Analysen des Xylemsaftes von Brassica napus im Bezug auf potentielle

Um zu überprüfen, ob der Xylemsaft von Raps (B. napus var. napus) antifungale Eigenschaften aufweist und ob diese sich nach Infektion der Pflanzen mit V. longisporum verändern, wurde die Proliferation des Pathogens im Xylemsaft von infizierten Pflanzen und in Xylemsaft von Kontrollpflanzen in vitro untersucht. Dafür wurden Sporen von V.

longisporum in Xylemsaft inkubiert (Gesamtvolumen = 1 ml). Nach 3 Tagen wurde die Pilzmenge anhand von DNA-Messungen ermittelt (Punkt 2.2.3.3).

Die Ergebnisse zeigten, dass der Pilz im Xylemsaft von infizierten Pflanzen schlechter wuchs als im Xylemsaft von Kontrollen (Abb. 3). Während die Konzentration der Pilz-DNA im Xylemsaft von infizierten Pflanzen um 15 pg pro µl betrug, war sie im Xylemsaft von Kontrollpflanzen um etwa 50 % reduziert.

0 5 10 15 20 25 30

**

VL-DNA [pg/µl]

Xylemsaft K Xylemsaft +VL43

Abb. 3: Wachstum von V. longisporum im Xylemsaft von infizierten (schwarze Säule) und im Xylemsaft von mock inokulierten Pflanzen (weiße Säule). Der Xylemsaft wurde zwischen 25 und 28 dpi gewonnen. Abgebildet ist die mittlere Konzentration pilzlicher DNA nach 3tägier Inkubation mit Standardabweichung (n = 15 für Xylemsaft aus infizierten Pflanzen, n = 13 für Xylemsaft aus nicht infizierten Pflanzen). Signifikante Unterschiede (p ≤ 0,01) sind durch zwei Sterne gekennzeichnet. Die DNA-Messung wurde von der AG Karlovsky durchgeführt. Die Daten wurden bereits veröffentlicht (Floerl, Druebert et al. 2008).

Um auszuschließen, dass der beobachtete inhibitorische Effekt von Xylemsaft aus infizierten Pflanzen auf V. longisporum auf Unterschiede in der Nährstoffzusammensetzung zurückzuführen war, wurde die Konzentration von Zuckern, Aminosäuren, Mineralelementen sowie der Proteine bestimmt.

Die Konzentration von Glukose, Fruktose und Saccharose im Xylemsaft von infizierten Pflanzen unterschied sich nicht von der im Xylemsaft von Kontrollpflanzen (Abb. 4).

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

Zuckerkonzentration [mM]

Xylemsaft K Xylemsaft +VL43

Fruktose Saccharose Glukose

Abb. 4: Glukose, Fruktose und Saccharose im Xylemsaft infizierter (schwarze Säulen) und nicht infizierter Pflanzen (weiße Säulen). Der Xylemsaft wurde zwischen 25 und 28 dpi gewonnen. Dargestellt ist die mittlere Konzentrationen der einzelnen Zuckermetabolite mit Standardabweichung (n = 8).

Auch hinsichtlich der Proteinmenge gab es keine Unterschiede zwischen den Xylemsäften der unterschiedlich behandelten Pflanzen (Abb. 5). Die Summe aller löslichen Aminosäuren war in den verschiedenen Xylemsäften ebenfalls gleich (Abb. 6). Jedoch ergab die Messung signifikante Unterschiede bei einzelnen Aminosäuren. So war die Konzentration von Glycin und Isoleucin im Xylemsaft von infizierten Pflanzen erhöht, während die Menge an Tryptophan in infizierten Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen verringert war (Tabelle 13).

0 10 20 30 40 50 60 70

Xylemsaft K Xylemsaft +VL43

Proteinkonzentration [µg/ml]

Abb. 5: Gesamt-Proteinkonzentration im Xylemsaft infizierter (schwarze Säulen) und nicht infizierter Pflanzen (weiße Säulen). Der Xylemsaft wurde zwischen 25 und 28 dpi gewonnen. Dargestellt ist die mittlere Proteinkonzentrationen mit Standardabweichung (n = 5).

1,0 1,5 2,0 2,5

Konzentration der Aminosäuren [mM]

Xylemsaft K Xylemsaft +VL43

Abb. 6: Summe aller freien Aminosäuren im Xylemsaft infizierter (graue Box) und nicht infizierter Pflanzen (weiße Box). Der Xylemsaft wurde zwischen 25 und 28 dpi gewonnen. Die Daten sind dargestellt als Box-Plots (n = 5). Die Box beinhaltet 50 % der Werte. Die Linie innerhalb der Box stellt den Median dar. Zusätzlich ist der Mittelwert als Quadrat abgebildet.

Tabelle 13: Konzentration der verschiedenen Aminosäuren im Xylemsaft infizierter und nicht infizierter Pflanzen. Der Xylemsaft wurde zwischen 25 und 28 dpi gewonnen. Angegeben sind Mittelwerte ± Standardabweichung (n = 5). Signifikante Unterschiede zwischen den Konzentrationen im Xylemsaft infizierter und nicht infizierter Pflanzen sind durch unterschiedliche Buchstaben in Klammern gekennzeichnet.

Bezüglich der Mineralnährstoffe gab es geringe, jedoch signifikante Unterschiede bei einzelnen Elementen (Abb. 7). Die Konzentration von Kalium und Magnesium war im Xylemsaft von infizierten Pflanzen im Vergleich zu dem Saft aus Kontrollen erhöht, während die von Phosphor und Schwefel verringert war. Die Mengen von Calcium und Eisen waren im Xylemsaft von den unterschiedlich behandelten Pflanzen gleich.

P S K Ca Mg Fe

Abb. 7: Mineral-Nährelemente im Xylemsaft infizierter (schwarze Säulen) und nicht infizierter Pflanzen (weiße Säulen). Dargestellt ist die mittlere Konzentration von Phosphor (P), Schwefel (S), Kalium (K), Calcium (Ca), Magnesium (Mg) und Eisen (Fe) mit Standardabweichung (n = 5). Signifikante Unterschiede (p ≤ 0,05) zwischen den Xylemsäften der unterschiedlich behandelten Pflanzen sind mit einem Stern markiert. Der Xylemsaft wurde zwischen 25 und 28 dpi gewonnen.

Zusammenfassend ist also festzustellen, dass es nur geringfügige Unterschiede im Xylemsaft von infizierten und dem von Kontrollpflanzen hinsichtlich der Bestandteile gab, die V. longisporum als Nährstoffquelle benutzen kann. Der beobachtete Wachstumsunterschied des Pilzes im Xylemsaft von infizierten Pflanzen konnte also nicht durch eine geringere Nährstoffverfügbarkeit der hier untersuchten Bestandteile erklärt werden.

Als andere mögliche Substanz für den inhibierenden Effekt kam Salicylsäure in Frage. Im Xylemsaft von B. napus var. napus wurden signifikant höhere Mengen Salicylsäure (SA) sowie Salicylsäure-Glycosid (SAG) nach Infektion mit V. longisporum detektiert (Ratzinger et al. 2009). Daher wurde das oben beschriebene Wachstumsexperiment von V.

longisporum in Xylemsaft unter Zugabe von 3 µM Salicylsäure wiederholt. Die Konzentration von Salicylsäure richtete sich hierbei nach den Messergebnissen des Pflanzenhormons im Xylemsaft von B. napus Pflanzen nach Infektion mit V. longisporum (Ratzinger et al. 2009). Das Experiment wurde sowohl mit Xylemsaft von Kontrollpflanzen als auch mit PDB Medium durchgeführt. In keinem der beiden verschiedenen Versuchsansätze gab es Unterschiede hinsichtlich der DNA-Menge von V.

longisporum (Abb. 8). Salicylsäure hatte also keinen direkten Effekt auf das Pilzwachstum und konnte daher als Auslöser für das eingeschränkte Wachstum von V. longisporum im Xylemsaft von infizierten B. napus Pflanzen ausgeschlossen werden.

Abb. 8: Wachstum von V. longisporum unter dem Einfluss von Salicylsäure.

Dargestellt ist die Konzentration von Verticillium-DNA im Xylemsaft von Kontrollpflanzen (A) und in PDB-Medium (B) mit (dunkelgraue Säulen) und ohne (hellgraue Säulen) Zusatz von 3 µM Salicylsäure. Präsentiert werden Mittelwerte mit Standardabweichung (n = 6 für Xylemsaft, n = 10 für PDB-Medium). Der Xylemsaft wurde zwischen 25 und 28 dpi gewonnen. Die DNA-Messung wurde von der AG Karlovsky durchgeführt.

Neben dem putativen Nutzen der Proteine im Xylemsaft von Raps als Nährstoffquelle für V. longisporum könnten diese auch wachstumsinhibierende Eigenschaften gegen das Pathogen aufweisen. Da Floerl et al. (2008) Proteine mit putativ antifungalen Eigenschaften im Xylemsaft von Raps nachgewiesen hatten, sollte überprüft werden, ob diese Xylemsaft-Proteine das Wachstum von V. longisporum beeinflussen können und ob die nach Infektion durch V. longisporum neu oder vermehrt sekretierten Proteine für den beschriebenen inhibitorischen Effekt bezüglich des Wachstums des Pilzes im Xylemsaft von infizierten Pflanzen verantwortlich waren. Daher wurde der Einfluss der Proteine aus dem Xylemsaft von infizierten und nicht infizierten B. napus Pflanzen auf das Wachstum von V. longisporum in vitro untersucht. Dazu wurden die Wachstumsexperimente mit Xylemsaft wiederholt, aus dem Moleküle mit einem Molekulargewicht von mehr als 3 kDa durch Filtration entfernt wurden. In einem Bradford-Test konnten in filtriertem Xylemsaft keine Proteine mehr detektiert werden. Parallel dazu wurde das Wachstum des Pilzes in PDB-Medium untersucht, welches mit 15 µg/ml (Endkonzentration) der aus dem Xylemsaft heraus gefilterten Proteine versetzt wurde.

0

Die DNA-Menge von V. longisporum war nach 3tägiger Inkubation im proteinfreien Xylemsaft deutlich höher als die in ungefiltertem Xylemsaft (Abb. 9 A). Dieser Effekt war in gleichem Maße im Xylemsaft von infizierten wie in dem von Kontrollpflanzen zu beobachten. In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen konnte in Wachstumsexperimenten in PDB-Medium gezeigt werden, dass das Wachstum von V.

longisporum durch Zugabe der Proteine aus dem Xylemsaft im Vergleich zu nicht supplementiertem PDB-Medium deutlich eingeschränkt wurde (Abb. 9 B). Die Proteine im Xylemsaft von B. napus hatten also eine inhibierende Wirkung auf die Proliferation von V.

longisporum. Da die Proteine aus dem Xylemsaft von nicht infizierten Pflanzen ähnliche antifungale Eigenschaften aufwiesen wie die aus dem Xylemsaft von infizierten Pflanzen, lässt sich schlussfolgern, dass B. napus konstitutiv Proteine in den Apoplast sekretiert, die unkontrolliertes Wachstum von V. longisporum unterdrücken.

Abb. 9: Einfluss von Xylemsaft-Proteinen auf das Wachstum von V. longisporum.

Abgebildet ist die Konzentration von Verticillium-DNA im Xylemsaft (A) und in PDB-Medium (B) in Anwesenheit (schraffierte Säulen) oder Abwesenheit (graue, nicht schraffierte Säulen) von Xylemsaft-Proteinen. Präsentiert werden Mittelwerte mit Standardabweichung (n = 5). Signifikante Unterschiede zwischen den Proben mit und denen ohne Proteine sind durch zwei (p ≤ 0,01) oder drei ( p ≤ 0,001) Sterne gekennzeichnet. Zwischen der Behandlung mit Proteinen aus dem Xylemsaft aus Kontrollpflanzen (Xylemsaft (K) bzw. PDB + P (K)) und denen aus infizierten Pflanzen (Xylemsaft (+VL43) bzw. PDB + P (+VL43)) gab es keine Unterschiede (p = 0,4 im Xylemsaft bzw. p = 0,2 im PDB-Medium). Der Xylemsaft wurde zwischen 25 und 28 dpi gewonnen. Die DNA-Messung wurde von der AG Karlovsky durchgeführt.

3.2 Charakterisierung von T-DNA-Insertionsmutanten von