Charakterisierung von Arabidopsis-Pflanzen mit konstitutiv erhöhter

gegenüber Verticillium longisporum

Da beobachtet wurde, dass eine Verringerung des Transkriptlevels von glp3 in A. thaliana zu einer erhöhten Suszeptibilität der Pflanzen gegenüber V. longisporum führte, sollte geprüft werden, ob eine Erhöhung der Menge von GLP3 eine erhöhte Toleranz der Pflanzen gegenüber dem Pathogen hervorrufen kann. Um diese Hypothese zu testen, wurden Arabidopsis-Pflanzen hergestellt, die glp3 konstitutiv und ektopisch in deutlich größeren Mengen exprimierten als der Wildtyp. Zur Transformation wurde der Ökotyp Wassilewskija verwendet, da die glp3-Mutante von diesem Wildtyp abstammt und die Überexpressionspflanzen mit dieser verglichen werden sollten. Die Pflanzen wurden mit einem Vektor transformiert, in den die codierende Sequenz für glp3 unter der Kontrolle eines konstitutiv aktiven 35s-Promoters eingefügt worden war. Die Pflanzen der T1-Generation wurden hinsichtlich ihres glp3-Transkriptlevels überprüft. Vier von zehn getesteten heterozygoten Pflanzen zeigten eine deutlich erhöhte Menge der glp3-mRNA im Vergleich zum Wildtyp Ws-2. Diese Linien wurden weiter selektiert, bis von zwei der Linien (Linie 7 und Linie 9) homozygote Pflanzen vorhanden waren. In diesen Pflanzen der T3-Generation wurde erneut die Menge der glp3-mRNA gemessen. Bei diesen homozygoten Pflanzen war die Expression im Durchschnitt rund 800 mal höher als im Wildtyp Ws-2 (Abb. 16).

Um zu testen, ob die Überexpression von glp3 zu einer veränderten Suszeptibilität gegenüber V. longisporum führt, wurden die homozygoten Linien mit dem Pilz infiziert, unter Kurztag-Bedingungen kultiviert und die Entwicklung des Pathophänotypen verfolgt.

Als Vergleich wurden sowohl der Wassilewskija-Wildtyp als auch die suszeptiblere glp3-Insertionslinie (FLAG_412D02) im selben Experiment mitgeführt.

0,0

Abb. 16: qRT-PCR-Analysen der Überexpressionspflanzen zur Quantifizierung der glp3-mRNA. Dargestellt ist die relative Expression von homozygoten Pflanzen der Linien 7 und 9 (p35s::glp3) im Vergleich zum Wildtyp. Zusätzlich ist die Expression der glp3-Mutante (FLAG_412D02) abgebildet. Präsentiert werden Mittelwerte mit Standardfehler aus 3 unabhängigen Versuchen mit je 5 Replikaten. Signifikante Unterschiede im Vergleich zum Wildtyp Ws-2 sind mit zwei (p ≤ 0,01) oder drei Sternen (p ≤ 0,001) markiert.

21 dpi wiesen alle infizierten Versuchspflanzen die typischen Symptome auf (Abb. 17).

Für die bereits unter Punkt 3.2 beschriebene glp3-Insertionslinie konnte der stärker ausgeprägte Pathophänotyp bestätigt werden. Bei den Überexpressionspflanzen waren dagegen die charakteristischen Symptome insgesamt deutlich schwächer ausgebildet als beim Wildtyp oder den glp3 Pflanzen.

Die Quantifizierung der Blattfläche zeigte eine stärkere Reduktion der Blattfläche der glp3-Mutante im Vergleich zum Wildtyp nach Infektion mit V. longisporum (Abb. 18).

Während die Wildtyp-Pflanzen durch die Infektion eine im Mittel um 40 % verringerte Blattfläche zeigten, waren die Blattflächen der glp3-Mutante infektionsbedingt 58 % kleiner als die der Kontrollen. Die durch das Pathogen hervorgerufene Reduktion der Blattflächen der Überexpressionspflanzen war dagegen signifikant geringer als die des Wildtyps und betrug 29 % bei der Linie 7 und 28 % bei der Linie 9.

Kontrolle +VL43

Abb. 17: Fotos von mit V. longisporum infizierten (+VL43) und nicht infizierten Pflanzen (Kontrolle) des Wassilewskija-Wildtyps (WT Ws-2), der glp3-Insertionslinie FLAG_412D02 sowie der Überexpressionslinien 7 und 9 (p35s::glp3) 21 dpi.

Neben der Ermittlung der Blattflächen wurde auch die Frischmasse bestimmt. Die Ergebnisse zeigten ein ähnliches Bild wie die der Blattflächen-Analysen. Bei den Wildtyp-Pflanzen resultierte die Infektion durch V. longisporum in einer Verringerung der Masse um 32 % (Abb. 19). Bei der glp3-Insertionslinie war die Reduktion um 24 % stärker. Die relative Verringerung der Frischmasse der Überexpressionslinien war tendenziell geringer als die des Wildtyps und betrug im Mittel 25 % bei der Linie 7 und 18 % bei der Linie 9.

FLAG 412D02

glp3

WT WS-2

p35s::glp3 Linie 7

p35s::glp3 Linie 9

-80

Abb. 18: Reduktion der Blattfläche des Wildtyps Ws-2, der glp3 Insertionslinie FLAG_412D02 sowie der beiden Überexpressionslinien 7 und 9 (p35s::glp3, Linie 7 und p35s::glp3, Linie 9) 21 dpi. Dargestellt ist die Reduktion der Blattfläche infizierter Pflanzen relativ zu den Kontrollen in Prozent. Gezeigt werden die Mittelwerte mit Standardabweichungen aus vier unabhängigen Versuchen, bei denen die Anzahl der biologischen Replikate jeweils 20 betrug. Signifikante Unterschiede (p

≤ 0,05) sind durch unterschiedliche Buchstaben gekennzeichnet.

-80

Abb. 19: Reduktion der Frischmasse des Wildtyps Ws-2, der glp3-Insertionslinie FLAG_412D02 sowie der beiden Überexpressionslinien 7 und 9 (p35s::glp3, Linie 7 und p35s::glp3, Linie 9) 21 dpi. Abgebildet ist die Reduktion der Frischmasse infizierter Pflanzen im Verhältnis zu den uninfizierten Pflanzen in Prozent. Gezeigt werden die Mittelwerte mit Standardabweichungen aus drei unabhängigen Versuchen mit je 20 biologischen Replikaten. Signifikante Unterschiede (p ≤ 0,05) sind durch unterschiedliche Buchstaben gekennzeichnet.

Als weiterer Parameter zur Quantifizierung der Symptome diente der Pigmentgehalt. Dazu wurden Chlorophyll a und b sowie Carotinoide in infizierten und Kontroll-Pflanzen photometrisch gemessen. Die mittlere Konzentration der gesamten Pigmente der Kontrollen betrug 21 dpi 1015 µg pro g Blattmasse (Tabelle 14). 28 dpi war der Pigmentgehalt etwas geringer und lag im Mittel bei 925 µg pro g. Zu beiden Zeitpunkten war eine Reduktion durch die Infektion mit V. longisporum zu verzeichnen (Abb. 20).

Tabelle 14: Pigmentgehalt des Wildtyps Ws-2, der glp3-Insertionslinie FLAG_412D02 sowie zweier Überexpressionslinien (p35s::glp3, Linie 7 und p35s::glp3, Linie 9).

Aufgeführt sind die Mittelwerte ± Standardabweichungen der Konzentration von Chlorophyll a, Chlorophyll b und den Carotinoiden sowie das Verhältnis von Chlorophyll a zu Chlorophyll b von infizierten (VL) und nicht infizierten (K) Pflanzen der verschiedenen Linien 21 dpi (A) und 28 dpi (B) in µg des Pigments pro g Frischmasse. Die Daten der verschiedenen Zeitpunkte stammen aus unabhängigen Experimenten mit jeweils 20 Pflanzen, die für die Analyse zu 5 Pools mit je 4 Pflanzen zusammengefasst wurden. Signifikante Unterschiede in einer Spalte (p ≤ 0,05) sind durch unterschiedliche Buchstaben in Klammern gekennzeichnet.

A

Abb. 20: Reduktion des Chlorophyllgehalts des Wildtyps Ws-2, der glp3- Insertionslinie FLAG_412D02 sowie der beiden Überexpressionslinien 7 und 9 (p35s::glp3, Linie 7 und p35s::glp3, Linie 9) 21 dpi (A) und 28 dpi (B). Dargestellt ist die mittlere Reduktion der Summe von Chlorophyll a und Chlorophyl b infizierter Pflanzen relativ zu den Kontrollen in Prozent mit Standardabweichung. Die Daten der verschiedenen Zeitpunkte stammen aus unabhängigen Experimenten mit jeweils 20 Pflanzen, die für die Analyse zu 5 Pools mit je 4 Pflanzen zusammengefasst wurden. Signifikante Unterschiede (p ≤ 0,05) sind durch unterschiedliche Buchstaben gekennzeichnet.

21 dpi war der Pigmentgehalt des Wildtyps infektionsbedingt 13 % geringer. 28 dpi war diese Reduktion noch weiter erhöht, so dass die infizierten Pflanzen 22 % weniger Chlorophyll besaßen als die Kontrollen. Die glp3-Mutante zeigte zu beiden Zeitpunkten eine stärkere Reduktion der Pigmentkonzentration als der Wildtyp, die aber nur 21 dpi signifikant war. Der Pigmentgehalt der infizierten Überexpressionspflanzen dagegen war 21 dpi im Vergleich zu den Kontrollen um rund 1,5 % (Linie 7) bzw. 8 % (Linie 9) reduziert. 28 dpi waren die Unterschiede zum Wildtyp nicht mehr so stark ausgeprägt wie 21 dpi, so dass dieser zu diesem Zeitpunkt nur bei der Linie 9 signifikant war.

Um zu untersuchen, ob die GLP3-Menge in A. thaliana neben der Symptomausprägung auch die Proliferation des Pilzes in der Pflanze beeinflusst, wurde die DNA des Pilzes in den Blattrosetten mittels qRT-PCR gemessen. In Wildtyp-Pflanzen ließen sich im Mittel Mengen von ca. 10500 pg Verticillium-DNA je g Frischmasse nachweisen (Abb. 21). In der glp3-Insertionslinie konnten doppelt so hohe Konzentrationen detektiert werden, während in den Pflanzen, die glp3 konstitutiv überexprimieren, die VL-DNA-Konzentrationen mehr als 60 % geringer waren und signifikant vom Wildtyp zu unterscheiden waren.

Reduktion von Chlorophyll a und b [%]

c

Reduktion von Chlorophyll a und b [%]

p35s::glp3

0

Abb. 21: VL-DNA in infizierten Pflanzen des Wildtyps Ws-2 (WT), der glp3-Insertionslinie FLAG_412D02 sowie der beiden Überexpressionslinien 7 und 9 (p35s::glp3, Linie 7 und p35s::glp3, Linie 9) 21 bis 28 dpi. Dargestellt sind die Mittelwerte mit Standardabweichungen aus 3 unabhängigen Versuchen mit je 20 Pflanzen pro Linie und Behandlung. Für die Messung wurden jeweils 5 Pools aus je 4 Pflanzen gebildet. Signifikante Unterschiede (p ≤ 0,05) sind durch unterschiedliche Buchstaben gekennzeichnet. Die Daten wurden für die statistischen Analysen Log-transformiert. Die DNA-Messung wurde von der AG Karlovsky durchgeführt.

Zusammenfassend lässt sich also feststellen, dass die infektionsbedingte Wachstumsdepression und die Reduktion des Pigmentgehalts in den Überexpressionspflanzen im Vergleich zum Wildtyp verringert war, während die erhöhte Suszeptibilität der glp3-Mutante bestätigt werden konnte. Zusätzlich zu der veränderten Symptomatik war die Pilzmenge innerhalb der Pflanze bei der glp3-Mutante signifikant erhöht, während sie bei den Überexpressionspflanzen signifikant niedriger war als die des Wildtyps. Die Pilzproliferation scheint also mit der Menge GLP3 in der Pflanze in Zusammenhang zu stehen. Die Überexpressionspflanzen können somit bei einem Vergleich mit dem Wildtyp Ws-2 als toleranter gegenüber V. longisporum bezeichnet werden.