CD4 + CD62L + Transfer-Kolitis-Modell

Bei diesem Kolitis-Modell wird eine Untergruppe der Milzzellen aus Balb/c Spender-tieren in eine Scid-Maus transferiert. Als Marker für naive CD4 positive T-Zellen wur-de dabei CD62L gewählt. Scid-Mäuse besitzen wewur-der T- noch B-Zellen, so dass es durch den Transfer dieser Zellen zu einer teilweisen Rekonstitution des Immunsys-tems kommt. Das CD4⁺ CD62L⁺ Transfer-Kolitis-Modell ist dem CD4⁺CD45RB^high -Transfer-Modell abgeleitet ²⁴².

Einer gesunden ggf. vorbehandelten Balb/c Spendermaus wird die Milz ent-nommen. Die Milz wird mit dem Stempel einer Spritze in Medium (RPMI 1640 mit 10% FCS, P/S, β-Me) zermahlen. Durch Filtern der entstandenen Suspension durch einen 70µm Filter wird eine Einzelzellsuspension hergestellt. Es erfolgt ein 15 minüti-ger Zentrifugationsschritt bei 1600 rpm. Der Überstand wird verworfen und das Zell-pellet wird zur Lyse der Erythrozyten in 20 ml 1xACK-Puffer (Ammonium-Chlorid-Kalium-Puffer) resuspendiert und für zehn min auf Eis inkubiert. Es erfolgt eine lang-same Neutralisierung mit 20 ml Medium und anschließende Zentrifugation für zehn min bei 1600 rpm. Die Zellen werden anschließend in fünf ml Waschpuffer (PBS mit 0,5% BSA, 0,01 M EDTA) resuspendiert und gezählt.

Es folgt Inkubation der ersten Antikörper. Auf 1x10⁷ Zellen werden 5 µg jedes Antikörpers (CD45R, CD11b, CD8, MHC II) pipetiert und 30 min bei 4 °C auf einem

Rotor inkubiert. Die Zellen werden anschließend zweimal mit Waschpuffer gewa-schen und wieder in fünf ml des Waschpuffers resuspendiert.

Es folgt die Inkubation mit goat anti-rat-Bead-Antikörpern. Auf 10⁷ Zellen wer-den 20 µl des AK gegeben und für 15 min bei 4 °C auf einem Rotor inkubiert. Die Zellen werden anschließend einmal mit Waschpuffer gewaschen und in einem ml Waschpuffer resuspendiert.

Die Zellseparation erfolgt im Auto-Macs mit dem Programm DepleteS. Dabei handelt es sich um eine Negativselektion, d.h., die Negativzellfraktion enthält die CD4⁺-Zellen. Nach der Separation werden die Zellen gezählt, und es erfolgt die zwei-te Inkubation mit Macs-Bead-Antikörpern. Auf 10⁷ Zellen werden nun 10 µl anti-CD62L-Bead Antikörper pipettiert und es erfolgte eine 20 minütige Inkubation bei 4

°C auf einem Rotor. Anschließend werden die Zellen einmal mit Waschpuffer gewa-schen und in einem ml Waschpuffer resupendiert.

Die zweite Zellseparation erfolgt im Auto-Macs mit dem Programm PosselS.

Hierbei handelt es sich um eine Positivselektion, so dass die Positivfraktion die CD62L⁺-Zellen enthält.

Die CD4⁺ CD62L⁺ Zellen werden zweimal mit Waschpuffer gewaschen, ge-zählt und die Zellzahl wird auf 2,5x10⁶ Zellen/ml eingestellt. Als Empfängertiere die-nen CB17 Scid-Mäuse im Alter von 4 - 6 Wochen. Pro Tier werden 2,5x10⁵ Zellen in 100 µl transferiert. Die Zellen werden intraperitoneal appliziert.

Die gesamte Zellpopulation wird mittels FACS-Analyse überprüft. Die restli-chen Zellen werden zum einen in einem Stimmulations-Assay mit und ohne anti-CD3 stimuliert (3.11.2), der Rest wird in 350 µl RLT-Puffer für die Isolation von RNA lysiert und bei -80 °C weggefroren.

Das Gewicht der Tiere wird einmal wöchentlich kontrolliert. Gegebenenfalls werden die Tiere nach dem Transfer mit Gp96, peptidbeladenem Gp96 (Gp96/Pep) oder denaturiertem Gp96 (GP96/denat.) behandelt. Die Behandlung erfolgt dabei am Tag 1, eine, zwei und drei Wochen nach Transfer. Es werden jeweils 100 µg Protein in 100 µl PBS sub cutan in den Nacken verabreicht. Das Gp96 und die Peptide wur-den von der Firma Immatics Biotechnologies (Tübingen) hergestellt. Die Beladung von Gp96 wurde ebenfalls durch Immatics Biotechnologies vorgenommen. Die Sub-stanzen waren endotoxinfrei. Nach 6 - 8 Wochen entwickeln die Tiere eine chroni-sche Kolitis und der Versuch wird durch Tötung der Tiere beendet.

Den Tieren wird der Darm entnommen und für histologische Untersuchungen und Immunhistochemie präpariert. Des Weiteren werden die mesenterialen Lymph-knoten entnommen, um mit ihnen eine LymphLymph-knotenzellstimulation durchzuführen (3.11.1).

3.12.1 Stimulation mesenterialer Lymphknotenzellen

Einen oder mehrere Tage vor der geplanten Zellstimulation müssen die benötigten Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit anti-CD3 Antikörpern beschichtet werden. Dazu werden in jedes Loch 100 µl einer mit 2,5 µg/ml konzentrierten anti CD3-AK-Lösung pipettiert werden. Die Platten werden über Nacht bei 4 °C inkubiert.

Die mesenterialen Lymphknoten einer Gruppe von Tieren werden in Medium (RPMI, 10% FCS, P/S, β-Me) gesammelt und mit einem Spritzenstempel zerdrückt.

Die Zellsuspension wird anschließend durch ein 70 µm Zellsieb gefiltert um eine Ein-zellsuspension herzustellen. Es erfolgt Zentrifugation bei 1600 rpm für 15 min bei 4

°C. Der Überstand wird verworfen und die Zellen werden nochmals in Medium gewa-schen. Inzwischen wird die mit anti-CD3 beschichtete 96-Well-Platte gewagewa-schen.

Dazu wird die AK-Lösung steril abgesaugt, es werden 100 µl PBS in die Vertiefungen pipettiert und erneut abgesaugt. Nach der Zentrifugation werden die Zellen gezählt.

Die Zellzahl wird auf 1x10⁵ Zellen/100 µl eingestellt und es werden 2x10⁵ Zellen pro Vertiefung eingesät. Dabei werden die Zellen, die mit anti-CD3 stimuliert werden, in Medium mit 50U/ml IL-2 aufgenommen. Die Zellen, die nicht mit anti-CD3 stimuliert werden, werden in Medium ohne IL-2 aufgenommen.

Für jede Gruppe werden 8 Wells mit anti CD3 stimuliert und 8 Wells werden ohne Stimulation für 24 h bei 37 °C inkubiert. Danach wird der Überstand abgenom-men und in einer neuen 96-Well-Platte bei -20 °C bis zur Zytokinbestimmung (3.9) weggefroren.

3.12.2 Stimulation von CD4⁺ CD62L⁺-Zellen

Die Stimulation der CD4⁺ CD62L⁺ Zellen erfolgt analog der Lymphknoten-zellstimulation. Der Unterschied besteht darin, dass die mit anti-CD3 zu stimulieren-den Zellen ohne IL-2 stimuliert werstimulieren-den. Die Stimulation erfolgt ebenfalls 24 h bei 37

°C. Der Überstand wird danach abgenommen und bei -20 °C bis zur Zytokinbestim-mung weggefroren.