Abbildung 10: Rasterelektronenmikroskopisches Bild von Magnesiumgranulat. Foto:
IW
1.11 Fragestellung
Unter Ber¨ucksichtigung der oben genannten Fakten und ¨Uberlegungen scheinen Magnesium und Disaccharide als Abrasivmaterial eine interessante M¨oglichkeit darzustellen.
Saccharide als Abrasivstoffe bringen praktisch keinen Fremdstoff in den K¨orper und reduzieren damit Gefahren wie Fremdk¨orperreaktionen und Toxizit¨at. Durch die hohe L¨oslichkeit bleiben keine Partikel im K¨orper zur¨uck.
Der Vorteil des Magnesiums gegen¨uber den Disacchariden liegt in den besseren Schneideigenschaften. Des Weiteren l¨ost sich das Metall zwar durch Korrosion im Gewebe auf, allerdings deutlich langsamer als Zucker. Dadurch wird vermie-den, dass es schon in der Schneidl¨osung angel¨ost und damit abgerundet wird.
Problematisch k¨onnte die Tatsache sein, dass bei der Korrosion H2 entsteht. Da dieser Vorgang bei reinem Magnesium schon innerhalb weniger Stunden abl¨auft und eine zu schnelle H2-Bildung im Gewebe zu Schaum und Blasenbildung f¨uhren k¨onnte, muss die Korrosion durch Legierungen mit anderen Elementen verlang-samt werden. Hierf¨ur kommen u.a. Aluminium, Zink, Seltene Erden, oder die Beschichtung mit Fluorid in Frage.
1.11 Fragestellung 34
Ziel der durchgef¨uhrten Versuche war, die Auswirkung der Zuckerl¨osungen und Magnesiumlegierungen auf lebende Zellen zu untersuchen und auf eine eventuelle Toxizit¨at in Abh¨angigkeit von der Konzentration zu ¨uberpr¨ufen. Außerdem sollte die Wirkung von Magnesium mit der von Zuckerl¨osungen auf die Zellen verglichen und damit eine Eignung f¨ur den Einsatz als Abrasivmaterial unter dem Aspekt der Biokompatibilit¨at festgestellt werden.
35
2 Material und Methoden
2.1 Allgemeine Materialien und Methoden
2.1.1 L¨osungen
PBS: 8,0 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,4 g Na2HPO4. 2 H2O, 0,2 g KH2PO4 ad 1000 ml mit aqua dest.; pH auf 6,8 – 7,0 mit 1 N NaOH einstellen, autoklavieren.
DMEM: Als Kulturmedium f¨ur S¨augerzellen wurde Dulbecco’s modified Eagle (DME-) Medium von Sigma mit 10 % Fetal Calf Serum (FCS) von Boehrin-ger Mannheim bzw. JHR Biosciences, 100µg/ml Penicillin und 100µg/ml Streptomycin von Gibco BRL, sowie 20 mM Glutamin von Serva verwendet, sofern nicht anders vermerkt.
MEM: Die L88-5-Zellen wurden in MEM-α with Glutamax-1 von Gibco-BRL mit 10 % FCS und Antibiotika (wie DMEM) kultiviert.
RPMI: Als Kulturmedium f¨ur Jurkat-Zellen wurde RPMI-Medium mit Zus¨at-zen von 10 % FCS, 20 mM Glutamin, 100µg/ml Penicillin und 100µg/ml Streptomycin verwendet.
NaCl: 0,9 %ige Natriumchloridl¨osung, NaCl von Merck
TEP: Trypsin-EDTA-Solution (10 x) (TEP) von Sigma verd¨unnt in PBS wurde zum Abl¨osen der Zellen verwendet.
HEPES: 10mM Hepes/NaOH, pH 7,4, 140 mM NaCl, 5 mM CaCl2.
2.1.2 F¨arbungen
Hoechst: Hoechst 33258 (Bisbenzimid = 2p-(4-hydroxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)- 2,5p-bi-benzimidazole). Fluoreszenzf¨arbung von DNA, Che-mical Abstracts No 23491-45-4
Propidiumjodid: Propidiumjodid (PJ), Sigma. Chemical Abstracts No 25535-16-4
2.1 Allgemeine Materialien und Methoden 36
Annexin-V-FLUOS: Boehringer Mannheim (Best.Nr.: 1828681), Annexin Mar-kierungsl¨osung: 20µl Annexin-V-FLUOS Stamml¨osung in 1000µl Hepes-Puffer.
Trypanblau: 10 x, Sigma, C.I. Nr. 23850, Chemical Abstracts No 72-57-1 Staurosporin: Zum Induzieren von Apoptose wurde Staurosporin von Fluka Bio
Chemika verwandt, Endkonzentration: 500 nM.
2.1.3 Verwendete Zelllinien BHK-21
BHK-21 [C-13], ATCC Nummer: CCL-10
Organismus: Mesocricetus auratus (Goldhamster) Morphologie: Fibroblast
Gewebe: Niere NIH/3T3
ATCC Nummer: CRL-1658
Organismus: Mus musculus (Maus) Morphologie: Fibroblast
Gewebe: Embryo
Transfiziert mit Enhanced GFP von Clontech L88-5
Organismus: Homo sapiens (Mensch) Gewebe: Stroma
SV 40 large T-Antigen immortalized (Thalmeyer et al) Jurkat
Organismus: Homo sapiens (Mensch) Morphologie: Lymphoblast
Gewebe: T-Lymphozyt; Akute T-Zell-Leuk¨amie
2.1 Allgemeine Materialien und Methoden 37
2.1.4 Ger¨ate
Mikroskope: Olympus CK2 ULWCD 0.30 (Olympus optical co. GmbH, Ham-burg)
Leitz Labovert CF 11 (Ernst Leitz GmbH & Co. KG, Hamburg) Zellkultur-Inkubatoren: Firma Scientific Water-Jacked Inkubator 3325
Heraeus B 5060 EK-002
Sterilbanken: The Baker Company Sterilgard Hood VBM 600 Heraeus Lamin Air HLB 2448
Zellz¨ahler: Scharfe System CASY 1 Zentrifuge: Hettich Rotanta/s, Table Top
Pipettierhilfe: Integra biosciences IBS - Pipetboy acu
Glaspipetten: Hirschmann EM Zell-gen 5 ml, 10 ml, 20 ml DIN B 1,10
Sterilfilter: Sartorius Membranfilter, Porengr¨oße 0,45µm und 0,22µm, d=47 mm (Satorius GmbH, G¨ottingen)
Zellkulturschalen: Einwegartikel aus Kunststoff f¨ur die Zellkultur wurden von den Firmen Costar, Gibco, Nunc, Greiner, Falcon und Seromed bezogen.
FACS: FACSCalibur (Becton Dickinson); Auswertung mit dem Programm Mod-Fit.
2.1.5 Sterilisierung
Glasger¨ate wurden 4 h bei 180➦C im Trockenschrank sterilisiert. Plastikgef¨aße und L¨osungen wurden bei 121➦C, 1 bar f¨ur 20 min autoklaviert. Hitzempfindliche L¨osungen wurden durch 0,2µm Sterilfilter filtriert.
2.1.6 Einfrieren / Auftauen von Zellen
Fast konfluent gewachsene Zellen einer kleinen Kulturflasche (ca. 5 x 106 Zellen) wurden in 5 ml DME-Medium aufgenommen und 5 min bei 1000 rpm zentrifugiert.
2.1 Allgemeine Materialien und Methoden 38
Der ¨Uberstand wurde abgesaugt, die Zellen in 1 ml kaltem Einfriermedium (FCS mit 5 % DMSO) aufgenommen und auf zwei Einfrierr¨ohrchen (Bio-Freeze-Vials, Fa. Costar) aliquotiert.
Die R¨ohrchen wurden 15 min auf Eis inkubiert, anschließend in Zellstoff verpackt und in Styropork¨asten bei -70➦C gelagert. Nach 12 Stunden konnten sie in fl¨us-sigen Stickstoff (-196➦C) ¨uberf¨uhrt und dort f¨ur l¨angere Zeit gelagert werden.
W¨ahrend das Einfrieren von Zellen langsam erfolgen sollte, muss das Auftau-en schnell gehAuftau-en. Einfrierr¨ohrchAuftau-en wurdAuftau-en in ca. 5 min bei 37➦C aufgetaut und sofort in eine kleine Zellkulturflasche mit 5 ml supplementierten DME-Medium
¨uberf¨uhrt. Nach dem Anwachsen der Zellen wurde ein Medienwechsel durchge-f¨uhrt, da das im Einfriermedium enthaltene Dimethylsulfoxid das Wachstum der Zellen hemmt.
2.1.7 Kultivierung von Zellen
F¨ur die Zelllinien BHK-21 und NIH/3T3 wurde DME mit den oben beschriebenen Zus¨atzen verwendet, f¨ur L88-5 α-MEM.
Die Zellen wurden im CO2-Inkubator bei 37➦C gezogen. Je nach Zelldichte wurde nach 2 bis 5 Tagen das Medium gewechselt oder, wenn sie konfluent waren, die Zellen umgesetzt.
2.1.8 Passagieren von Zellen
Hierzu wurde das Medium von adh¨arenten Zellen abgesaugt ohne die Zellen vom Boden zu l¨osen. Um Mediumreste zu entfernen, wurde mit der entsprechenden Menge PBS (s. Tab. 6) gesp¨ult, bevor TEP auf den Zellrasen gegeben wurde.
Nach 3 bis 5 Minuten sollten die Zellen vom Untergrund gel¨ost sein und frei im TEP herumschwimmen, ansonsten wird vorsichtig abgeklopft oder mit der Pipette gesp¨ult. Durch Zugabe der 10 bis 15-fachen Menge an DMEM wurde die Aktivit¨at des Trypsins gestoppt. Nun konnte man die Zellen ausz¨ahlen und in einer neuen Flasche auss¨aen.