GLP3 vermittelt in Arabidopsis thaliana Resistenz gegenüber Verticillium

Proteomanalysen der apoplastischen Waschflüssigkeit von A. thaliana haben gezeigt, dass drei verschiedene Peroxidasen, eine Serin-Carboxypeptidase, eine α-Galactosidase und ein Germin-ähnliches Protein (GLP3) infolge einer Infektion durch V. longisporum in

größeren Mengen auftreten, während ein Lektin-ähnliches Protein in geringeren Mengen vorkommt als in den mock-inokulierten Pflanzen. Auch auf Transkriptebene sind diese Unterschiede vorhanden (Flörl 2007). Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Rolle dieser Proteine im Hinblick auf die Abwehrfunktion gegen V. longisporum untersucht.

Apoplastische Proteine sind ein wichtiger Teil der Immunantwort gegen Pathogene und können deren Wachstum direkt beeinflussen (siehe Kapitel 4.1). Eine Verringerung der Mengen der für die Abwehr wichtigen Proteine im Apoplast kann die Suszeptibilität einer Pflanze gegenüber einem Pathogen erhöhen, während eine konstitutive Überexpression zu einer Resistenz führen kann (van Loon et al. 2006). Es ist aber auch möglich, dass ein Pathogen mit der Immunantwort interferiert und die beobachteten Veränderungen herbeiführt (Boller & He 2009). In einem solchen Fall wären Pflanzen mit einer verringerten Menge des entsprechenden Proteins resistenter.

Zur Überprüfung der Bedeutung der V. longisporum-responsiven Proteine wurden transgene Pflanzen hinsichtlich ihrer Suszeptibilität gegenüber V. longisporum untersucht.

Für 5 der 7 Kandidaten, nämlich für die Peroxidase 52, Serin-Carboxypeptidase, α-Galactosidase, LLP und GLP3, konnten T-DNA-Insertionslinien mit einer verringerter Transkriptmenge identifiziert werden. Von diesen Linien reagierte nur die GLP3 betreffende Mutante mit einer erhöhten Suszeptibilität auf eine Infektion mit V.

longisporum, während die anderen Linien in ihrem Pathophänotyp dem Wildtyp glichen.

Trotz der unveränderten Suszeptibilität der transgenen Linien bezüglich der Serin-Carboxypeptidase, der α-Galactosidase, des Lektin-ähnlichen Proteins und der Peroxidasen kann ihre Rolle in Abwehrfunktionen nicht ausgeschlossen werden, da homologe Proteine die Funktion der reprimierten Gene teilweise oder vollständig übernehmen könnten. Eine solche Redundanz ist vor allem bei den Peroxidasen wahrscheinlich, da die einzelnen Familienmitglieder sich in diesem Fall besonders stark ähneln (Cosio & Dunand 2009).

Die Rolle der Peroxidasen konnte nicht vollständig untersucht werden, weil keine T-DNA-Insertionslinie für POD34 und POD37 mit einer verringerten Expression, sondern lediglich solche mit einer leicht erhöhten Transkriptmenge identifiziert werden konnten. Auch amiRNA-Linien, in denen speziell POD34, POD37 und POD52 betroffen sind, konnten nicht hergestellt werden. Obwohl Peroxidasen im Allgemeinen mit Abwehrfunktionen wie Zellwandverstärkungen und der Bildung von ROS assoziiert werden, bleibt die spezifische

Funktion von POD34, POD37 und POD52 im Hinblick auf Abwehrfunktionen gegen V.

longisporum noch unklar.

Für GLP3 konnte in dieser Arbeit eine Rolle für die Abwehr gegen V. longisporum nachgewiesen werden. Die glp3-Mutante zeigte eine verstärkte Suszeptibilität gegenüber V. longisporum. Die Komplementierung der glp3-Mutante konnte deren verstärkte Suszeptibilität zwar nicht vollständig revertieren, die komplementierten Pflanzen waren aber dennoch tendenziell toleranter als die glp3-Mutante. Dass der Effekt relativ gering war, kann daran liegen, dass die komplementierten Pflanzen generell kleiner waren als die nicht komplementierte glp3-Mutante. AmiRNA-Pflanzen mit einer deutlich verringerten glp3-Transkriptmenge zeigten eine stärkere Verticillium-bedingte Wuchsdepression als der Wildtyp und konnten so die mit der glp3-Mutante gewonnenen Ergebnisse bestätigen. Des Weiteren waren Pflanzen mit einer konstitutiv erhöhten glp3-Expression toleranter gegenüber V. longisporum. Bei diesen Überexpressionspflanzen war die Reduktion der Wuchsparameter nicht so stark ausgeprägt wie bei Wildtyp-Pflanzen oder der glp3-Mutante, zudem enthielten sie auch deutlich geringe Mengen pilzlicher DNA.

Insgesamt betrachtet scheint also die Toleranz von A. thaliana gegenüber V. longisporum mit der glp3-Expression zu korrelieren. Hinweise darauf, dass GLP3 aus A. thaliana (AtGLP3) eine Rolle bei der Immunantwort spielt, liefern auch Experimente, bei welchen die Induktion von glp3 durch das fungale Pathogen Colletotrichum higginsianum dokumentiert wurde (Narusaka et al. 2004). Des Weiteren können auch andere Mitglieder der Superfamilie der Germine und Germin-ähnlichen Proteine in diversen Pflanzen Resistenz gegenüber den verschiedensten Pathogenen vermitteln. So ist Weizen resistenter gegenüber Mehltau, wenn bestimmte GLPs in der Pflanze überexprimiert werden (Schweizer et al. 1999, Christensen et al. 2004). Auch in Gerste führt eine Überexpression von einigen GLPs zu einer erhöhten Resistenz gegen Mehltau, während Pflanzen mit einer verringerten Expression suszeptibler sind (Zimmermann et al. 2006). Eine Reduktion der Transkriptmengen verschiedener GLPs in Reis verursacht ebenfalls eine erhöhte Suszeptibilität gegen pilzliche Pathogene (Manosalva et al. 2009). An Tabakpflanzen sind die Schäden durch Herbivorie bei einer verringerten Menge eines Germin-ähnlichen Proteins größer (Lou & Baldwin 2006). Kürzlich konnte gezeigt werden, dass das aus Zuckerrübe isolierte BvGLP-1-Gen bei Expression in A. thaliana eine Resistenz gegenüber V. longisporum und Rhizoctonia solani verursacht (Knecht et al. 2010). In weiteren

Pflanzen werden Germin-ähnliche Proteine infolge einer Infektion durch verschiedene Pathogene induziert, wie z. B. VvGLP3 in Wein durch Mehltau (Godfrey et al. 2007), verschiedene GLPs in Kiefer durch das pilzliche Pathogen Ceratobasidium bicorne (Jøhnk et al. 2005) und ein Germin-ähnliches Protein in Mais nach einer Virusinfektion (Uzarowska et al. 2009).

Durch diese Arbeit konnte gezeigt werden, dass auch AtGLP3 eine große Bedeutung hinsichtlich der Immunantwort aufweist, da es in A. thaliana Resistenz gegenüber V.

longisporum vermitteln konnte. In diesem Zusammenang entstand die Frage, durch welche Mechanismen das Protein in der Pflanze gegen das Pathogen wirkt.

Einige der Mitglieder der GLP-Familie besitzen enzymatische Aktivitäten. Ein Germin-ähnliches-Protein aus Gerste (HvGER2) weist beispielsweise eine ADP-Glukose pyrophosphatase/phosphodiesterase (AGPPase) Aktivität auf (Bernier and Berna 2001, Rodríguez-López et al. 2001, Breen & Bellgard 2010). Häufiger sind bei GLPs Mangan-abhängige Enzymaktivitäten, bei denen H2O2 freigesetzt wird, zu beobachten (Woo et al.

2000, Dunwell et al. 2004). Dabei fungieren einige GLPs als Superoxid-Dismutasen und degradieren Sauerstoff-Radikale (Woo et al. 2000, Breen & Bellard 2010), andere dagegen als Oxalat-Oxidasen, welche die Degradation von Oxalsäure katalysieren (Woo et al.

2000). Oxalsäure wird von einigen Pathogenen produziert und stellt einen Virulenzfaktor dar (Godoy et al. 1990). Eine Oxalat-Oxidase verhindert also einerseits die Schädigung durch die Oxalsäure, des weiteren entsteht bei der Reaktion neben CO2 auch H2O2, wodurch weitere Abwehrreaktionen aktiviert werden (Dunwell et al. 2004, Breen &

Bellard 2010). AtGLP3 produziert in vitro jedoch kein H2O2, wenn Oxalat als Substrat angeboten wird (Membre et al. 2000).

Weitere Informationen über AtGLP3, die auf die Funktion im Hinblick auf Abwehrreaktionen schließen lassen, gibt es nur wenige. Bisher wurde vor allem die Expression sehr gut analysiert. Für diese konnte ein tageszeiten-abhängiger Rhythmus, verursacht durch den Wechsel zwischen Licht und Dunkelheit, nachgewiesen werden, wobei die Transkriptmenge zu Beginn der Nacht am stärksten ist (Staiger et. al. 1999).

Lokalisiert werden konnte die glp3-Expression im Rahmen dieser Arbeit anhand von GUS-Reporterpflanzen in Blättern, den verschiedenen Teilen der Blüte und in den Schoten, während sie in den Wurzeln zu keinem Zeitpunkt detektiert werden konnte. Dieses Expressionsmuster wurde auch in Untersuchungen von GUS-Reporterpflanzen mit einem

verkürzten Promoter beobachtet (Staiger et al. 1999). Ebenso konnte mittels Northern Blot Analysen kein glp3-Transkript in Wurzeln detektiert werden (Membre et al. 1997). Auf Proteinebene konnte GLP3 dagegen in den Wurzeln detektiert werden, wenn auch in sehr geringen Mengen (Schlesier et al. 2004).

Innerhalb der Blätter konnte in dieser Arbeit in den GUS-Reporterpflanzen eine deutliche ß-Glucuronidase-Aktivität vor allem in den Mesophyllzellen und der Epidermis nachgewiesen werden, während diese im Leitgewebe nur sehr gering war. Zudem konnte für die Blätter eine Korrelation zwischen der glp3-Expression und dem physiologischen Alter festgestellt werden. Eine altersabhängige Expression von Atglp3 wurde auch im Infloreszenzstängel von A. thaliana beobachtet. Mittels Transkriptomanalysen wurde gezeigt, dass die Expression in älteren, basipetalen Abschnitten geringer ist als in weiter oben liegenden, jüngeren Bereichen (Ehlting et al. 2005, Minic et al. 2009). Auch das zu AtGLP3 homologe GhGLP1 aus Baumwoll-Fasern tritt vermehrt in Zellen auf, welche sich im Streckungswachstum befinden. Für dieses Protein wurde daher eine Funktion beim Streckungswachstum postuliert (Kim et al. 2004, Kim & Triplett 2004).

GLPs könnten eine Rolle bei Umgestaltungen und Modifizierungen der Zellwand spielen (Schweizer et al. 1999, Bernier & Berna 2001). Diese Funktion wurde allerdings hauptsächlich im Zusammenhang mit der H2O2-Produktion durch Oxalat-Oxidase- oder Superoxid-Dismutase-Aktivitäten postuliert (Bernier & Berna 2001). Die in dieser Arbeit untersuchte glp3-Muante mit einer verringerten glp3-Transkriptmenge zeigte in Querschnitten keinen Unterschied zum Wildtyp. Auch die Verticillium-induzierte Entstehung von hyperplastischem Xylem und die putative Transdifferenzierung konnte in der Mutante in ähnlicher Form beobachtet werden wie im Wildtyp.

Neben den putativen entwicklungsphysiologischen Funktionen von AtGLP3 zeigten die vorliegenden Untersuchungen, dass AtGLP3 relevant für die Toleranz von A. thaliana gegenüber V. longisporum war und die Menge des Pilzes in der Pflanze bei erhöhter glp3-Expression in planta abnahm. AtGLP3 kommt extrazellulär vor (Boudart et al. 2005, Charmont et al. 2005, Flörl 2007, Millar et al. 2009) und könnte deshalb das Pilzwachstum direkt beeinflussen. Um diese Hypothese zu prüfen, wurde GLP3 heterolog in Hefe exprimiert. Durch anschließende Wachstumsversuche konnte gezeigt werden, dass V.

longisporum schlechter wuchs, wenn der Pilz mit GLP3 produzierender Hefe koinkubiert wurde.

Daher ist es wahrscheinlich, dass AtGLP3 in A. thaliana das Pilzwachstum direkt minimiert und Resistenz gegen V. longisporum vermittelt, indem es einer massiven Kolonisierung des Pathogens innerhalb der Pflanze entgegenwirkt.

In Kapitel 4.1 wurde bereits diskutiert, dass eine Vielzahl an Proteinen, besonders PR-Proteine, antimikrobielle Eigenschaften aufweisen (van Loon et al. 2006).

Interessanterweise sind auch im Xylemsaft von Raps Germin-ähnliche Proteine enthalten (Kehr et al. 2005). In der apoplastischen Waschflüssigkeit von Raps wurde ebenfalls ein GLP identifiziert, welches die größte Übereinstimmung mit dem GLP3 aus A. thaliana aufweist (Floerl et al. 2008). Daher ist es möglich, dass ein oder mehrere Mitglieder der GLPs in Raps auch bei den Xylemsaft-Versuchen (Kapitel 4.1) an dem inhibitorischen Effekt beteiligt waren. Obwohl diverse Germin-ähnliche Proteine Resistenz gegen verschiedene Pathogene vermitteln können, wurde bisher für kein Mitglied dieser Multigenfamilie eine direkte wachstumshemmende Wirkung gegen Pathogene nachgewiesen. Dies wurde in der vorliegenden Arbeit erstmals gezeigt. Wichtig wäre nun in folgenden Untersuchungen den Mechanismus aufzuklären, durch welchen das Wachstum von V. longisporum inhibiert wird.