Behandlung der Spendertiere mit Gp96, Gp95/Pep und Gp96/denat

Die Behandlung der Spendertiere für den Transfer von CD4⁺CD62L⁺-T-Zellen mit Gp96 erfolgte in drei unabhängigen Transferexperimenten. In zweien dieser Versu-che wurden die Spendertiere zweimal und in einem der VersuVersu-che wurden die Spen-dertiere dreimal mit jeweils 100 µg Gp96 behandelt. Die Injektionen erfolgten sub cutan im Abstand von jeweils einer Woche. Die Wahl der Menge und der Injektions-zeitpunkte war dabei der Arbeit von Chandawarkar und Mitarbeitern abgeleitet, die in Ihren Versuchen NOD-Mäuse mit diesen Mengen behandelt hatten.

Für die Beurteilung der Schwere der Entzündung wurden verschiedene Para-meter untersucht. Zunächst wurden die Tiere wöchentlich gewogen. Ein Gewichts-verlust kann dabei ein klinischer Hinweis auf eine Darmentzündung sein, da die Tiere eine Diarrhö entwickeln. Im ersten Transfer-Versuch war eine erwartete Gewichts-entwicklung erzielt worden. Die PBS-Tiere nahmen stetig an Gewicht zu, wohinge-gen die CD62L⁺-Tiere ab der zweiten Woche nach T-Zell-Transfer Gewicht zu verlie-ren begannen. Die Gewichtsentwicklung der Tiere, die Zellen aus Gp96-vorbehandelten Donoren erhalten hatten, und die, die nach Transfer behandelt wor-den waren, lagen zwischen diesen Kontrollgruppen. Diese Beobachtung ließ bereits während des Versuchs darauf schließen, dass die Tiere eine schwächere intestinale Entzündung entwickelten als die CD62L⁺-Tiere. In den beiden folgenden

Transfer-Versuchen waren die Gewichtsverläufe nicht mehr so eindeutig. Vor allem die Tiere der CD62L⁺-Gruppe verloren nicht mehr so stark an Gewicht. Die PBS-Tiere verloren im dritten Transfer sogar genauso an Gewicht wie die Tiere der CD62L⁺-Gruppe, so dass während des laufenden Versuchs anhand des Gewichtsverlaufs kein Rückschluß auf mögliche Unterschiede in der Schwere der Entzündung zwischen den Gruppen gezogen werden konnte. Mögliche Ursachen für die Unterschiede in den Gewichtskurven der verschiedenen Experimente könnten äußere Faktoren, wie die Verweildauer im Tierstall vor dem Versuch und das Alter der Tiere sein. Je länger die Mäuse im hauseigenen Tierstall vor dem Versuch verweilen, desto weniger stark verlieren sie an Gewicht. Das kann z.B. an der Futterumstellung vom Lieferanten zum „neuen“ Tierstall liegen. Vor allem bei der Dextran-Sodium-Sulfat (DSS)-Kolitis ist es wichtig den Tieren vor Beginn des Versuchs eine Eingewöhnungsphase zu gönnen, damit sie nicht so rasch an Gewicht verlieren. Aber auch bei der Transfer-Kolitis sollte man aufgrund dieser Ergebnisse die Verweildauer im Tierstall und das Alter der Tiere möglichst einheitlich gestalten, um mögliche dadurch bedingte Unter-schiede in den Gewichtskurven zu vermeiden. Da es sich nicht um einen SPF-Tierstall handelt, kann auch nicht vollständig ausgeschlossen werden, dass die Scid-Mäuse bereits bei der Lieferung an einer Infektion litten.

Weiterhin wurden, nachdem die Tiere getötet worden waren, die Milzgewichte ermittelt und die Darmlängen gemessen. Letzteres ist bei der DSS-induzierten Kolitis bei Mäusen ein guter Anhaltspunkt für eine bestehende Darmentzündung bei den Tieren, da sich der Darm in Abhängigkeit vom Grad der Entzündung verkürzt und verdickt. Bei der Transfer-Kolitis korrelieren beide Paramater jedoch nicht verlässlich mit dem Schweregrad der Kolitis. Dies bestätigte sich auch in der vorliegenden Ar-beit. Lediglich im zweiten Transfer waren die Därme der Tiere, die histologisch eine Entzündung aufwiesen, im Vergleich zur PBS-Gruppe, signifikant verkürzt. In den beiden anderen Transfer-Experimenten war dies nicht der Fall. Für die Zukunft kön-nen bei Transfer-Exprerimenten diese beiden Parameter außer Acht gelassen wer-den.

5.3.1.1 Behandlung der Spendertiere: Histologie

Den wichtigsten Parameter für die Beurteilung des Schweregrades der Darmentzün-dung stellt die histologische Untersuchung des Kolons dar. Dabei wird das gesamte Kolon auf Entzündungsinfiltrate und Epithelschäden untersucht und ein Score gebil-det. Je niedriger der Score, desto geringer die Entzündung.

Die Tiere der VB Gp96-Gruppen wiesen im ersten (1,3 ± 0,6) und im zweiten Transfer (1,6 ± 1,2), im Vergleich zu Tieren der CD62L⁺-Gruppe (2,6 ± 0,25 und 2,8 ± 0,4), einen signifikant besseren Score auf. Im dritten Transfer war der Score der Tie-re der VB Gp96-Gruppe nicht statistisch signifikant niedriger (2,2 ± 0,5), wobei der Score der CD62L⁺-Gruppe dem der ersten beiden Transfer-Experimente entsprach (2,7 ± 0,4). Da beim ersten und dritten Transfer die Vorbehandlung der Spendertiere auf die gleiche Weise erfolgt war, können die Scores dieser Gruppe, und der Kon-trollgruppen (PBS und CD62L⁺) zusammengefasst werden. Dabei zeigt sich ein signifikanter Unterschied im histologischen Score und damit im Grad der intestinalen Entzündung. Die Tiere der Gp96-Gruppe hatten einen Score von 1,8 ± 0,7, die der CD62L⁺-Gruppe einen von 2,7 ± 0,3. Eine dreimalige oder zweimalige Behandlung der Spendertiere mit je 100 µg Gp96 machte somit keinen Unterschied in der Aus-prägung der intestinalen Entzündung. Warum die Tiere im dritten Transferversuch histologisch keine deutliche Verbesserung der intestinalen Entzündung aufwiesen, lässt sich nur schwer nachvollziehen. Möglicherweise kam es bei diesem Experiment zu einer Infektion. Diese Vermutung ergibt sich aus der Beobachtung, dass Tiere der VB Gp96/denat.-Gruppe, die eine starke Kolitis entwickelten und zudem eine Kon-junktivitis aufwiesen, mit Tieren der anderen Gruppen in einem Käfig saßen. Es war zu beobachten, dass nach einigen Tagen die Konjunktivitis auch auf die Tiere der VB Gp96-Gruppe übetragen wurde. Dies könnte eine mögliche Ursache für die starke intestinale Entzündung der Tiere sein.

Die Behandlung der Spender mit peptidbeladenem Gp96 erbrachte im ersten Transfer ebenfalls eine statistisch signifikante Verbesserung der Entzündung (1,5 ± 0,9), wobei der Unterschied beim zweiten Transfer keine Signifikanz zeigte (2,0 ± 0,8). Da beim ersten Transfer die Behandlung zweimal und beim zweiten Transfer dreimal erfolgte, kann man die Ergebnisse korrekterweise nicht zusammenfassen, obwohl dies zu einem signifikanten Unterschied im Entzündungsgrad führen würde

(Gp96/Pep [1,8 ± 0,9] vs. CD62L+ [2,7 ± 0,4] p<0,01). Die Beladung von Gp96 mit Peptiden scheint demnach keinen Vorteil für die Inhibition der intestinalen Entzün-dung zu bringen. Eine Möglichkeit wäre dass die Peptide, da sie nicht kovalent an Gp96 gebunden sind, möglicherweise dissoziieren, so dass bei der Behandlung der Mäuse ein Teil der Peptide nicht an Gp96 gebunden transferiert wurde, sondern als freies Antigen. Dies könnte eine gegen diese E.coli-Peptide gerichtete aktive Immun-antwort auslösen und zu reaktiven T-Zellen führen, die im Darm der Empfänger-Tiere eine Entzündung auslösen. Das vorhandene freie Gp96 - und möglicherweise auch das peptidbeladene Gp96 - tragen aber vermutlich zusätzlich zur Generierung eines regulatorischen T-Zell-Typs bei, so dass die Entzündung bei Behandlung der Spen-dertiere mit Gp96/Pep dennoch leicht verbessert wird. Dass im zweiten Transfer die intestinale Entzündung der Empfängertiere, die Zellen von mit Gp96/Pep behandel-ten Donormäusen erhielbehandel-ten, ausgeprägter war, als im ersbehandel-ten Transfer, lässt sich möglicherweise dadurch erklären, dass das verwendete peptidbeladene Gp96 zum Zeitpunkt des zweiten Experiments bereits längere Zeit gelagert worden war. Da-durch könnte sich mehr Peptid von Gp96 gelöst haben, als dies beim ersten Transfer der Fall war, als das Gp96 noch frisch war.

Die Behandlung der Donortiere mit denaturiertem Gp96 führte, wie erwartet, zu keiner Verbesserung der intestinalen Entzündung. Gp96/denat. diente als Kontrol-le dafür, dass Gp96 nur im nativen Zustand zu einer Modulation der Immunantwort in der Lage ist, was im dritten Transfer gezeigt werden konnte.

5.3.1.2 Behandlung der Spendertiere: Zytokinsekretion

Zur Beurteilung des T-Zell-Typs, der nach Gp96-Behandlung in den Spendertieren erzeugt wurde, wurden die zu transferierenden Zellen auf die Sekretion der Zytokine IL-4, IL-6, IL-10, IL-13, TNF und IFN-γ untersucht. Die Sekretion derselben Zytokine wurde auch bei aus den Scid-Tieren nach Transfer isolierten MLN-Zellen gemessen, um feststellen zu können, welchen Phänotyp die Zellen nach dem Transfer aufwie-sen. Da Scid-Tiere keine funktionsfähigen T-Zellen besitzen, werden bei der Isolation der MLN u.a. die einige Wochen zuvor transferierten T-Zellen isoliert.

In unseren Experimenten konnte bei der Betrachtung der Zytokine kein so eindeutiges Ergebnis erzielt werden, wie bei den histologischen Scores. Im ersten

Versuch wurden die transferierten Donorzellen nicht auf ihre Zytokinsekretion unter-sucht. Im zweiten Transfer zeigte sich ein deutlicher Unterschied zwischen CD4⁺CD62L⁺-Zellen von Donoren nach Behandlung mit Gp96 und unbehandelten Tieren. Erstere produzierten signifikant vermehrt antiinflammatorische (4, 10, IL-13) und weniger proinflammtorische Zytokine (IL-6, TNF, IFN-γ). Auch nach Behand-lung der Spendertiere mit Gp96/Pep zeigte sich ein ähnliches Bild. Im dritten Trans-fer zeigte sich eine andere Situation: Durch Gp96 konnte dort kein antiinflammatori-sches Zytokinprofil in den T-Zellen erzeugt werden. Lediglich die IFN-γ-Sekretion war herabgesetzt. Dies zeigte sich jedoch auch nach Behandlung mit denaturiertem Gp96. Möglicherweise erklärt dieses unveränderte Zytokinprofil der transferierten T-Zellen, weshalb es in diesem Transferversuch zu keiner deutlichen Verbesserung der intestinalen Entzündung kam. Da im ersten Transfer die T-Zellen nicht auf die Zyto-kinsekretion hin charakterisiert wurden, kann kein eindeutiger Schluss auf die Wir-kung von Gp96 gezogen werden. Weil aber im ersten Transfer, genauso wie im zwei-ten, eine Verbesserung der Entzündung erzielt wurde, kann vermutet werden, dass Gp96 das Zytokinprofils auch im ersten Transfer moduliert hat. Warum wir dieses Phänomen im dritten Versuch nicht nachvollziehen konnten, bleibt unklar. Es wurde eine andere Charge Gp96 verwendet als im ersten und zweiten Transfer. Es kann, trotz der Kontrollen der Firma Immatics Biotechnolgies, nicht ausgeschlossen wer-den, dass die Endotoxin-Menge dieser Charge höher war als in der ersten Charge.

Des Weiteren kann auch nicht ausgeschlossen werden, dass die Balb/c-Spender-Tiere eine unerkannte Infektion hatten - diese kann z.B. schon bei Lieferung der Tie-re bestanden haben - und dass dadurch Tie-reaktive T-Zellen generiert wurden. Dafür spricht auch der starke Gewichtsverlust und die schlechtere Histologie. Um die Frage definitiv zu klären, ob Gp96 in der Lage ist, regulatorische T-Zellen zu generieren, müssen auf jeden Fall weitere Transfer-Versuche, mit der Untersuchung der Zytokine der zu transferierenden Zellen, durchgeführt werden. Ein weiteres regulatorisches Zytokin, TGF-β, kann dabei ergänzend untersucht werden. Zusätzlich können die CD4⁺CD62L⁺-T-Zellen auch auf die Expression von Foxp3 (forkhead box P3) und der regulatorischen T-Zell-Marker GITR (glucokorticoid-induced tumor necrosis factor receptor), CTLA4 (cytotoxic t-lymphocyte antigen) und CD30 betrachtet werden.

Die MLN-Zellen wurden bei allen drei Versuchen isoliert und ebenfalls auf die Sekretion der oben genanten Zytokine untersucht. Meist ergab sich dabei kein

Un-terschied in der Relation der Mengen zwischen den unUn-terschiedlichen Gruppen, wenn die MLN-Zellen stimuliert wurden oder unstimuliert blieben, lediglich die Ge-samtmenge war nach Stimulation höher. Im ersten und dritten Transfer war das Zy-tokinprofil der MLN-Zellen bei Tieren, die Zellen aus mit Gp96 behandelten Spendern erhalten hatten, ähnlich. IL-4, IL-10 und IL-13 war, im Vergleich zur CD62L⁺-Gruppe, in beiden Versuchen erhöht. Somit ließ sich also feststellen, dass in den Scid-Tieren vermehrt TH2-Zytokine gebildet wurden, wenn sie Zellen aus zweimal mit Gp96 be-handelten Spendern erhalten hatten. Der zweite Transfer unterschied sich deutlich vom ersten und dritten Transfer was die Zytokinsekretion betraf. Obwohl die transfe-rierten Zellen gerade in diesem Transfer ein antiinflammtorisches Zytokinmuster hat-ten, war dies für die MLN-Zellen nicht der Fall. Im Vergleich zur CD62L⁺-Gruppe war IL-6 erhöht und IL-13 erniedrigt. Alle anderen Zytokine zeigten dieselbe Sekretionsra-te wie in der CD62⁺-Gruppe. Aufgrund der Zytokinsekretion der MLN-Zellen lässt sich also im zweiten Transfer die Verbesserung der intestinalen Entzündung nicht erklä-ren. Da aber alle Tiere, auch die, die Zellen aus mit Gp96 behandelten Donortieren erhalten hatten, und die, die nach dem Transfer mit Gp96 behandelt worden waren, eine, wenn auch schwächere, intestinale Entzündung hatten, ist anzunehmen, dass Gp96 nicht in der Lage war, alle transferierten Zellen zu modifizieren. Dies legt den Schluß nahe, dass immer regulatorische T-Zellen zusammen mit aktivierten T-Zellen kotransferiert wurden. Es ist möglich, dass im Vergleich zu aktivierten T-Zellen relativ wenige regulatorische T-Zellen vorlagen, so dass das Zytokinmuster nicht stark ver-ändert wurde. Die wenigen regulatorischen T-Zellen könnten aber dennoch im Ge-webe, bei Zell-Zell-Kontakt, einen starken protektiven Effekt aufweisen. Nur weitere Versuche mit Gp96-Behandlung der Donortiere können über die Relevanz der bishe-rigen Ergebnisse Aufschluss geben. Auch die MLN-Zellen sollten dann auf die Pro-duktion von TGF-β und die Expression von FoxP3, GITR, CTLA4 und CD30 unter-sucht werden. Die Untersuchung dieser Marker lässt einen genaueren Schluss über den Phänotyp und die Funktion der generierten T-Zellen zu.