Um Vorliegen und Verteilung unterschiedlicher Mastzellproteasen bei an IBD erkrankten Katzen und gesunden Kontrollkatzen feststellen und vergleichen zu können, wurden die vorliegenden Proben mittels einer enzymhistochemischen und immunhistochemischen Doppelfärbung untersucht. Die Protease Chymase wurde hierbei mittels eines Naphthol AS-D Chloroazetat Esterase Kits enzymhistochemisch dargestellt, während die Protease Tryptase durch Einsatz eines monoklonalen Antikörpers mittels der Streptavidin-Biotin-Peroxidase-Komplex-Methode immunhistochemisch sichtbar gemacht wurde. Durch die Kombination dieser beiden Färbemethoden wurden auch Zellen, die beide Proteasen enthielten, dargestellt.
3.7.1 Primärer Antikörper
Zur Darstellung des Enzyms Tryptase wurde ein kommerziell erhältlicher monoklonaler Antikörper (Isotyp IgG1) aus der Maus gegen humane Tryptase (Klon AA1, Fa. DakoCytomation GmbH, Hamburg) eingesetzt. Die Gebrauchskonzentration von 1:80 wurde bei jeder einzelnen Färbung durch Verdünnung mit PBS, dem vorher 1%iges bovines Serumalbumin (BSA; Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen) zugegeben wurde, frisch angesetzt. Der Antikörper wurde unverdünnt bei 4°C kühl gelagert.
3.7.2 Sekundärer Antikörper
Als Sekundärantikörper wurde ein in der Ziege hergestellter, gegen Mäuse IgG (H+L) gerichteter biotinylierter, mittels Affinitätschromatografie aufgereinigter Antikörper angewandt (BA 9200, Fa. Vector Laboratories Inc., Burlingame). Die verwendete, als S0913 gekennzeichnete Charge wies laut Herstellerangaben für Katzengewebe eine Kreuzreaktivität von 1% auf. Chargen mit höherer Kreuzreaktivität erwiesen sich bei Vorversuchen als ungeeignet. Vor der ersten Anwendung wurde der lyophilisiert
gelieferte Zweitantikörper in 1000 µl PBS gelöst und anschließend bei 4°C kühl gelagert. Direkt vor dem Gebrauch wurde eine Gebrauchskonzentration von 1:200 durch Zugabe von PBS hergestellt.
3.7.3 Spezifitätskontrollen
Spezifitätskontrollen ermöglichen die Beurteilung, ob es sich um spezifische oder unspezifische Farbreaktionen handelt sowie eine Überprüfung der Reaktivität der eingesetzten Reagenzien. Daher wurden bei jedem Versuch sowohl zwei Positivkontrollen als auch eine Negativkontrolle mitgeführt, um die Aussagekraft des erhaltenen Ergebnisses beurteilen zu können. Für den Chymasenachweis existierte in den untersuchten Schnittpräparaten zusätzlich eine interne Kontrolle in Form von Erythrozyten, die sich bei Zusatz des Naphthol AS-D Chloroazetat Esterase Kits ebenfalls bläulich anfärbten, sich jedoch in einem blasseren, anderen Blauton als die Chymase positiven Mastzellen darstellten. Durch eine interne Kontrolle können auftretende Unterschiede aufgrund von Fixation und Gewebeeinbettung ausgeschlossen werden. Als Positivkontrolle diente ein Hautbioptat einer Katze mit allergisch bedingter Dermatitis, bei dem im H.E. gefärbten Schnittpräparat zahlreiche Mastzellen in der Dermis vorhanden waren. Diese Kontrolle diente zum Nachweis, dass es sich um eine Mastzell-spezifische Anfärbung innerhalb der Spezies Katze handelte. Als zweite Positivkontrolle wurde ein Hundedarm eingesetzt, um sowohl die Spezifität der Reaktion als auch die einwandfreie Reaktivität der Reagenzien sicherzustellen, da die Methode von KUBE et al. (1998) am Hundedarm etabliert und in Anlehnung daran im Rahmen dieser Studie für den Katzendarm etabliert wurde.
Als Negativkontrolle wurde jeweils ein Gewebeschnitt einer Kontrollkatze mit normaler Darmmorphologie pro 10 zu untersuchende Schnitte eingesetzt. Anstelle des Primärantikörpers wurde die Negativkontrolle mit Aszitesflüssigkeit von Balb/c Mäusen (Biologo, Dr. Hartmut Schultheiß e.K., Immunbiologische Produkte, Kronshagen) behandelt, so dass unspezifische Bindungen anderer Proteine, die bei der Antikörperherstellung potentiell im Zellkulturüberstand enthalten sein könnten, imitiert und als unspezifische Bindung erkennbar gewesen wären. Die Verwendungskonzentration von 1:800 wurde direkt vor dem Gebrauch unter Zugabe von PBS mit 1%igem BSA hergestellt.
3.7.4 Immunhistochemische Nachweismethode
In einem ersten Schritt wurden die formalinfixierten Paraffinschnitte in Rotihistol (Fa.
Roth C. GmbH & Co. KG, Karlsruhe) entparaffiniert und anschließend in einer absteigenden Alkoholreihe rehydriert. Dieses Vorgehen ist notwendig, weil alle nachfolgenden Reaktionen in wässrigen Medien ablaufen und die Reagenzien ansonsten nicht in das Gewebe eindringen könnten. Die sich daran anschließende Demaskierung ist essenziell, weil Formalin bei der Fixierung mit basischen Aminosäuren des Gewebes reagiert, was zu einer Quervernetzung dieser durch Hydroxymethylbrücken führt. Dadurch bleibt die Morphologie der fixierten Gewebe zwar gut erhalten, aber die Permeabilität für Makromoleküle sinkt. Um Epitope nachweisen zu können, die auf diese Weise maskiert wurden, ist eine enzymatische Behandlung nötig, die diese Epitope durch Proteolyse für den Primärantikörper wieder zugänglich macht. Die besten Ergebnisse wurden mit Protease XIV (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen), die Actinase E und Pronase E enthält, bei pH 7,4 und 37°C erzielt. Eine hitzeinduzierte Demaskierung (Citratpuffer;
Demaskierungslösung G) blieb ergebnislos. Anschließend wurde die endogene Peroxidaseaktivität durch Zugabe von H2O2 (VWRTM International GmbH, Darmstadt) gehemmt. Dies dient der Reduktion unspezifischer Färbungen durch endogenes Biotin. Die Visualisierung der Antigene erfolgte mittels der indirekten Streptavidin-Biotin-Peroxidase-Komplex-Methode (ABC-Methode), die zurzeit zu den sensitivsten immunhistochemischen Darstellungsmethoden zählt. Das Prinzip basiert auf einer hohen Affinität von Streptavidin zu Biotin. Nach der Antigenerkennung durch den Primärantikörper bindet der biotinylierte Sekundärantikörper an dessen Fc-Teil. Die Bindung des Peroxidase konjugierten Streptavidin-Biotin-Komplexes erfolgt an das Biotin des Zweitantikörpers. Die Peroxidase katalysiert bei Anwesenheit von H2O2 als Elektronendonor die Oxidation des zugefügten Chromogens zu einem ausfallenden Farbsubstrat. Dieses bildet sich also an derjenigen Stelle, an welcher der Erstantikörper sich an sein Epitop gebunden hat und macht dieses somit indirekt sichtbar. Anschließend erfolgte die enzymhistochemische Färbung der Gewebeschnitte.
3.7.5 Bestandteile des Naphthol AS-D Chloroazetat Esterase Kits
Für den Nachweis von Chymase wurden als Puffer TrizmalTM 6,3 Konzentrat, als Enzymsubstrat Naphthol AS-D Chloroazetat Lösung, als Farbsubstrat Fast blue BB Basislösung und als Katalysator der Reaktion Natriumnitrit Lösung eingesetzt. Das komplette Kit stammt von der Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Traufkirchen.
3.7.6 Enzymhistochemische Nachweismethode
Der Nachweis des Enzyms Chymase basiert darauf, dass diese Protease das zugegebene Substrat Naphthol AS-D Chloroazetat in seine Bestandteile aufspaltet und auf diese Weise Naphthol freisetzt. In Gegenwart des Katalysators Natriumnitrit reagiert Naphthol mit dem Farbstoff Fast blue BB – einem Diazoniumsalz – und bildet einen farbigen Niederschlag an der Stelle, wo sich die Chymase befindet. Für diese Enzymreaktion ist die Einhaltung einer optimalen Temperatur von 37,0°C bis 37,5°C essenziell, da sonst schlechtere Reaktionsergebnisse erzielt werden. Der richtige pH-Wert wird durch Zugabe des Trizmalpuffers erreicht. Als besonders wichtig hat sich das an den Färbeprozess anschließende Spülen mit Aqua destillata erwiesen, denn sobald stattdessen mit PBS gespült wurde, waren die Färbeergebnisse deutlich schlechter. Die Einwirkdauer des Farbstoffs muss für jedes Gewebe und jede Tierart individuell ermittelt werden. Für den Katzendarm hat sich eine Länge von 20 Minuten als optimal erwiesen. Laut Herstellerangaben eignet sich diese Methode, um verschiedene Zellarten nachzuweisen. Promyelozyten, neutrophile Granulozyten und Mastzellen sollen die stärkste Färbeintensität aufweisen, während Myeloblasten, basophile Granulozyten, Monozyten und Histiozyten eine mäßige Färbeintensität zeigen sollen. Diese unterschiedlich starke Färbung beruht auf einer unterschiedlich starken Enzymaktivität (YAM et al. 1971) bzw. auf unterschiedlichen Konzentrationen des Enzyms innerhalb dieser Zellen (IRANI et al. 1986; SCHWARTZ et al. 1987). Die angefärbten Zellarten lassen sich anhand ihres Vorkommens in den verschiedenen Geweben und ihrer Zellmorphologie gut identifizieren und unterscheiden. Da beide in der Doppelfärbung verwendeten Farbsubstrate in organischen Lösungsmitteln löslich sind, wurden die
Gewebeschnitte im Anschluss an die enzymhistochemische Färbung mit einem wässrigen Eindeckmedium (DakoCytomation GmbH, Hamburg) eingedeckt.
3.7.7 Unspezifische Hintergrundfärbung
Zur Vermeidung unspezifischer Hintergrundfärbungen wurden verschiedene Strategien verfolgt. Wie bereits oben erwähnt, müssen endogene Enzymaktivitäten blockiert werden, um unspezifische Oxidationen mit Ausfall des Farbsubstrats zu vermeiden. Da mit der ABC-Methode gearbeitet wurde, muss die im Gewebe vorhandene Peroxidase gehemmt werden. Diese kommt zum einen in Hämoproteinen wie Hämoglobin und Myoglobin vor, zum anderen befindet sie sich auch in Form von Zytochromen in neutrophilen Granulozyten und Monozyten sowie als Katalase in Niere und Leber. Die Hemmung der endogenen Peroxidase wird durch Zugabe von 0,5 %igem H2O2 erreicht. Um die unspezifische Bindung von Antikörpern an Gewebeproteine aufgrund hydrophober Wechselwirkungen zu vermeiden, werden die Schnitte direkt vor dem Auftragen des Primärantikörpers mit 1:5 verdünntem inaktivierten Ziegen-Normalserum überschichtet. Durch die Serumproteine werden die hydrophoben Wechselwirkungen abgedeckt und die anschließende Inkubation mit dem ersten Antikörper führt ausschließlich zu einer erwünschten spezifischen Bindung an dessen Epitope. Das eingesetzte Blockserum stammt aus der Tierspezies, in welcher der Sekundärantikörper hergestellt wurde, um zusätzlich eine unspezifische Bindung des zweiten Antikörpers durch den ersten zu verhindern. Eine weitere Strategie zur Minimierung der Bindung des hydrophoben Erstantikörpers an die Gewebeproteine stellt der Zusatz von 1%igem Rinderserumalbumin (BSA) zum Verdünnungsmedium des Antikörpers dar. Hierbei sollen sich die hydrophoben Immunglobuline an die Proteine des Verdünnungsmediums binden und daher nicht mehr mit den Gewebeproteinen aufgrund von Wechselwirkungen reagieren. Dieses ist die am häufigsten gebrauchte Methode, um unspezifischen Hintergrundfärbungen, verursacht durch hydrophobe Wechselwirkungen, vorzubeugen. Bei gleichzeitigem Vorliegen von hydrophoben und elektrostatischen Wechselwirkungen kann es zu einer unspezifischen Bindung von Immunglobulinen an Kollagen und Elastin kommen. Hierfür werden verschiedene Ursachen diskutiert. Zur Vermeidung kann lediglich eine Erhöhung der
Antikörperverdünnung führen, welche aber durch die meist eingeschränkte Darstellbarkeit des Antigens auf ein Maximum limitiert ist. Ein weiteres wichtiges Vorgehen, um unspezifische Hintergrundfärbungen zu vermeiden, ist das gründliche Spülen nach jedem Reaktionsschritt, um überschüssige Reagenzien sorgfältig zu entfernen.