Analyse von Promoter glp3 -GUS-Reporterpflanzen zur Lokalisierung der

Um weitere Hinweise auf die Funktion von GLP3 in A. thaliana zu bekommen, sollte untersucht werden, in welchen Pflanzenorganen und -geweben und zu welchem Zeitpunkt während des Lebenszyklus glp3 exprimiert wird. Zudem sollte getestet werden, ob sich nach Infektion mit V. longisporum das Transkriptlevel in bestimmten Geweben ändert oder glp3 in anderen Pflanzenteilen exprimiert wird als in den Kontrollen. Dazu wurden GUS-Reporter-Pflanzen hergestellt, indem Pflanzen des Ökotyps Col-0 mit einem Konstrukt transformiert wurden, in welchem der Promoter von glp3 vor das uidA-Gen aus E. coli kloniert wurde. Wenn der glp3-Promoter in der Pflanze aktiviert wird, wird die ß-Glucuronidase produziert, deren Aktivität anhand einer Farbreaktion im Pflanzengewebe nachgewiesen werden kann. Um auszuschließen, dass die Expression des uidA-Gens durch 35s-Promotoren, die vor anderen Genen innerhalb des Vektors liegen, induziert wird, wurden zusätzlich Pflanzen mit dem unveränderten Vektor (ohne glp3-Promoter) transformiert, die als Kontrolle in den Experimenten mitgeführt wurden.

Aus der Transformation gingen fünf Pflanzen hervor, die in der T1-Generation hinsichtlich der Funktionalität des Konstruktes überprüft wurden, indem einzelne Pflanzenteile in GUS-Färbelösung inkubiert wurden. Bei zwei der fünf Pflanzen war die Farbreaktion erfolgreich. Diese Pflanzen wurden weiter vermehrt und selektiert, bis Homozygote vorhanden waren, die für Experimente verwendet wurden. Mit den mit dem leeren Vektor transformierten Pflanzen wurde ebenso verfahren. Bei diesen konnte sowohl in den Pflanzen der T1-Generation als auch in den homozygoten Pflanzen keine Blaufärbung detektiert werden. Daher war die in den GUS-Reporterlinien auftretende ß-Glucuronidase-Aktivität ausschließlich auf die Induktion des glp3-Promoters und nicht auf durch den verwendeten Vektor bedingte Faktoren zurückzuführen (Abb. 33).

Die Reporterlinien 2 und 3 sowie eine Leervektor-Kontroll-Linie wurden unter Kurztag-Bedingungen angezogen, mit V. longisporum infiziert und regelmäßig auf die GUS-Expression hin untersucht. Um zu prüfen, ob die GUS-Linien genauso auf V. longisporum reagieren wie der Wildtyp, wurden als Kontrolle zusätzlich infizierte und nicht infizierte Wildtyp-Pflanzen des Ökotyps Col-0 im Experiment mitgeführt. Bei einem Vergleich der uninfizierten Pflanzen war ein Unterschied zwischen der GUS-Reporterlinie 3 und den anderen Linien erkennbar (Abb. 34).

Abb. 33: Leervektor-Kontrollpflanzen zeigen keine unspezifischen Färbungen. Fotos von mit dem leeren Vektor transformierten Kontrollen nach Inkubation mit der GUS-Färbelösung. Sowohl in vegetativen Pflanzenteilen (A) als auch in Blüten (B) konnte keine ß-Glucuronidase-Aktivität nachgewiesen werden. Auch bei Blattquerschnitten (C) konnte keine Blaufärbung detektiert werden. Der Längenstandard entspricht 0,5 cm für die makroskopischen Bilder und 50 µm für die mikroskopische Aufnahme.

Abb. 34: Beispielbilder der für die GUS-Färbung verwendeten Pflanzen. Mock inokulierte (A, C, E, und G) und infizierte (B, D, F und H) Pflanzen des Wildtyps Col-0 (A und B), der Leervektor-Kontrolle (C und D) und der GUS-Reporterlinien 2 (E und F) und 3 (G und H) 21 dpi. Der Längenstandard entspricht 3 cm.

Während die Blattflächen der GUS-Reporterlinie 2 sowie die mit dem leeren Vektor transformierten Pflanzen ungefähr die gleiche Größe erreichten wie die des Wildtyp, waren die der GUS-Reporterlinie 3 um mehr als die Hälfte kleiner (Abb. 34 und 35 A). Die typische Reduktion der Blattfläche nach der Infektion mit V. longisporum trat jedoch bei allen Linien in ähnlicher Form auf (Abb. 35 B).

Abb. 35: Blattfläche der Pflanzen der GUS-Reporterlinien (Pglp3::GUS, Linie 2 bzw.

Pglp3::GUS, Linie 3) und der Leervektor-Kontrolle im Vergleich zu der des Wildtyps Col-0 21 dpi. Dargestellt werden die Blattflächen mock inokulierter (weiße Säulen) und infizierter (schwarze Säulen) (A) sowie die Reduktion der Blattfläche infizierter Pflanzen relativ zu den Kontrollen in Prozent (B). Abgebildet sind Mittelwerte mit Standardabweichungen (n = 5). Signifikante Unterschiede (p ≤ 0,05) sind durch verschiedene Buchstaben gekennzeichnet.

Die ß-Glucuronidase-Aktivität konnte in Blättern der GUS-Reporterpflanzen sowie in Petiolen anhand der Blaufärbung des Gewebes nachgewiesen werden, wobei es einen Gradient von den neu gebildeten, intensiv gefärbten hin zu den älteren Blättern gab, bei denen die Färbung nur noch lokal beschränkt und von geringer Intensität war (Abb. 36 und Abb. 37). Die ältesten Blätter waren nicht gefärbt. Ebenso nahm die Färbung mit dem Alter der Pflanzen ab (vgl. Abb. 36 und Abb. 37). Auffällig war auch, dass die Mittelrippe in der Regel ungefärbt war. Innerhalb der Blätter war sowohl in den Mesophyllzellen als auch in der Epidermis die ß-Glucuronidase-Aktivität detektierbar (Abb. 38).

Bei einem Vergleich der infizierten Pflanzen mit den Kontrollen gab es keine Unterschiede hinsichtlich der Lokalisierung der GUS-Aktivität. Allerdings waren teilweise Abweichungen bezüglich der Intensität der Färbung zu sehen. Die Blaufärbung in den

Reduktion der Blattfläche [%]

a a

Abb. 36: GUS-Expression in vegetativen Pflanzenteilen. Nachweis der ß-Glucuronidase-Aktivität in vegetativen Pflanzenteilen zur Analyse der Expression von glp3 in GUS-Reporterpflanzen in mock inokulierten Kontrollen der Linie 2 (A, C und E) und nach Infektion mit V. longisporum (B, D und F). Abgebildet sind digitale Aufnahmen repräsentativer junger Pflanzen 1 dpi (A und B) und detaillierte Aufnahmen von Blättern verschiedener Entwicklungsstadien 3 dpi (C und D; links:

jeweils eines der ältesten Blätter, rechts: jüngstes Blatt) und 7 dpi (E und F) nach 3stündiger Inkubation in der Färbelösung. Der Längenstandard entspricht 0,5 cm.

Die Linie 3 zeigte ein ähnliches Färbemuster. Entprechende Bilder der Linie 3 sind in Anhang B zu finden.

Blättern infizierter Pflanzen war 7 dpi weniger stark ausgeprägt als in denen der Kontrollen (Abb. 36). Die Expression von glp3 war also in den Blättern zu diesem Zeitpunkt nach der Infektion mit V. longisporum geringer als in den Kontrollen.

Abb. 37: Nachweis der ß-Glucuronidase-Aktivität 21 dpi. Abgebildet sind Blätter repräsentativer Pflanzen der Linie 2 in mock inokulierten Kontrollen (links) und in infizierten Pflanzen (rechts) nach 3stündiger Inkubation in der Färbelösung. Der Längenstandard entspricht 2 cm. Bilder der Linie 3 sind im Anhang zu finden.

Abb. 38: Nachweis der ß-Glucuronidase-Aktivität innerhalb der Blätter 21 dpi.

Abgebildet sind 10 µm dicke Querschnitte von mock inokulierten (A) und infizierten Pflanzen der Linie 2 (B) nach 3stündiger Inkubation in der Färbelösung. Der Längenstandard entspricht 50 µm.

In den Wurzeln konnte weder in infizierten noch in uninfizierten Pflanzen eine ß-Glucuronidase-Aktivität festgestellt werden (Abb. 36).

Bei blühenden Pflanzen war der Blütenstiel (Pedicellus) intensiv blau gefärbt. Außerdem konnte in den meisten Teilen der Blüte eine GUS-Expression detektiert werden (Abb. 39).

Abb. 39: GUS-Expression in Blüten. Nachweis der ß-Glucuronidase-Aktivität in GUS-Reporterpflanzen in uninfizierten (A – C und G) und infizierten Pflanzen (D – F und H). Zu sehen sind Bilder der Blütenstände repräsentativer Pflanzen der Linie 2 (A und D) sowie detaillierte Aufnahmen junger (B und E) und älterer (C und F) Blüten und Schoten (G und H) 56 dpi nach 18stündiger Inkubation in der Färbelösung. Der Längenstandard entspricht 0,2 cm.

So zeigten die Kelchblätter, Teile des Fruchtblattes sowie der Staubfaden eine Blaufärbung. In einigen Blüten war zusätzlich der mittlere Teil des Staubbeutels, das Konnektiv, welches die beiden Pollensackgruppen miteinander verbindet, gefärbt. Auch in den Schoten konnte die ß-Glucuronidase-Aktivität detektiert werden. Die Intensität und die Ausbreitung der Färbung war in den Blütenteilen jedoch abhängig von deren Entwicklungsstadium. Während die Blaufärbung in Knospen und jungen Blüten sehr intensiv war und meist überall auftrat, war sie in den Blüten, in denen sich bereits die Samenschote entwickelte, meist schwächer und lokal begrenzt (vgl. Abb. 39 B und E mit C und F). Zwischen infizierten und nicht infizierten Pflanzen gab es keine Unterschiede hinsichtlich der Intensität der Färbung der Blütenteile.

Anhand der GUS-Reporterpflanzen ließ sich zeigen, dass glp3 in Blättern und in allen Blütenteilen, nicht aber in der Wurzel exprimiert wird. Zudem wurde festgestellt, dass diejenigen Gewebe, die sich noch in der Entwicklung befinden und sich noch strecken, stärker gefärbt waren als bereits ausgewachsene Pflanzenteile. Zwischen infizierten und mock inokulierten Pflanzen gab es zu den meisten Zeitpunkten keine Unterschiede hinsichtlich der GUS-Aktivität. Lediglich 7 dpi war die Blaufärbung in Blättern infizierter Pflanzen weniger ausgeprägt als in den Kontrollen. Die Ergebnisse lassen insgesamt darauf schließen, dass die glp3-Expression mit dem Streckungswachstum korreliert.

3.8 Untersuchung des Einflusses von heterolog produziertem GLP3