Einfluss der Zuckerl¨osungen auf unterschiedliche Zelllinien 54

Die verschiedenen Zellen wurden jeweils in den Saccharose- und Salzl¨osungen (10 % Sacch., 1,55 % Sacch., PBS, Aqua dest. und 1,55 % mit PBS verd¨unnt) 4 h inkubiert. Anschließend wurde die Einwirkzeit der L¨osungen durch Zugabe von DME gestoppt, die Zellen mit TEP abgel¨ost und nach F¨arben mit TB am Mi-kroskop ausgez¨ahlt. Kontrolle mit DME. In Abbildung 18 ist der Anteil der toten Zellen (in Prozent) an der Gesamtzahl der drei Zellarten BHK (blau), NIH/3T3 (gelb) und L88-5 (rot) dargestellt.

Es konnte gezeigt werden, dass bei der Behandlung der Zellen mit den Inku-bationsl¨osungen sich die verschiedenen Zelllinien ¨ahnlich verhielten. Allgemein schienen die menschlichen L88-5-Zellen empfindlicher gegen sch¨adigende Einfl¨us-se zu Einfl¨us-sein, als die anderen Zelllinien. Da dieEinfl¨us-ser Unterschied aber besonders bei physiologischen Osmolarit¨aten auftritt, ist zu vermuten, dass dieser Sachverhalt eher durch den Mediumentzug oder eine gr¨oßere Empfindlichkeit gegen¨uber der

3.1 Zucker 55

0%

20%

40%

60%

80%

100%

Kontrolle(DME)

10%Sacch.

1,55%Sacch

1,55%SacchinPBS

PBS

Aquadest.

Abbildung 18: Einfluss der Zuckerl¨osungen auf unterschiedliche Zelllinien. Gezeigt ist der Anteil der toten Zellen (in Prozent) an der Gesamtzahl der Zellen. Zellarten: BHK-21 (blau), NIH/3T3 (gelb) und L88-5 (rot) dargestellt (n = 3).

Versuchsprozedur verursacht wurde, als durch eine h¨ohere Sensibilit¨at gegen¨uber niedrigen Osmolarit¨aten.

3.1.8 Einfluss von hypoosmolaren L¨osungen auf die STAT-1–Aktivit¨at Nach Inkubation von kultivierten Zellen mit z. B. Interferon-γ l¨asst sich eine Translokation von STAT-1 in die Zellen beobachten (vgl. S. 19). Dies indiziert, dass die Zellen die Transkriptionsrate bestimmter Gene ver¨andern, deren Tran-skriptionsprodukte sie gegen evtl. vorhandene sch¨adigende Einfl¨usse sch¨utzen k¨onnen. Um diese Vorg¨ange auch nach Behandlung mit den Schneidl¨osungen nachzuweisen, wurde der folgende Versuch durchgef¨uhrt.

Mit STAT-1-GFP transfizierte NIH/3T3-Zellen wurden in Saccharosel¨osungen verschiedener Konzentration (1,55 % und 5,45 %) oder in PBS inkubiert. Zur Kon-trolle wurden einige Kulturen mit Interferon-γ-L¨osung inkubiert. Nach 30 min, 1 h

3.1 Zucker 56

Abbildung 19: Fluoreszenzmikroskopisches Bild von NIH/3T3-Zellen nach Inkubation:

A: mit Interferon-γ (Postivkontrolle), B: mit Saccharosel¨osung 1,55 % und C: mit PBS (Negativkontrolle)

und nach 4 h wurden die Zellen unter dem Fluoreszenzmikroskop betrachtet und fotografiert.

Durch Behandlung mit der hypoosmolaren Saccharosel¨osung von 1,55 % konnte bei einem Teil der Zellen eine Verschiebung von STAT-1-GFP in das Kerninnere beobachtet werden. Sie unterschied sich von dem Nativbild oder Behandlung mit PBS, war aber sehr viel weniger deutlich als bei der Kontrollbehandlung mit Interferon-γ (s. Abb. 19).

Nach Meisse et al.[36] wird intrazellul¨ares STAT-1 auch aktiviert, wenn die Zel-len hypoosmolarer Umgebung ausgesetzt sind. Da die Kerntranslokation schwach ausgepr¨agt und nur bei einem Teil der Zellen zu beobachten war, wurden die-se Untersuchungen nicht weiter verfolgt. Die Ver¨anderungen lasdie-sen sich durch die Hypoosmolarit¨at der L¨osung erkl¨aren und k¨onnen z. B. durch Erh¨ohung der Osmolarit¨at durch Zusatz entsprechender Salzl¨osungen verhindert werden.

3.2 Magnesium 57

3.2 Magnesium

3.2.1 Etablierung der Zellkulturbedingungen und Analysemethoden

Zur Untersuchung der Auswirkung von Magnesium auf lebende Zellen wurde ein Zellsystem mit humanen T-Lymphozyten (J3 – R7) etabliert. Jurkat-Zellen werden im Gegensatz zu den meisten anderen Zelllinien ohne Substratkon-takt kultiviert und sind daher f¨ur die Versuche mit Magnesium-Granulat in einer Zellsuspension geeignet. Des Weiteren reagieren Jurkat-Zellen auch unter nicht ganz optimalen Apoptosebedingungen mit dem programmierten Zelltod. Insbe-sondere sind Blutzellen f¨ur die Versuche besonders relevant, da sie auch bei der praktischen Anwendung des Wasserstrahl-Schneidens mit dem Abrasivmaterial in Kontakt kommen.

F¨ur Jurkat-Zellen wurde RPMI Medium mit 10 % FCS, 1 % Glutamin und 1 % Pe-nicillin/Streptomycin verwendet. Die Zellen wurden unter Standardbedingungen, bei einer Temperatur von 37➦C, 5 % CO2 in Kunststoffkulturschalen kultiviert.

Eine leichte Verklumpung der frei im Medium schwimmenden Zellen kann durch vorsichtige Resuspension mit der Pipette wieder gel¨ost werden. Je nach Zelldich-te wird nach 2 – 5 Tagen das Medium erneuert. Alle 2-4 Tage werden die Zellen umgesetzt. Dazu wird ein Teil der Zellsuspension (1 / 10) abgenommen und mit frischem Medium in eine neue Zellkulturflasche ¨uberf¨uhrt. Einfrierr¨ohrchen wer-den bei 37➦C aufgetaut und sofort in eine kleine Zellkulturflasche mit 5 ml sup-plementierten RPMI-Medium ¨uberf¨uhrt. F¨ur den Versuch wurden Jurkat-Zellen 5 min bei 1000 rpm zentrifugiert und das Medium dekantiert. Die Zellen wur-den dann mit 300µl Saccharosel¨osung bzw. mit 2 ml RPMI resuspendiert. Dem RPMI-Medium wurden in einer 12-Lochplatte jeweils 100 mg Magnesiumgranu-lat und die verschiedenen Magnesiumpl¨attchen zugegeben. Als Positivkontrolle wurde dem Medium 0,5µM Staurosporin zugegeben (vgl. 2.3.7, S. 44) und als Negativkontrolle wurden die Zellen nur mit RPMI-Medium inkubiert.

Nach den Inkubationszeiten wurde die Einwirkung der Saccharosel¨osung auf die Zellen durch Zugabe von 3 ml RPMI und damit die Normalisierung der

Osmo-3.2 Magnesium 58

larit¨at der L¨osung gestoppt. Nach Resuspension mit der Pipette setzte sich das Magnesiumgranulat schneller ab als die Zellen, so dass die Zellsuspension von den Magnesiumproben abpipettiert werden konnte. Von den Zellsuspensionen wurden jeweils 50µl abgenommen und in eine 96-Lochplatte ¨uberf¨uhrt. Die Zellsuspen-sionen wurden mit Hoechst und PJ gef¨arbt. Unter dem Fluoreszenzmikroskop wurden von den Zellen mit einer Digitalkamera Fotos gemacht und am Bildschirm der Anteil der apoptotischen bzw. toten Zellen an der Gesamtzahl der Zellen pro Bildausschnitt ausgez¨ahlt. Um die Resultate mit den Zucker-Versuchen verglei-chen zu k¨onnen, wurden Proben mit 1,55 %iger und 5,45 %iger Saccharosel¨osung inkubiert. Nach der Inkubationszeit wurden die Zellen gef¨arbt (vgl. 2.3.5, S. 43) und Fotos angefertigt, anhand derer der Anteil an apoptotischen und toten Zellen ausgez¨ahlt wurde. Um die Ergebnisse zu verifizieren, wurde eine Analyse mit dem FACS (vgl. 2.3.6, S. 43) durchgef¨uhrt.