3 METHODEN
3.13 Generierung einer konditionellen Gp96-knock-out-Maus
Im Rahmen dieser Arbeit sollte der Targetingvektor für eine konditionelle Gp96-knock-out-Maus kloniert werden. Die Strategie für das Targeting und die Klonierung des Vektors wurden in Zusammenarbeit mit Prof. Dr. Thomas Hehlgans aus der Ab-teilung für Pathologie der Universität Regensburg entwickelt.
Das Gp96-Gen der Maus besteht aus 18 Exons und erstreckt sich über einen Bereich von etwa 15 kb (Abb.3.6). Um einen erfolgreichen knock-out zu erzielen, sollte ein möglichst großer Bereich des Gens aus dem Genom der Maus entfernt werden. Dabei durfte das Gen durch die Klonierung und die anschließende homolo-ge Rekombination aber nicht zerstört werden, da bekannt war, dass eine konventio-nelle knock-out-Maus am 5. Tag der Embryonalentwicklung stirbt 243. Erst durch die weitere Kreuzung der genetisch veränderten Maus mit einer die cre-Rekombinase in bestimmten Geweben exprimierenden Maus, sollte das Gp96-Gen im Gewebe aus-geschaltet werden. Das Targeting diente also dazu, zwei cre-Rekombinase-Stellen an geeigneten und genau definierten Stellen in das Maus-Genom einzubringen. Zur Selektion der embryonale Stammzellen (ES)-Zellen auf erfolgreiche homologe Re-kombination wurde eine Neomycin-Resistenz-Kassette in ein Intron des Gens einge-fügt, wobei diese Resistenz nach der Selektion wieder entfernt werden musste, um die Gp96-Expression in der Maus nicht zu beeinflussen. Daher sollte das Neomycin-Gen von frt-Stellen flankiert sein, die einer Flippase als Angriffstellen für eine Entfer-nung des Gens aus dem Genom dienen würden (Abb.3.6).
1
18 Konstrukt
Neo
7 1
cre-Rekombinase frt
lox p
homologe Rekombination
Exons
6 + 7 Exons 8 -17
18 ATG
lox p frt Gp96-Gen
stop
ATG 17
Abb.3.6: Targetingstrategie für eine konditionelle Gp96-knock-out-Maus
Um den Targeting-Vektor zu klonieren, mussten zunächst drei Teile des Maus-Gp96-Gens per PCR amplifiziert werden. Die Teile werden im Folgenden als Fragment I, II und III bezeichnet. Fragment I beginnt nach Exon 18 und erstreckt sich bis zwischen Exons 14 und 13 (2975 bp), direkt daran schließt sich Fragment II an, welches sich bis nach Exon 8 erstreckt (3346 bp) und Fragment III beginnt zwischen Exon 8 und 7 und überspannt die Exons 7 und 6 (1722 bp) (Abb.3.7). Die Fragmente I und II soll-ten später zu einem großen Stück zusammenkloniert werden, welches sich wegen seiner Gesamtgröße von über 6 kb per PCR schwer direkt amplifizieren lassen wür-de. Zwischen dieses große Teilstück und dem Fragment III wird die frt-flankierte Ne-omycin-Resistenz einkloniert (Abb.3.6). An die Fragmente wurden durch die Primer geeignete Restriktionsschnittstellen angefügt (Abb.3.7)
18 1
Sfi I Spe I
Nru I Kpn I
Kpn I Xba I
Fragment II
Fragment I
Fragment III
Abb.3.7: Darstellung der Position der drei PCR-Fragmente für die konditionelle Gp96-knock-out-Maus
Die Primersequenzen für die im Folgenden dargestellten PCR-Reaktionen sind unter 2.4.3 zusammengefasst. Folgende PCR-Bedingungen wurden zur Amplifi-kation der einzelnen Fragmente verwendet:
Fragment I: 2 µl ES-Zell-DNA (200 ng)
0,5 µl Herkulase (Stratagene, La Jolla, CA, USA)
2 µl DMSO (Endkonzentration 4%)
2,5 µl Primer MH up (5 µM) 2,5 µl Primer MH do (5 µM)
1 µl dNTPs (10 mM)
5 µl 10x Puffer
34,5 µl H2O
10 min 94 °C
1 min 94 °C
1 min 50 °C
4 min 72 °C
40x
10 min 72 °C
Ein Teil des PCR-Ansatzes wurde zur Kontrolle auf ein 1%iges Agarose-Gel aufge-tragen. Von dem Rest wurde eine 1:1000-Verdünnung hergestellt und es wurde eine
nested-PCR mit den endgültigen, die Restriktionsschnittstellen enthaltenden Primern, durchgeführt.
2 µl PCR 1:1000 verdünnt
0,5 µl Herkulase (Stratagene, La Jolla, CA, USA)
2 µl DMSO (Endkonzentration 4%)
2,5 µl Primer k.o. Xba fI (5 µM) 2,5 µl Primer k.o. kpn rI (5 µM)
1 µl dNTPs (10 mM)
5 µl 10x Puffer
34,5 µl H2O
10 min 94 °C
1 min 94 °C
1 min 50 °C
4 min 72 °C
25x
10 min 72 °C
Das erhaltene PCR-Produkt von etwa 3 kb wurde auf einem 1%igen Agarose-Gel kontrolliert und mit dem PCR-Purification Kit von Qiagen aufgereinigt.
Um anschließend ein Topo-TA-Cloning durchführen zu können, wurden an das PCR-Fragment A-Nucleotide mit einer Taq-Polymerase (MBI-Fermentas) ange-hängt.
1,2 µl MgCl2 (1,5 mM)
1 µl Taq-Polymerase
2 µl 10x Puffer
1µl dNTPs (10 mM)
9 µl PCR-Fragment I
5,8 µl H2O
Der Ansatz wurde 30 min bei 72 °C inkubiert, anschließend erfolgte die Klonierung in den Vektor des Topo-XL-Cloning Kits von Invitrogen. Das weitere Vorgehen erfolgte wie unter 3.5 und 3.6 dargestellt.
Fragment II: 1 µl ES-Zell-DNA
2,5 µl Primer k.o. kpn fII (2 µM) 2,5 µl Primer k.o. nru rII (2 µM)
1 µl dNTPs (10 mM)
5 µl 10x Puffer
0,5 µl Herkulase (Stratagene, La Jolla, CA, USA)
37,5 µl H2O
2 min 94 °C
30 sek 92 °C
30 sek 60 °C
3,5 min 72 °C
35x
10 min 72 °C
Der gesamte PCR-Ansatz wurde auf ein 0,8% Agarosegel aufgetragen und mittels des QIAEX II Kit (Qiagen, Hilden) aus dem Gel eluiert. Anschließend erfolgte die Klonierung in den ZeroBlunt TOPO-Vektor (Invitrogen) nach Anleitung (siehe 3.5).
Das weitere Vorgehen erfolgte wie unter 3.5 und 3.6 dargestellt.
Fragment III: 1 µl ES-Zell-DNA
2,5 µl Primer k.o. xho fIII (2 µM) 2,5 µl Primer k.o. sfi rIII (2 µM)
1 µl dNTPs (10 mM)
5 µl 10x Puffer
0,5 µl Herkulase (Stratagene, La Jolla, CA, USA)
37,5 µl H2O
2 min 94 °C
30 sek 92 °C
30 sek 50 °C
3,5 min 72 °C
30x
10 min 72 °C
Da nach dieser PCR die Ausbeute noch sehr gering war, wurde 1 µl der PCR in einer erneuten PCR unter den gleichen Bedingungen nochmals amplifiziert. Die Bande von etwa 1700 bp Größe wurde aus einem 0,8%igen Agarose-Gel eluiert. Um anschlie-ßend ein Topo-TCloning durchführen zu können, wurden an das PCR-Fragment A-Nucleotide mit einer Taq-Polymerase (MBI-Fermentas) angehängt.
1,2 µl MgCl2 (1,5 mM)
1 µl Taq-Polymerase
2 µl 10x Puffer
1µl dNTPs (10 mM)
14,8 µl PCR-Fragment III
Der Ansatz wurde 30 min bei 72 °C inkubiert und anschließend erfolgte die Klonie-rung in den Vektor des Topo-XL-Cloning Kits von Invitrogen. Das weitere Vorgehen erfolgte wie unter 3.5 und 3.6 dargestellt.
Neomycin-Resistenz-Kassette:
Die Neomycin-Resistenz-Kassette war in einem Vektor enthalten, den wir von Prof.
Dr. Thomas Hehlgans aus der Pathologie erhalten hatten. Um die für unsere Klonie-rungsstrategie passenden Restriktionsschnittstellen zu erhalten, wurde die Resistenz durch PCR mit Primern, an denen die Schnittstellen Sal I und Xho I angefügt waren, amplifiziert.
0,5 µg Vektor
1 µl Primer lox frt neo frt f (2 µM) 1 µl Primer lox frt neo frt r (2 µM)
5 µl 10x Puffer
10 µl Taq-Polymerase-Mix (Qiagen)
7 µl H2O
15 min 94 °C
30 sek 94 °C
30 sek 50 °C
2,5 min 72 °C
35x
10 min 72 °C
Die erhaltene Bande wurde aus einem 1%igen Agarose-Gel eluiert, in den pCR II–
TOPO -Vektor kloniert und anschließend sequenziert (3.5 und 3.6).
lox p-Element:
Das lox p-Element wurde aus einem durch Prof. Dr. Thomas Hehlgans zur Verfügung gestellten Vektor per PCR gewonnen. Dabei wurden durch die PCR geeignete Re-striktionsschnittstellen (Sal I) zur Klonierung angefügt.
Der Vektor hatte eine Konzentration von 1,2 µg/µl und wurde für die PCR 1:100.000 verdünnt.
1 µl Vektor
1 µl Primer lox p for (5 µM) 1 µl Primer lox p rev (5 µM)
1 µl dNTPs (10 mM)
5 µl 10x Puffer
0,5 µl Herkulase (Stratagene, La Jolla, CA, USA)
40,5 µl H2O
2 min 94 °C
30 sek 92 °C
30 sek 55 °C
1 min 72 °C
30x
10 min 72 °C
Die erhaltene Bande wurde aus einem 1%igen Agarose-Gel eluiert, in den pCR II-TOPO-Vektor kloniert und anschließend sequenziert (3.5 und 3.6).
Nachdem alle Fragmente, die Neomycin-Resistenz und das lox p-Element amplifi-ziert und kloniert waren, sollten die Komponenten in folgender Reihenfolge in den pSL301-Vektor einkloniert werden (Abb.3.8):
1. Klonierung von Fragment III mit Sfi I und Xho I
2. Klonierung der frt-flankierten Neomycin-Resistenz mit Xho I und Sal I 3. Klonierung von Fragment II mit Nru I und Kpn I
4. Klonierung von Fragment I mit Kpn I und Xba I
5. Klonierung des lox p Elements in Fr I mit XhoI bzw. Sal I
pSL+FrIII+Neo+FrII+FrI+lox 13292 bp
Fragment II Fragment III
Fragment I
Fragment I
FRT
FRT Neomycin
loxP
loxP
KpnI (3179)
NruI (6517) SfiI (10267)
SalI (6527) SalI (13256)
XhoI (1344)
XhoI (5260) XhoI (8551)
XbaI (44)
XbaI (6610) XbaI (8225)
XbaI (8530)
Abb.3.8: Targeting-Vektor für die konditionelle Gp96-knock-out-Maus