass übereinander gestapelt, dass eine Abfolge D1-7E1-7E1-7D1-7 mit drei großen Kavitäten zwischen den Ringen und einem durchgängigen zentralen Kanal resultiert (Abb. 20). In der mittleren dieser Kavitäten befinden sich die proteolytischen Zentren. Das 20S-Partikel ist rotationssymmetrisch, eine C2-Achse liegt zwischen den beiden E-Ringen. Bezogen auf die Untereinheiten innerhalb eines jeden Rings weist der Komplex quasi-siebenzählige Rotationssymmetrie auf. Die D-Untereinheiten weisen in der Primärsequenz nur geringe Homologie zu den E-Untereinheiten auf, die Tertiärstruktur ist jedoch ähnlich. Die Struktur des eukaryotischen 20S-Proteasoms gleicht derjenigen des Archaebakteriums T. acidophilum, dieses verfügt jedoch über jeweils identische Untereinheiten D und E (D7E7E7D7) und ist der Ursprung dieser Klassifizierung.

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Abb. 20. Das 20S-Proteasom aus S. cerevisiae: Kugelmodell mit C2-Achse zwischen den E-Ringen

(links), ribbonplot (Mitte) und Schnitt durch ein Oberflächenmodell (rechts). Im Oberflächenmodell sind die drei Kavitäten im Proteasom erkennbar. In der mittleren Kammer ist der Calpain-Inhibitor I (36, Abb. 22, gelb) an die aktiven Zentren gebunden. (Abbildung mit freundlicher Genehmigung von M. Groll[67])

Im 26S-Proteasom sitzen an den Polen des 20S-Proteasoms die 19S-Komplexe. Eine solche 19S-Regulatorkappe lässt sich in zwei Bereiche einteilen: Der äußere Bereich (lid) an den beiden Enden des 26S-Komplexes enthält Enzyme zur Bindung an ubiquitinylierte Proteine und Depolymerisation der Ubiquitin-Kette, der innere Teil (base) setzt sich aus acht Polypeptiden mit sechs ATPasen zusammen und ist direkt mit den D-Untereinheiten des 20S-Proteasoms assoziiert. Er dient zur ATP-abhängigen Öffnung des Kanals im D-Ring und zur Entfaltung des Substratproteins sowie zur Katalyse dessen Überführung in das 20S-Proteasom.

Aufgaben der D- und E-Untereinheiten.[67]

Die D-Untereinheiten bilden als oben erwähnte Ringe eine Sperre für gefaltete, zytosolische Proteine. Bei Archaebakterien ist der Zugang nur etwas größer als der Durchmesser einer D-Helix, der Durchlass reicht für gefaltete Proteine nicht aus und stellt somit einen limitierenden Faktor dar. In eukaryotischen Zellen ist der Zugang durch N-Termini von bestimmten Untereinheiten verschlossen. Erst durch die Bindung von Regulatorkappen werden Konformationsänderungen im 20S-Proteasom und damit eine vielfache Erhöhung der katalytischen Aktivität bewirkt. Weitere Funktionen der D-Ringe sind die Bindung der E-Untereinheiten durch Bildung einer Ringstruktur sowie die Ermöglichung eines Wechsels des Proteasoms zwischen Zytosol und Kern.

In den E-Untereinheiten befinden sich geöffnet zur mittleren Kavität die proteolytisch aktiven Zentren mit den N-terminalen Threoninen (Abb. 20, rechts). In eukaryotischen Zellen bilden nur drei von sieben E-Untereinheiten ein proteolytisch aktives Zentrum aus, wie anhand der Röntgenkristallstruktur des Hefe-20S-Proteasoms gezeigt werden konnte. Dabei handelt es sich um E1, E2 sowie E5. In 20S-Säugerproteasomen können diese über J-Interferon gegen

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drei neu synthetisierte LMP-Untereinheiten (E1i, E2i, E5i) ausgetauscht werden.[71] Man nennt sie immuno-Untereinheiten, das resultierende 20S-Proteasom heißt immuno-20S-Proteasom. Mechanismus der Proteolyse im 20S-Proteasom. Erste Hinweise auf den Mechanismus der Proteolyse im 20S-Proteasom konnten durch genetische Studien erhalten werden. Bei Mutation der N-terminalen Aminosäure Threonin zu Alanin ist jegliche proteolytische Aktivität verhindert, während bei Mutation zu Serin eine bedeutende Aktivität erhalten bleibt.[69] Die Hydroxygruppe von Thr1 konnte erst durch die Röntgenkristallstruktur des 20S-Proteasoms mit gebundenem Inhibitor Ac-Leu-Leu-Norleucinal (Calpain-Inhibitor I, 36, Abb. 22) als Nukleophil für die Hydrolyse nachgewiesen werden.

Verschiedene Reste sind in allen proteolytisch aktiven Untereinheiten verschiedener Proteasomen gleich (Thr1, Asp/Glu17, Lys33, Ser129, Asp166, Ser169), was auf einen identischen Proteolysemechanismus hindeutet.[67] Über ein terminales Threonin verfügen in eukaryotischen Proteasomen nur die aktiven Untereinheiten E1, E2 und E5. Die Anordnung verschiedener Aminosäurereste um Thr1, sowie ein Muster von Wasserstoffbrücken-bindungen lässt vermuten, dass die Nukleophilie von Thr1OJ und Thr1N gesteigert ist. Außerdem befindet sich in der Nähe von Thr1 ein Wassermolekül.[67] Es dient zur Übertragung eines Protons der Hydroxygruppe auf die Aminfunktion (I, Abb. 21) sowie zur Abspaltung des Acylrestes nach erfolgter Spaltung des Peptids (II) und damit der Neugenerierung von Thr1OJ(III)

NH2 O Enzym O O H H H R1 N H O R2 NH2 O Enzym O R1 O O H H O H H NH2 OH Enzym O -R2NH2 I II III R1 OH O

Abb. 21. Vorgeschlagener Mechanismus zur Proteolyse im 20S-Proteasom.[70]

Spezifitäten und Präferenzen des 20S-Proteasoms. 20S-Partikel verfügen über die Möglichkeit nach fast jedem Aminosäurerest ein Protein zu schneiden. Es konnten jedoch anhand von fluorogenen peptidischen Substraten fünf Schnittpräferenzen gefunden und den Untereinheiten zugeordnet werden:[70,72] PGPH (post glutamyl peptide hydrolyzing, E1), TL (trypsin-like aktivity, E2), CL (chymotrypsin-like aktivity, E5), SNAAP (small neutral

amino acid preferring) und BrAAP (branched chain amino acid preferring). E5 spaltet vermutlich auch Substrate der beiden letztgenannten Kategorien.[67] Im

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immuno-20S-Proteasom bleiben diese Präferenzen weitgehend erhalten, in der E1i-Untereinheit ist die PGPH-Aktivität verringert und die Proteolyse zu anderen Präferenzen hin verschoben.

Das 20S-Proteasom ist zwar relativ unspezifisch, Polypeptide werden aber in Fragmente zerlegt, die im Allgemeinen aus acht bis fünfzehn Resten bestehen.[67] Die Ursache dafür liegt nicht in dem Abstand der aktiven Zentren, sondern in einem etwa acht Aminosäuren langen Kanal zum Thr1, der somit das Maß für die mittlere Produktverteilung bildet. Schnittpräferenzen werden über die Charakteristika der S1- bis S8-Taschen und die dadurch bewirkten Verweilzeiten bestimmt. Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt ist also die Zugänglichkeit der Substrate zu den aktiven Zentren sowie deren Freilassung aus der zentralen Kammer und nicht die Proteolysereaktion selbst.

Physiologische Relevanz des Systems. Das Ubiquitin-Proteasom-System ist verantwortlich für den Abbau zahlreicher Proteine und an der Regulation vieler zellulärer Mechanismen beteiligt. Damit verknüpft sind beispielsweise die Kontrolle des Zellzyklus (Abbau von Cyclinen), der Abbau von mutierten, geschädigten oder fehlgefalteten Proteinen sowie die Prozessierung und der Abbau von Transkriptionsfaktoren (z.B. p53, NF-NB). Dem immuno-Proteasom wird ein Einfluss auf die Antigenpräsentation zugeschrieben. Das Proteasom wird daher als potentielles Target zur Therapie verschiedener Krankheiten (z.B. entzündliche Erkrankungen, Krebs)[70,73] betrachtet. Die Rolle des Ubiquitin-Proteasom-Systems in neurodegenerativen Krankheiten wird diskutiert und ist teilweise geklärt.[74] Die meisten Proteinablagerungen dieser Krankheiten enthalten Ubiquitin oder ubiquitinylierte Proteineinlagerungen. Bezüglich einer Beteiligung des Ubiquitin-Proteasom-Systems in der Alzheimerkrankheit werden in der Literatur verschiedene Indizien genannt.[12] Eine endogene oder künstliche Inhibition des Proteasoms scheint jedoch eine Entstehung der Alzheimerschen Krankheit zu fördern.

1.2.1 Inhibitoren des Proteasoms

Inhibitoren des Proteasoms sind essentiell zur Untersuchung des proteolytischen Mechanismus des Proteasoms, die allgemeine Funktionsweise des gesamten Ubiquitin-Proteasom-Systems, dessen Substrate und davon abhängige biologische Prozesse. Die heute bekannten Einflüsse auf biologische Systeme legt die Verwendung von Inhibitoren des Proteasoms als Medikamente in verschiedenen Bereichen nahe.

Biologische Effekte von Proteasom-Inhibitoren. Inhibition des Proteasoms führt zu zahlreichen Veränderungen in der Zelle.[69] Werden Zellen bereits kurzzeitig Proteasom-Inhibitoren ausgesetzt, führt dies zur Akkumulation von geschädigten oder fehlgefalteten

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Proteinen und einer heat shock response. Außerdem kommt es zu einer Induktion von Genen, die Proteasom-Untereinheiten kodieren. Werden Zellen länger einer Proteasom-Inhibition ausgesetzt, wird deren Zelltod durch Apoptose induziert. Hierbei ist auffällig, dass sich stark vermehrende Zellen besonders empfindlich auf Proteasom-Inhibitoren reagieren. Die Induktion der Apoptose durch Proteasom-Inhibition wird auf die Stabilisierung des Tumorsuppressors p53 oder die Unterdrückung einer Aktivierung von NF-NB zurückgeführt. NF-NB ist ein potenter Inhibitor der Apoptose, wobei dessen Suppressor INBD ein Substrat des Proteasoms darstellt.[75] Velcade® (Millenium Pharmaceuticals, Inc. And Johnson & Johnson Pharmaceutical Research, L.L.C.) ist das erste Medikament, dessen Wirkung auf einer Inhibition des Proteasoms beruht.[75] Es wird zur Behandlung von Multipler Myeloma eingesetzt und der Einsatz gegen weitere Formen von Krebs wird untersucht. Bei dem Wirkstoff handelt sich um die Dipeptidboronsäure Bortezomib (41, Abb. 23).

Selektive Inhibition der Untereinheiten E1,E2 bzw. E5 . Obwohl das 20S-Proteasom mehrere aktive Zentren besitzt, kann dessen Aktivität signifikant reduziert werden, ohne jedes einzelne Zentrum zu inhibieren.[69] Tatsächlich führt gewöhnlich schon die Inhibition oder Mutation der E5-Untereinheit (CL) eine starke Reduktion der Geschwindigkeit des Proteinabbaus herbei, auch derjenigen durch die E1- oder E2-Untereinheiten bevorzugt katalysierten Umsetzungen (PGPH, TL). Umgekehrt gilt dies nicht. Weiterhin sind die meisten Inhibitoren des E5-Zentrums aufgrund dessen CL-Aktivität stärker hydrophobe Substanzen und daher auch verstärkt zellpermeabel, im Gegensatz zu den Inhibitoren mit geladenen Resten der beiden anderen Zentren. Aufgrund der Hierarchie der proteolytischen Zentren sowie der relativ leichten Überführung von Inhibitoren der E5-Untereinheit ins Zellinnere zielt die Inhibition des Proteasoms oftmals auf eine Inhibition des CL-aktiven Zentrums ab. Ob synthetischen oder natürlichen Ursprungs, die meisten der bekannten Proteasom-Inhibitoren interagieren vor allem mit der E5-Untereinheit und haben für gewöhnlich wesentlich schwächere Effekte auf andere Zentren. Es werden jedoch auch andere Beispiele berichtet. Unselektive Proteasom-Inhibitoren. Es existieren verschiedene Inhibitoren für das Proteasom, zu welchen letztlich auch der Calpain-Inhibitor I (36) zählt (IC50 (CL) = 15 PM, IC50 (PGPH) = 45 PM,[76] Abb. 22). Dieser und andere Inhibitoren dieser Art hemmen das Proteasom jedoch unselektiv und sind ursprünglich Inhibitoren von Serin- und Cystein-Proteasen. Der Calpain-Inhibitor I war einer der ersten Inhibitoren des Proteasoms. Er diente im Wesentlichen zur Erforschung dessen Proteolyse-Eigenschaften. Im Komplex mit dem Proteasom nimmt er eine ausgedehnte Konformation ein. Er besetzt einen Spalt zwischen

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E-Faltblättern in der jeweiligen Untereinheit. Dabei handelt es sich um die Taschen S1-S3. Die drei Seitenketten des Inhibitors bilden folgende Wechselwirkungen zu ihrer Umgebung: die Seitenkette des Norleucins mit der inhibierten Untereinheit, das terminale Leucin mit der benachbarten Untereinheit und das mittlere Leucin weist aus der aktiven Tasche heraus. Der Aldehyd ist als Hemiacetal an das katalytische Thr1 gebunden (Abb. 25A). Der Inhibitor bindet in einer ausgestreckten Konformation als Hemiacetal an Thr1OJ in eine durch eine Schleife von zwei E-Faltblättern ausgeprägte Tasche. Wie von ihrer oft peptidischen Gestalt zu erwarten, dehnen sich mit Ausnahme von Homobelactosin C alle bekannten Inhibitoren wie der Calpain-Inhibitor I in Richtung der S-subpockets aus.

Tripeptidaldehyde. Der Mangel an Spezifität von Calpain-Inhibitor I konnte durch einige Modifikationen in seiner Struktur verringert werden. Als Beispiel dafür sei Aldehyd MG132 (37, Abb. 22) genannt, der zehnmal selektiver vs. Calpain und wesentlich potenter (IC50 < 1.0 μM) hinsichtlich des Proteasoms ist.

N H H N N H O O O 36 Calpain-Inhibitor I O N H H N N H O O O 37 MG132 O O H N N H O O O N H O N H O2NN NH2 NC H N N H O O O N H O N H O2NN NH2 N O O 7 38 IC50 = 0.02 μM R = H, Ki = 12 nM R = NHSO2Ph, Ki = 1.1 nM R = NHCO2tBu, Ki = 2.2 nM R = NH2, Ki = 67 nM R 39a1 39b 39c 39d

Abb. 22. Tripeptidaldehyde und D-Ketoamide als Inhibitoren des Proteasoms. Die angegebenen Aktivitäten sind CL-Aktivitäten.

Peptidische Aldehyde sind in einem hohen Maße zellpermeabel und binden reversibel als Hemiacetal an Thr1. Ihr Nachteil besteht in ihrer hohen Reaktivität. In Zellen können sie schnell zu inaktiven Säuren oxidiert werden. Alternativ wurden daher stabilere Ketone wie 38 und 39a-d entwickelt.[77,78] 38 und 39b können bei Konzentrationen < 1 μM die TL-Aktivität

nicht inhibieren, erweisen sich jedoch als aktiv gegen die CL-Aktivität und mehr als hundertfach selektiver gegenüber Calpain I.

(38)

Peptidboronsäuren. Wenngleich das Boronsäure-Analogon MG262 (40, Abb. 23) von MG132 als Inhibitor des Proteasoms etwa hundertfach potenter als dieser ist (Ki = 18 pM), weisen bereits Peptidboronsäuren, aufgebaut aus nur zwei Aminosäuren (Bortezomib, 41), eine Inhibition von Ki< 1 nM auf. Da auch eine höhere Selektivität und praktische Vorteile wie Löslichkeit und Membranpermeabilität gegeben sind, besitzt diese Gruppe der Proteasom-Inhibitoren ein hohes Potential zur therapeutischen Anwendung.

Das p-Orbital des Boratoms interagiert mit dem einsamen Elektronenpaar des Sauerstoffs der Hydroxygruppe aus Thr1 (Abb. 25B). Die Bindung ist zwar reversibel, die Dissoziationsrate aber so niedrig, dass die Inhibition tatsächlich für Stunden irreversibel ist. Das Konzept der „Retro-Sequenz“ wurde in Boronsäure 42 (IC50 (CL) = 53 μM) verwirklicht.[76]

B OH OH N N O N H N O O N N N H N B OH OH O O 41 Bortezomib O N H H N N H B O O O 40 MG262 OH OH 42

Abb. 23. Peptidboronsäuren als Proteasom-Inhibitoren.

Peptidvinylsulfone und -vinylester. Einige peptidische Vinylsulfone sind Proteasom-Inhibitoren und reagieren irreversibel mit dem active site-Threonin. Die Vinylsulfongruppe erfährt im aktiven Zentrum durch Wasserstoffbrücken eine zusätzliche Aktivierung und wird von Thr1OJ als Michael-Akzeptor angegriffen (Abb. 25C). In Abwesenheit bestimmter Enzyme sind diese Inhibitoren relativ inert, weisen aber einen Mangel an Spezifität auf und hemmen ebenso Cystein-Proteasen, für deren Inhibition sie ursprünglich entwickelt wurden. Ein Beispiel höherer Selektivität ist NLVS (43, Abb. 24), das man erhält, wenn die Z-Schutzgruppe im Vinylsulfon-Analogon von MG132 gegen eine 3-Nitro-4-hydroxy-5-iodphenylacetyl-Gruppe ausgetauscht wird. Die Selektivität des Inhibitors wird durch den Peptidrest gesteuert.

Eine analoge Reaktivität wird auch im Fall von Vinylestern wie 44 angewendet.[79] Ester 44 ist hochpotent und zeigt eine gewisse Selektivität zwischen den einzelnen Untereinheiten (IC50 (CT) = 1.83 μM, IC50 (TL) = 0.095 μM, IC50 (PGPH) > 10 μM) sowie anderen Proteasen.

(39)

N H H N N H S H2N O O O O N O N H H N N H S H2N O O O O H N OH O N H H N N H O O O 43 NLVS I HO NO2 S O O N H H N N H O O O O O O NH2 Br 44 O O O O 45 46 NH NH H2N

Abb. 24. Irreversible Proteasom-Inhibitoren: Vinylsulfone 43, 45 und 46 sowie Vinylester 44. 45 ist E2-selektiv, 46 inhibiert auch E1 und E5.

Vinylsulfon 45 inhibiert nur die TL-Aktivität (E2).[80] 45 kann selbst bei einer Konzentration

von 100 μM die Zentren E1 und E5 nicht besetzen. In Vinylsulfon 46 befinden sich andere Reste P3 und P4 bei sonst gleicher Struktur. 46 kann zwischen den Untereinheiten nicht unterscheiden und inhibiert unselektiv E1, E2 und E5. Dies zeigt, dass selbst vom aktiven Threonin entfernte Zentren starken Einfluss auf die Spezifitäten der Untereinheiten besitzen.

H N O H O H3N O Proteasom N HHOB OH O NH3 O Proteasom N H S O O O Proteasom O H2N A B C

Abb. 25. Wechselwirkung der Inhibitoren mit den katalytischen Threoninen im Proteasom. A) Aldehyd, B) Boronsäure, C) Vinylsulfon.

Epoxyketone. Epoxomicin 47 und Eponemycin 48 sind natürliche D-Ketoepoxide aus einem Stamm von Actinomyceten (Abb. 26). Sie inhibieren das Proteasom mit der höchsten bekannten Selektivität. Die Kristallstruktur des Hefe-20S-Proteasoms, komplexiert mit Epoxomicin, lässt einen Morpholinring zwischen dem aktiven Thr1 und dem Epoxyketon erkennen (Abb. 26, III, Abb. 27). Der Sechsring entsteht unter Angriff des N-terminalen Threonins mit seiner Hydroxygruppe auf die Carbonylfunktion (I) sowie durch die

(40)

Ringöffnung anhand des nukleophilen Angriffs der Aminfunktion des Threonins auf das Epoxid (II). N N H H N N H O O O O O O OH 47 Epoxomicin H N N H O O O OH O 48 Eponemycin OH HO H2N H N O Proteasom H O H N H O O H2N O N H O HN N H OH OH O HN Proteasom N H O O O Proteasom H I II III

Abb. 26. Epoxyketone 47 und 48 als Proteasom-Inhibitoren und ihr Bindungsmechanismus mit Thr1.

Dieser besondere Mechanismus erklärt die hohe Spezifität der Epoxyketone. Aufgrund des Fehlens eines freien benachbarten N-Terminus zur nukleophilen Gruppe in Cystein- oder Serin-Proteasen ist eine analoge Reaktion dort nicht möglich. Während Epoxomicin vor allem mit dem CL-aktiven Zentrum reagiert, unterscheidet Eponemycin nicht zwischen den verschiedenen Zentren.

E-Lactone. Lactacystin (49, Abb. 28A) ist ein Metabolit aus Streptomyceten. Im neutralen bis leicht basischen Medium wird es spontan in ein clasto-Lactacystin-E-lacton (Omuralide) überführt. Im Gegensatz zu Lactacystin sind Zellmembranen permeabel bezüglich des E-Lactons. Dieses E-Lacton ist die eigentliche aktive Komponente, reagiert mit Thr1 in den aktiven Zentren und liegt als Ester gebunden vor (Abb. 28A).

Hierbei inhibiert es bevorzugt die E5-Untereinheit, die beiden anderen Untereinheiten nur mit geringer Geschwindigkeit. Der Grund dafür liegt in den Abweichungen der S1-Taschen jener Untereinheiten.

(41)

A

C B

Abb. 27. A) Epoxomicin (47, orange) gebunden an das katalytische Thr1 (gelb) in der E5-Untereinheit (solid ribbon, blau) (PDB: 1G65). B) Epoxomicin in der aktiven Tasche der E5-Untereinheit. GaussConolly Oberfläche (MOE 2005.06). Blaue Oberfläche: hydrophil, grüne Oberfläche: hydrophob. C) Morpholinring gebildet aus dem Epoxomicin (orange) und Thr1 (gelb).

Durch die Isopropyl-Seitenkette des E-Lactons wird ein Valin oder Leucin imitiert. Diese Seitenkette kann mit der Aminosäure Met45 wechselwirken. Im Fall von E oderE2 ist dies nicht möglich, durch polare Seitenketten wird die Verweilzeit des E-Lactons am aktiven Zentrum verkürzt und eine Reaktion mit Thr1 unwahrscheinlicher. Die Inhibition durch das E -Lacton wird als irreversibel betrachtet, der J-Lactamring verdrängt ein zur Abspaltung des Esters notwendiges Wassermolekül an Thr1. Langsame Hydrolyse des Inhibitor-Enzym-Adduktes kann jedoch durchaus erfolgen (t1/2 = 20 h). Lactacystin ist ein wesentlich selektiverer Inhibitor als z.B. die Peptidaldehyde, aber auch viel weniger stabil.

Homobelactosin C (50, Abb. 28B) gehört ebenfalls zur Gruppe der E-Lactone.[81] Es handelt sich dabei um ein Derivat des Naturstoffes Belactosin C aus Streptomyceten. Homobelactosin C inhibiert selektiv die CL-Aktivität (E5) des Proteasoms. Omuralide bzw. Homobelactosin C besetzen mit ihrem Isopropyl- bzw. Butylrest die Tasche S1 (Abb. 28C). Mit seinen anderen Resten füllt Homobelactosin C jedoch die Taschen der S’-Seite, während sich alle weiteren Inhibitoren mit bekannter Kristallstruktur in die S-Taschen fortsetzen.

(42)

NH O OHS O OH NH O O HO 49 Lactacystin -NAcCys NH O OH O O clasto-Lactacystin-E-Lacton (Omuralide) Proteasom-Thr1 NH O OHO O OH HN H2N O Proteasom Ester-Addukt H N HN N H O O O O O O O O 50 Homobelactosin C

A

B

C

Abb. 28. A) Reaktion von Lactacystin 49 zum clasto-Lactacystin-E-lacton und Ringöffnung durch das Proteasom. B) Struktur von Homobelactosin C. C) Homobelactosin C (50, orange) besetzt mit dem

sek-Butylrest die S1-Tasche, der Rest des Moleküls füllt die S’-Taschen (PDB: 2FNY). GaussConolly

Oberfläche (MOE 2005.06). Blaue Oberfläche: hydrophil, grüne Oberfläche: hydrophob, graue Oberfläche: exponiert.

Genannt werden sollen auch E-Lactame des Typs von Verbindung 51 (Abb. 29).[82] Es handelt sich hierbei um Inhibitoren der E5-Untereinheit (IC50 (CL) = 20 nM). Massenspektrometrisch wurde eine kovalente Bindung zu dieser Untereinheit nachgewiesen, und ein ähnlicher Bindungsmechanismus mit Thr1 wie im Fall der E-Lactone liegt nahe.

TMC-95A – ein nicht-kovalent bindender Inhibitor. Eine Reihe von Verbindungen TMC-95 aus Apiospora montagnei besitzt gegenüber der E5-Untereinheit des Proteasoms eine inhibierende Aktivität im niederen nanomolaren Bereich (IC50 (CL) = 2.3 nM), inhibiert jedoch auch die TL- und PGPH-Aktivität. Die Wirkung von TMC-95A (52, Abb. 29) beruht im Gegensatz zu anderen Inhibitoren nicht auf seiner Modifikation durch das N-terminale Threonin selbst, sondern auf zahlreichen Wasserstoffbrücken, die zwischen TMC-95A und den aktiven Zentren des Proteasoms gebildet werden.

(43)

O N H H N O O N H O NH O 51 N H HO NH HO NH O O NH O CH3 H OH O N H O CONH2 O CH3 CH3 52 TMC-95A

Abb. 29.E-Lactam 51 und TMC-95A 52. 51 gilt als kovalenter Inhibitor. 52 bindet nicht-kovalent an die aktive Tasche des Proteasoms.

Die Anordnungen im Komplex mit dem Proteasom sind ähnlich wie bei den Aldehyd-Inhibitoren. Die Propylen-Seitenkette reicht in die S1-Tasche, die Asparagin-Seitenkette des Inhibitors ragt weit in die S3-Tasche was die unterschiedlichen Selektivitäten in Hinsicht auf die einzelnen aktiven Untereinheiten im Proteasom erklärt. Aufgrund der Ringspannung in TMC-95A kommt dieses in gebundenem Zustand in der gleichen Konformation wie im ungebunden vor, wodurch dieser bei Komplexierung des Proteasoms keine Einschränkung in den inneren Freiheitsgraden erfährt.

Richtlinien zur Synthese von Proteasom-Inhibitoren. Nicht-kovalent bindende Inhibitoren wie TMC-95A erscheinen für eine medizinische Anwendung besonders interessant, da sie aufgrund einer reversiblen Bindung möglicherweise weniger zytotoxisches Potential besitzen könnten. Prinzipiell können jedoch auch kovalent bindende Inhibitoren reversibel mit dem Proteasom verknüpft sein.

Es existiert eine Anzahl von Tripeptid-Inhibitoren, die eine gute Selektivität bezüglich des Proteasoms und dessen Untereinheiten besitzen. Diese Sequenzen können je nach Anforderung in weiteren Entwicklungen übernommen bzw. darauf aufgebaut werden. Hierüber lässt sich weitgehend die Zellgängigkeit der Inhibitoren bestimmen.

1.3 Aufgabenstellung

Zielsetzung dieser Arbeit ist die Synthese von BACE- und Proteasom-Inhibitoren. Dabei stehen drei Aspekte im Vordergrund: Erstens sollen Strategien zur Synthese von Inhibitoren entwickelt werden. Zweitens sollen potentielle Inhibitoren generiert werden, die möglicherweise neuartige oder bekannte, aber modifizierte Wechselwirkungen mit den aktiven Resten der Enzyme bzw. mit deren subpockets aufweisen. Drittens sind Inhibitoren

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