Charakterisierung von T-DNA-Insertionsmutanten von Arabidopsis thaliana

Verticillium longisporum

Für die funktionelle Charakterisierung der von V. longisporum beeinflussten Proteine wurden Pflanzen mit einer veränderten Expression des entsprechenden Gens untersucht.

Hierfür wurden T-DNA-Insertionslinien verwendet. Bei diesen Linien handelt es sich um Pflanzen, bei denen eine T-DNA in ein bestimmtes Gen oder in dessen Promoterbereich integriert ist, was zu einer Beeinträchtigung oder zum vollständigen Verlust der Genfunktion führen kann. Für die zu analysierenden Kandidatengene waren 1 bis 3 verschiedene Linen pro Gen verfügbar. Mit Hilfe der öffentlich zugänglichen Angaben zur Sequenz der verschiedenen Gene (The Arabidopsis Information Resource; www.tair.org) wurde überprüft, in welchem Bereich des jeweiligen Gens die T-DNA inseriert ist (Abb.

10). Nur für 2 Gene (At5g05340 und At5g08370) gab es Linien, bei denen die kodierenden Bereiche des Gens von der Insertion direkt betroffen sind. Bei allen anderen Linien lag die Insertion im UTR-Bereich oder außerhalb des Gens. Die Samen wurden bestellt und vermehrt. Für alle Linien konnten mittels PCR in der folgenden Generation homozygote Pflanzen identifiziert werden. Dies ist beispielhaft für die Linie SALK_147839, die das Gen At4g12910 (Serin-Carboxypeptidase) betrifft, dargestellt (Abb. 11).

Um zu überprüfen, ob die Expression des jeweiligen Gens durch die Insertion der T-DNA beeinträchtigt war, wurden unter Kurztag-Bedingungen angezogene, homozygote Pflanzen aller Linien mittels qRT-PCR überprüft. Da für die Generierung der SALK-Linien der Ökotyp Columbia, für die FLAG-Linien dagegen der Ökotyp Wassilewskija verwendet wurde, wurden beide Ökotypen in den Versuchen mitgeführt. Die Expression der durch die Insertion betroffenen Gene der SALK-Linien wurde relativ zu der des gleichen Gens im Columbia Wildtyp (Col-0) ermittelt. Die Expression der Gene der FLAG-Linien wurde mit der im Wassilewskija Wildtyp (Ws-2) verglichen.

Bei der Linie SALK_051769, bei der die T-DNA-Insertion den Promoterbereich des Gens für die Peroxidase 34 (pod34) betrifft, war die relative Transkriptmenge von pod34 signifikant gegenüber der im Wildtyp erhöht (Abb. 12). Bezüglich der Peroxidase 37 (pod37) wurden drei SALK-Linien getestet. Eine (SALK_024708) wies eine erhöhte Expression von pod37 auf, während sich die Transkriptmenge von pod37 der weiteren Linien (SALK_022520 und SALK_089515) nicht von der des Wildtyps unterschied.

Abb. 10: Schematische Darstellung der untersuchten Zielgene. Diese codieren für folgende Proteine: Peroxidase 34 (POD34), Peroxidase 37 (POD37), Peroxidase 52 (POD52), Serin-Carboxypeptidase (SCP), α-Galactosidase (GAL), Lektin-ähnliches Protein (LLP) und Germin-ähnliches Protein 3 (GLP3). Abgebildet sind Exons (weiß), Introns (schwarz) und die UTR-Bereiche (grau) sowie die cDNA umgebende Region der DNA (dünnere Linie). Die Position der inserierten T-DNA der verschiedenen T-DNA-Insertionslinien ist mit einem Dreieck gekennzeichnet. Pfeile zeigen die Bindestellen der Primer für die qRT-PCR-Analysen (FW und REV) sowie die der Primer an, die für die PCR zur Selektion homozygoter Pflanzen verwendet wurden (RP und LP).

Abb. 11: 3-Primer-PCR zur genotypischen Charakterisierung einer T-DNA-Insertionsmutante. Wildtyp-Proben (WT, links) zeigen eine Bande zwischen 1000 und 1500 bp, während mit der Primerkombination LB und RP keine DNA amplifiziert werden kann. Bei homozygoten Pflanzen (HM, Mitte) führt die PCR mit dem LB-Primer zu einer Bande um 500 bp, während bei der PCR mit dem LP-Primer die Bande fehlt. Können mit beiden LP-Primerpaaren Banden detektiert werden, handelt es sich um Proben von heterozygoten Pflanzen (HZ, rechts). Abgebildet ist als Beispiel ein Agarosegel mit den Produkten der zwei PCR-Reaktionen zur Selektion homozygoter Pflanzen der T-DNA-Insertionslinie SALK_147839.

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Abb. 12: Relative Expression der Zielgene in verschiedenen T-DNA-Insertionslinien.

Dargestellt ist die mittlere relative Expression des durch die Insertion betroffenen Gens in den T-DNA-Insertionslinien (schraffierte Säulen) im Vergleich zum jeweiligen Wildtyp (weiße Säulen) mit Standardabweichung (3 ≤ n ≤ 5). Signifikante Unterschiede zwischen der T-DNA-Linie und dem Wildtyp sind mit einem (p ≤ 0,05), zwei (p ≤ 0,01) oder drei Sternen (p ≤ 0,001) gekennzeichnet. Als Haushaltsgen diente Ubiquitin.

Für die Peroxidase 52 (pod52) wurde eine Linie (SALK_081257) mit einer signifikant reduzierten Transkriptmenge identifiziert. Die Expression des Gens, das für die Serin-Carboxypeptidase (scp) codiert, war in zwei Linien (SALK_095638 und SALK_147839) signifikant gegenüber der im Wildtyp verringert. Für die α-Galactosidase (gal) wurde eine Linie (SALK_134497) mit einer signifikant verringerten Expression von gal gefunden.

Bezüglich des Lektin-ähnlichen Proteins (llp) waren zwei Linien verfügbar. Die relative Transkriptmenge für llp war in der Linie FLAG_561D11 im Vergleich zum Wildtyp unverändert, während die T-DNA-Insertion bei der Linie FLAG_552G09 eine Reduktion der Transkriptmenge verursachte. Für das Germin-ähnliche Protein (glp3) zeigte die Linie FLAG_412D02 eine signifikant verringerte Expression, während die der zwei weiteren getesteten Linien (SALK_055557 und FLAG_146D08) im Vergleich zum Wildtyp unverändert war.

Bei den T-DNA-Insertionslinien, bei denen Peroxidasen betroffen sind, wurde ergänzend zu den Messungen der Transkriptmenge die Aktivität der Guajakolperoxidase getestet, um zu untersuchen, ob die Funktion der entsprechenden Enzyme durch die Insertion der T-DNA beeinträchtigt war.

Die Ergebnisse zeigten, dass die Linien SALK_051769 (pod34) und SALK_024708 (pod37) eine signifikant erhöhte Guajakolperoxidase-Aktivität aufwiesen, während es bei den weiteren pod37 betreffenden Linien SALK_022520 und SALK_089515 keine Unterschiede zum Wildtyp gab (Abb. 13). Die erhöhte Guajakolperoxidase-Aktivität der beiden Erstgenannten stand in Übereinstimmung mit den Daten der qRT-PCR-Analysen, bei denen eine signifikante Erhöhung der Expression im Vergleich zum Wildtyp nachgewiesen wurde. Vermutlich führte die erhöhte Transkriptmenge zu der erhöhten Enzymaktivität. Die unveränderte Guajakolperoxidase-Aktivität der Linie SALK_022520 (pod37) im Vergleich zum Wildtyp war auf die unveränderte Expression des Gens zurückzuführen.

Die Linie SALK_081257 zeigte trotz signifikant verringerter Expression von pod52 keine Verminderung in der Guajakolperoxidase-Aktivität. Da eine spezifische Funktion von POD52 bislang nicht beschrieben wurde und somit auch das Substratspektrum nicht bekannt ist, ist ein möglicher Grund für die Diskrepanz der Ergebnisse der qRT-PCR und der Messungen der Guajakolperoxidase-Aktivität, dass POD52 Guajakol nicht so effizient oder gar nicht umsetzen kann.

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Abb. 13: Aktivität der Guajakolperoxidase in den T-DNA-Insertionslinien, in denen eine der drei Peroxidasen (pod34, pod37 oder pod52) betroffen ist, sowie im Wildtyp Col-0. Dargestellt ist mittlere Enzymaktivität mit Standardabweichungen (3 ≤ n ≤ 5) in nanokatal bezogen auf 1 mg der Proteine im Extrakt. Bei signifikanten Unterschieden zum Wildtyp sind die Ergebnisse mit einem (p ≤ 0,05) oder zwei Sternen (p ≤ 0,01) gekennzeichnet.

Um zu testen, ob die durch die 2-D-Gelelektrophorese entdeckten Proteine eine Funktion in der Pathogenabwehr von A. thaliana aufweisen, wurden die homozygoten T-DNA-Insertionslinien, bei denen eine im Vergleich zum Wildtyp veränderte Transkriptmenge detektiert werden konnte, hinsichtlich ihrer Suszeptibilität gegenüber V. longisporum untersucht. Dazu wurden die Pflanzen in mehreren Experimenten mit dem Pathogen infiziert und unter Kurztag-Bedingungen kultiviert.

Erste Veränderungen der Pflanzen durch die Infektion mit V. longisporum waren in der Regel ca. 10 Tage nach Infektion zu sehen. Die Pflanzen wiesen zu diesem Zeitpunkt vergilbte Blattadern und ein verringertes Wachstum auf. Im weiteren Verlauf der Infektion traten Chlorosen auf. Zudem waren an einzelnen Pflanzen morphologische Veränderungen wie das Einrollen einzelner Blättern und ein asymmetrisches Wachstum der Blattrosette erkennbar (Abb. 1, Einleitung). Des Weiteren wurde durch Messungen der Chlorophyll-fluoreszenz eine Reduktion der Quantenausbeute festgestellt (siehe Anhang A).

Um den Pathophänotypen der Mutanten mit dem des Wildtyps vergleichen zu können und eine potentielle Veränderung der Suszeptibilität beurteilen zu können, wurde zur Quantifizierung der Stauchung die Blattfläche der einzelnen Pflanzen anhand von digitalen Bildern gemessen. Außerdem wurden die Blattrosetten 21 oder 28 Tage nach Infektion geerntet und die Biomasse ermittelt. Da es bei diesen Parametern Unterschiede zwischen den Kontrollpflanzen der verschiedenen T-DNA-Insertionslinien und den Wildtypen gab, wurde für alle Messungen die relative Veränderung zwischen infizierten und nicht infizierten Pflanzen berechnet. Zudem traten Schwankungen zwischen den verschiedenen Experimenten auf. Daher wurden die Daten aus den verschiedenen Experimenten anhand der immer mitgeführten Wildtyp-Kontrollen normalisiert.

Bei den meisten T-DNA-Insertionslinien waren keine Unterschiede zum Wildtyp hinsichtlich der Suszeptibilität gegenüber V. longisporum feststellbar. Die Blattfläche der SALK-Linien im Col-0 Hintergrund wies nach Infektion eine Reduktion zwischen 29 und 41 % auf (Abb. 14).

Abb. 14: Reduktion der Blattfläche der T-DNA-Insertionslinien (hellgraue Säulen) und der Wildtypen Col-0 und Ws-2 (dunkelgraue Säulen) 21 dpi. Dargestellt ist die Reduktion der Blattfläche infizierter Pflanzen relativ zu den mock inokulierten Pflanzen in Prozent. Gezeigt werden die Mittelwerte mit Standardfehler aus unabhängigen Versuchen mit jeweils 20 Pflanzen je Behandlung und Linie (n = 1 für pod37; n = 2 für pod52, scp und gal; n = 3 für pod34, llp und glp3). Signifikante Unterschiede (p ≤ 0,05) sind durch einen Stern gekennzeichnet.

Die Reduktion der Blattfläche des Wassilewskija Wildtyps war generell stärker ausgeprägt als die des Ökotyps Col-0. Bei der mit dem Ökotypen Wassilewskija zu vergleichenden FLAG-Linie bezüglich llp gab es keinen Unterschied zum Wildtyp. Bei der glp3 betreffenden FLAG-Linie war die Reduktion der Blattfläche durch V. longisporum dagegen signifikant größer als die des Wildtyps.

Die Ermittlung der frischen Biomasse ergab ähnliche Ergebnisse wie die Blattflächenmessungen. Während es bei allen SALK-Linien und bei der llp-Mutante keine signifikanten Unterschiede zum entsprechenden Wildtyp gab, war die infektionsbedingte Reduktion der Biomasse bei der glp3-Mutante deutlich stärker als die des Ws-2 Wildtyps (Abb. 15).

Abb. 15: Reduktion der Biomasse der T-DNA-Insertionslinien (hellgraue Säulen) und der Wildtypen Col-0 und Ws-2 (dunkelgraue Säulen) zwischen 21 und 28 dpi.

Dargestellt ist die Reduktion der oberirdischen Frischmasse infizierter Pflanzen relativ zu den Kontrollen in Prozent. Abgebildet sind die Mittelwerte mit Standardfehler aus unabhängigen Versuchen mit jeweils 20 Pflanzen je Behandlung und Linie (n = 1 für pod37, scp, Linie SALK_147839; n = 2 für pod34, pod52, scp, Linie SALK_095638 und gal; n = 3 für llp und glp3). Signifikante Unterschiede (p ≤ 0,01) sind mit zwei Sternen markiert.

Bei einem Rückblick auf die bisherigen Ergebnisse bezüglich der verschiedenen getesteten T-DNA-Insertionslinien ist also festzustellen, dass die meisten Linien, die eine veränderte Expression des durch die Insertion betroffenen Gens aufwiesen, keinen Unterschied zum Wildtyp hinsichtlich der Suszeptibilität gegenüber V. longisporum zeigten. Nur die

T-DNA-Insertionslinie FLAG_412D02, bei der das T-DNA-Fragment im Promoterbereich des glp3-Gens inseriert ist und für die eine verringerte Expression von glp3 im Vergleich zum Wildtyp nachgewiesen werden konnte, zeigte eine größere infektionsbedingte Reduktion der Blattfläche und der Biomasse. Die glp3-Insertionslinie ist somit suszeptibler gegenüber V. longisporum im Vergleich zum Wildtyp.

3.3 Charakterisierung von Arabidopsis-Pflanzen mit konstitutiv