Anatomische Untersuchungen von Arabidopsis-Wildtyp-Pflanzen sowie

Veränderungen

Einigen der von einer Verticillium-Infektion beeinflussten Gene wird eine putative Funktion in der Modifikation der Zellwand zugeschrieben (siehe Einleitung). Zudem wurde eine Erhöhung des Lignin- und Zellwandanteils in infizierten Pflanzen im Vergleich zu mock inokulierten Pflanzen nachgewiesen (Flörl 2007).

Um zu untersuchen, ob diese Effekte auf einen Anstieg des Ligninanteils pro Zelle durch Verstärkung der Zellwand oder auf vermehrte Bildung von Zellen mit lignifizierten Wänden (z. B. Gefäße oder Fasern) zurückzuführen sind, wurden Hypokotyl- und Blattproben von infizierten Pflanzen anatomisch untersucht und mit mock inokulierten Pflanzen verglichen. Da für die glp3-Mutante eine erhöhte Suszeptibilität gegenüber V.

longisporum nachgewiesen werden konnte, wurden neben dem Wildtyp Col-0 auch die glp3-Mutante sowie der zugehörige Wildtyp Ws-2 hinsichtlich anatomischer Veränderungen untersucht. Von eingebetteten Proben wurden Querschnitte hergestellt.

Diese wurden mit Toluidinblau angefärbt. Dadurch färben sich lignifizierte Zellwände türkisblau, Cytplasma und unverholzte Primärwände dagegen violett. Zudem wurde die Autofluoreszenz detektiert, durch die phenolische Substanzen wie Lignin sichtbar werden.

Die Hypokotylproben des Wildtyps Col-0 ließen bereits in der Übersicht einen deutlichen Unterschied zwischen infizierten Pflanzen und den uninfizierten Kontrollen erkennen (Abb. 28, A und B). Während das Xylem bei den Kontrollen ungefähr ein Drittel der Fläche des Gesamt-Querschnitts einnahm, war es bei den infizierten Pflanzen deutlich größer. Detaillierte Aufnahmen des Xylems zeigen, dass die durch die türkisblauen Zellwände gut erkennbaren Gefäße in Kontrollpflanzen relativ groß und von einer Vielzahl lebenden Zellen (Parenchym und Collenchym) umgeben waren (Abb. 28, C). Infizierte Pflanzen dagegen verfügten über eine größere Anzahl Gefäße, die jedoch einen geringeren Durchmesser als die der Kontrollen aufwiesen (Abb. 28, D). Hinsichtlich der Zellwanddicke der Gefäße gab es jedoch keinen Unterschied zwischen infizierten und nicht infizierten Pflanzen. Neben den Gefäßen waren auch in infizierten Pflanzen parenchymatische Zellen zu finden. Diese bildeten jedoch nicht wie bei den mock inokulierten Pflanzen Reihen in radialer Richtung, sondern kamen nur vereinzelt und in geringerer Anzahl vor.

Abb. 28: Querschnitte des Hypokotyls uninfizierter (A und C) und infizierter (B und D) Pflanzen des Wildtyps Col-0 21 dpi. C: Cortex, Ph: Phloem, K: Kambiumzone, Xy: Xylem, P: parenchymatische Zellen, G: Gefäße. Die 1 µm dicken Schnitte wurden mit Toluidinblau angefärbt. Lignifizierte Zellwände sind daher türkisblau, Cytoplasma und Primärwände dagegen violett. Die Längenstandards entsprechen 100 µm (A, B) bzw. 50 µm (C, D).

Die durch V. longisporum bedingte vermehrte Produktion von Gefäßen war auch in den Blättern des Wildtyps Col-0 wieder zu finden (Abb. 29). Während bei den Kontroll-Pflanzen in der Regel nicht mehr als 5 Gefäße in adaxiale Richtung vom Kambium abgegeben wurden, war diese Zahl bei den infizierten Pflanzen deutlich erhöht. Wie beim Hypokotyl waren die ausdifferenzierten Zellen jedoch kleiner als die der Kontrollen. Die Blattquerschnitte der glp3-T-DNA-Insertionsmutante und des Ws-2 Wildtyps zeigten ebenfalls eine vermehrte Produktion von Gefäßen nach einer Verticillium-Infektion (Abb.

30).

Abb. 29: Leitgewebe von Blättern uninfizierter (A und C) und infizierter (B und D) Pflanzen des Wildtyps Col-0 21 dpi im Querschnitt. A und B: Mit Toluidinblau angefärbte, 1 µm dicke Schnitte. Lignifizierte Zellwände sind türkisblau, Cytoplasma und Primärwände violett. C und D: Autofluoreszenz von 5 µm dicken Schnitten. Xy:

Xylem, Ph: Phloem, K: Kambium. Die infizierten Pflanzen weisen im adaxialen Bereich des Xylems sehr große Zellen mit lignifizierten Wänden auf (Pfeile). Die Längenstandards entsprechen 50 µm.

Des Weiteren offenbarten die Querschnitte der Blätter beider Ökotypen sowie der glp3- Mutante im Bereich des Leitgewebes noch weitere Unterschiede zwischen infizierten und nicht infizierten Pflanzen, die im Hypokotyl nicht zu finden waren. So traten bei den infizierten Pflanzen im adaxialen Randbereich des Leitgewebes Zellen auf, die in ihrer Größe den das Leitgewebe umgebenden parenchymatischen Zellen entsprachen (Abb. 29, B und D sowie Abb. 30, B und D; Beispiele der beschriebenen Zellen sind mit Pfeilen markiert). Auch die Position ließe auf diesen Zelltyp schließen. Allerdings waren die Wände der betroffenen Zellen lignifiziert, was sowohl aufgrund der türkisblauen, durch Toluidinblau hervorgerufenen Farbe (Abb. 29 B sowie Abb. 30 B und D) als auch bei der

Abbildung der Autofluoreszenz (Abb. 29 D) sichtbar wurde. Bei einigen dieser Zellen war die lignifizierte Verstärkung wie bei Xylem-Gefäßen im Querschnitt als vollständiger Ring zu sehen, in anderen Zellen war sie in regelmäßigen Abständen unterbrochen (Abb. 29 und 30). Außerdem wurde in einigen dieser Zellen eine netzartige, sich durch den gesamten Zellquerschnitt ausbreitende lignifizierte Struktur beobachtet (Abb. 31).

Abb. 30: Leitgewebe von Blättern nicht infizierter (A und C) und infizierter (B und D) Pflanzen des Wildtyps Ws-2 (A und B) sowie der glp3-T-DNA-Insertionsmutante (C und D) 21 dpi im Querschnitt. Xy: Xylem, Ph: Phloem, K: Kambium. Die 1 µm dicken Schnitte wurden mit Toluidinblau angefärbt. Lignifizierte Zellwände sind daher türkisblau, Cytoplasma und Primärwände dagegen violett. Bei den Bildern der infizierten Pflanzen sind im Übergangsbereich vom Xylem zum umgebenden Mesophyll sehr große Zellen ohne Cytoplasma mit lignifizierten Wänden zu sehen (Pfeile). Außerdem sind Zellen zu sehen, die Cytoplasma enthalten und partiell lignifizierte Wände aufweisen (Pfeilspitzen). Die Längenstandards entsprechen 50 µm.

Abb. 31: Netzartige Zellwandverstärkungen in infizierten Pflanzen. Diese konnten im Blattquerschnitt sowohl in den Wildtypen Col-0 (A) und Ws-2 (B) als auch in der glp3-Mutante (C) 21 dpi in einzelnen Zellen im Randbereich des Xylems im Übergang zum adaxialen Parenchym anhand der Autofluoreszenz nachgewiesen werden. Der Längenstandard entspricht 20 µm.

Um dieses Phänomen besser beurteilen zu können, wurden Serienschnitte angefertigt und mikroskopisch untersucht. Diese zeigten eine Veränderung der beobachteten Struktur von einem Schnitt zum nächsten und eine Verschiebung vom Rand zur Mitte der Zelle hin (Abb. 32). Die Beobachtung weist auf eine runde Form der Zelle und somit auf einen parenchymatischen Ursprung hin.

Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass eine Infektion mit V. longisporum sowohl in den beiden untersuchten Ökotypen Col-0 und Ws-2 als auch in der GLP3 betreffenden T-DNA-Insertionslinie FLAG_412D02 zu einer vermehrter Produktion von Gefäßen durch das Kambium führte. In den Blättern waren am Rand des Xylems im Übergang zum adaxialen parenchymatischen Gewebe zusätzlich sehr große Zellen mit lignifizierten Zellwänden zu finden. Dies weist auf eine nachträgliche Differenzierung von parenchymatischen Zellen zu Gefäß-ähnlichen Elementen hin.

Abb. 32: Serienaufnahme derselben Blattprobe einer infizierten Pflanze des Wildtyps Col-0 21 dpi. Die lignifizierte, türkisfarbene Struktur innerhalb der markierten Zelle (Pfeil) ist zuerst nur am Rand zu sehen (A), im nächsten Schnitt reicht diese weiter in die Zelle hinein (B), im letzten Schnitt ist die Struktur in der Mitte der Zellen zu finden (C). Die Beobachtung weist auf eine runde Form der Zellen hin. Xy: Xylem, Ph: Phloem. Längenstandard = 50 µm.

3.7 Analyse von Promoterglp3-GUS-Reporterpflanzen zur