Fibroblast growth factor

Die relative mRNA-Expression von FGF2 ist sowohl im Transplantat als auch im Sehnendefekt im Vergleich zum Kontrolltier gering. Ein Anstieg der relativen mRNA-Expression erfolgt im Transplantat 24 Wochen post operationem und im Sehnendefekt nach 12 Wochen unerwartet spät.

Für FGF2 wird eine positive Wirkung auf die Proliferation und Syntheseleistung von Fibroblasten beschrieben (LEROY et al. 1982, SCHMIDT et al. 1995, THOMOPOULOS et al. 2005). Zudem übt es eine mitogene Wirkung aus und spielt eine Rolle bei der Neovaskularisierung (CANALIS et al. 1991, PETERSEN et al.

2003a). In einer sequentiellen Untersuchung an einem Sehnendefekt an Ratten wurden für die frühe Heilungsphase sowohl eine Zunahme der Zellzahl als auch eine vermehrte Expression von Kollagen III nach Zugabe von FGF2 beschrieben (CHAN et al. 2000). Der in der Literatur erwähnte Einfluss von FGF2 auf die Neovaskularisierung kann in unserer Studie nicht bestätigt werden. Zu den frühen Zeitpunkten der Vaskularisierung, 3 und 6 Wochen post operationem, ist kein Anstieg der mRNA-Expression für FGF2 beobachtet worden. In einer Studie zur Sehnenheilung an Hunden ist FGF2 immunhistochemisch in Entzündungszellen nachgewiesen worden, in Fibroblasten fällt die Reaktion jedoch negativ aus

(TSUBONE et al. 2004). Die ansteigenden Werte von FGF2 im Transplantat 24 Wochen nach der Operation und im Sehnendefekt nach 12 Wochen lassen sich am ehesten als positiven Effekt auf die Syntheseleistung von Fibroblasten interpretieren.

In dem beobachteten Zeitraum von sechs Monaten kann histologisch eine ausgeprägte Neubildung und -organisation der extrazellulären Matrix beobachtet werden.

5.2.3 Platelet-derived growth factor

Die mRNA-Expression von PDGFB ist sowohl im Transplantat als auch im Sehnendefekt nach 3 und 6 Wochen erhöht. Im Sehnendefekt ist bereits 3 Wochen post operationem die maximale Expression zu verzeichnen, im Transplantat ist der Anstieg erst bei den Tieren der 6 Wochen Gruppe registrierbar. Die PDGFB Expression fällt somit in zeitlichen Zusammenhang mit der Neovaskularisierung.

KURODA et al. (2000) beschreiben eine immunhistochemische Reaktion mit PDGF genau in jenen Bereichen des Transplantates, in dem auch ein Einsprossen von Gefäßen zu beobachten ist. WEILER et al. (2004) bestätigen einen positiven Einfluss auf die Vaskularisierung. In diesem Stadium der Sehnenheilung und Ligamentisation ist die chemotaktische Wirkung von PDGF besonders bedeutsam. PDGF scheint im Gegensatz zu FGF2 den Beginn der Proliferation und den Umbau des Transplantates bzw. die Sehnendefektheilung entscheidend voran zu treiben. Ein stimulierender Einfluss auf die Fibroblastenproliferation wird ebenso beschrieben (SCHMIDT et al. 1995, THOMOPOULOS et al. 2005). Zu den späteren Zeitpunkten 12 und 24 Wochen nach der Operation ist die PDGFB mRNA-Expression in unserer Studie schließlich geringer ausgeprägt. Auch die intakte Sehne der kontralateralen Gliedmaße weist 3 und 6 Wochen post operationem eine höhere Expression als zu den späteren Zeitpunkten auf. Dies lässt auf einen gewissen systemischen Effekt von lokalen Defekten schließen, auf den auch LO et al. (2003) in ihrer Veröffentlichung hinweisen.

5.2.4 Transforming growth factor β

Analog zu den anderen Wachstumsfaktoren zeichnet sich in der mRNA-Expression von TGFB2 im Transplantat 6 Wochen post operationem ein Anstieg ab, im Sehnendefekt bereits nach 3 Wochen. Im Transplantat ist der Anstieg zwar nicht ganz einheitlich, jedoch ist ein ansteigender Trend bei den 6 und 12 Wochen Tieren zu erkennen. Im Sehnendefekt sind schon früher höhere Werte zu verzeichnen, aber auch hier wird die größte Expression 6 und 12 Wochen post operationem registriert.

Immunhistochemisch kommt es in den operierten Geweben zu einer stärkeren Reaktion im Vergleich zum intakten Gewebe. Im Sehnendefekt kann über den Zeitverlauf eine leicht abnehmende Tendenz festgestellt werden. Im Transplantat ist kein ähnlicher Trend festzustellen. Der Anstieg der mRNA-Expression im Sehnendefekt 3 Wochen postoperativ korreliert gut mit der immunhistochemischen Reaktion. Diese Korrelation kann für das Transplantat nicht so eindeutig gefunden werden.

Bei der Gewebeheilung spielt TGFB eine wichtige Rolle, indem er die Formation der Matrix beeinflusst (EDOM-VOVARD u. DUPREZ 2004, GAULDIE et al. 1999) und zu einer Transformation und Proliferation von Zellen führt (SPORN M.B. et al. 1987).

Sowohl in vivo als auch in vitro ist als Reaktion auf exogenes TGFB1 eine gesteigerte Produktion von Kollagen I und III durch Fibroblasten aus Bändern beobachtet worden (KIM et al. 2002). Im Transplantat (zu den Zeitpunkten 6 und 12 Wochen post operationem) sowie im Sehnendefekt (schon ab 3 Wochen post operationem) lässt sich histologisch die Deposition von extrazellulärer Matrix erkennen. In dieser Zeitspanne scheint TGFB2 diesen Prozess zu modulieren, da es über diesen relativ langen Zeitraum hoch exprimiert wird. In einer Studie zum Prozess der Knochendefektheilung wird ein konstantes Vorhandensein einer TGFB2 Expression innerhalb der beobachteten 10 Wochen beschrieben (SCHNEIDER HÄFLIGER 2002). Diese lang anhaltende Expression von TGFB2 kann somit auch für den Prozess der Sehnenheilung und Ligamentisation bestätigt werden.

In der unverletzten Sehne der kontralateralen Gliedmaße wird in Relation zur nicht operierten Sehne des Zeitpunkt 0 Tieres eine erhöhte Expression von TGFB2

beobachtet. Für TGFB1 wird beschrieben, dass es auch in umliegendem unverletztem Gewebe detektiert werden kann (KURODA et al. 2000). TGFB2 wird demgemäß ähnlich wie TGFB1 nach einer Verletzung nicht nur lokal im heilenden Gewebe exprimiert, sondern scheint einer systemischen Hochregulation zu unterliegen.

5.2.5 Vascular endothelial growth factor

Im Transplantat findet über den gesamten Zeitraum eine höhere Expression der mRNA von VEGF als im Sehnendefekt statt. In den Tieren der 6 Wochen Gruppe ist die Expression im Transplantat am stärksten. Immunhistochemisch findet sich korrelierend dazu eine Anfärbung 3 Wochen nach der Operation. Im Sehnendefekt ist über den gesamten Beobachtungszeitraum eine durchgehende immunhistochemische Darstellung zu verzeichnen.

VEGF spielt eine Rolle in der angiogenen Phase der Sehnenheilung (PETERSEN et al. 2003a), fördert die Hyperpermeabilität der Gefäße (HIPPENSTIEL et al. 1998) und in vitro kann eine Einwirkung auf Endothelzellen nachgewiesen werden (THOMOPOULOS et al. 2005). Es kann somit sein, dass im Sehnendefekt bereits vor der ersten Untersuchung eine hohe Expression stattgefunden hat. In einer Untersuchung zur Sehnendefektheilung an Hunden kann die höchste Expression der mRNA von VEGF 10 Tage nach der Operation festgestellt werden (BIDDER et al.

2000, BOYER et al. 2001). Im Transplantat wäre es möglich, dass sich Entscheidendes zwischen den Untersuchungszeiträumen von 3 und 6 Wochen abspielt.

Der Literatur ist zu entnehmen, dass in gesunden Sehnen keine immunhistochemische Anfärbung erfolgt (PETERSEN et al. 2003a). Auch unsere Ergebnisse liefern keine Anfärbung der gesunden Sehne, in dem verbleibenden intakten Teil der operierten Sehne sind jedoch positive Zellen zu finden. Dies macht deutlich, dass sich die Heilungsvorgänge nicht nur auf die Narbe beschränken, sondern auch das umliegende eigentlich gesunde Sehnengewebe mit einbeziehen.

5.2.6 Kollagen I

Im Transplantat ist die COL1A1 mRNA-Expression zunächst geringer als in der intakten Sehne. Im Transplantat der 12 Wochen Tiere kommt es zu einer erhöhten Expression, hier liegen die Werte über den Werten der intakten Sehne. Im Sehnendefekt ist die COL1A1 Expression von der 3 Wochen Gruppe bis zur 12 Wochen Gruppe stark erhöht, bei den 24 Wochen Tieren fällt die Expression etwas geringer als in der intakten Sehne aus. Nachdem die mRNA-Expression also in der 12 Wochen Gruppe am größten ist, kann es danach zu einer Neubildung von Kollagen I mit gleichzeitiger Ausrichtung der Fasern gekommen sein.

Im Sehnendefekt beginnt diese Reaktion schon früher und intensiver. Dies kann durch die stärkere und gerichtete mechanische Belastung der Achillessehne induziert sein. Eine direkte fördernde Auswirkung von mechanischer Belastung auf die COL1A1 Expression kann durch in vitro Versuche an Fibroblasten des VKB nachgewiesen werden (KIM et al. 2002). Die COL1A1 Expression kann aber auch in Bezug auf das Wachstum der Schafe interpretiert werden. So diskutieren BLAND u.

ASHHURST (1996), dass die Expression von Kollagen I in ihrem Kaninchenmodell zur Kniegelenksentwicklung auf das Wachstum zurück zu führen sei.

Die relative Kollagen I Expression ist im Sehnendefekt höher, als im Transplantat.

Eine mögliche Erklärung könnte auch in der Probennahme liegen, bei der unbewusst geringe Anteile der intakten Sehne beprobt wurden. Elektronenmikroskopisch konnte die Neusynthese von Kollagen III, nicht aber von Kollagen I beobachtet werden.

In wieweit sich der in vitro beschriebenen positive Effekt von FGF2 auf die COL1A1 mRNA-Expression (HANKEMEIER et al. 2005) in vivo auswirkt, ist schwierig zu beurteilen, ein direkter Zusammenhang ist nicht herzustellen. Ebenso fällt es schwer, den Einfluss von TGF-β oder PDGF auf die Kollagenproduktion, wie er in vitro beschrieben wurde (KIM et al. 2002, WANG et al. 2004), nachzuvollziehen.

5.2.7 Kollagen III

Mit der qRT-PCR kann eine vergleichsweise auffallend starke Hochregulierung der COL3A1 mRNA festgestellt werden. Im Transplantat ist dies ab 6 Wochen post operationem zu erkennen. Im Sehnendefekt ist COL3A1 bereits ab 3 Wochen post operationem verstärkt exprimiert. Bis zu 31fach ist die Expression höher als im nicht operierten ZP-0 Tier. Die Werte der intakten Sehne bleiben im Vergleich niedrig. Im Vergleich der untersuchten Zytokine, Matrix- und zytoskelettalen Proteine findet bei COL3A1 die mit Abstand stärkste Reaktion statt.

Es ist bekannt, dass nach Sehnenverletzungen die Expression von COL3A1 hoch reguliert wird (WILLIAMS et al. 1980). In der Sehne des M. flexor digitalis superficialis von Pferden wird eine Erhöhung des Kollagen III Gehaltes bereits nach 2 Wochen beschrieben (DAHLGREN et al. 2005a). Von den gleichen Autoren wird beschrieben, dass sich Kollagen III vom Paratenonium ausgehend ausbreitet.

Immunhistochemisch kann im Rahmen dieser vorliegenden Arbeit Kollagen III eindeutig nur in Peri- und Epitenonium nachgewiesen werden. Dabei ist ein polyklonaler anti-humaner Antikörper eingesetzt worden, dessen Kreuzreaktivität vom Hersteller beschrieben wurde. Die Reaktion erfolgt schwach und zum Teil im straffen Bindegewebe, weshalb eine Kreuzreaktion mit Kollagen I wahrscheinlicher ist. Elektronenmikroskopisch ist die Bildung von Fibrillen des Kollagen Typ III in allen Teilen der Narbe und des Transplantates vorherrschend. Diese Kollagen Typ III Fibrillen machen 24 Wochen post operationem sowohl im Transplantat als auch im Sehnendefekt einen überwiegenden Anteil aus. Zu den früheren Zeitpunkten sind elektronenmikroskopisch noch Fibrillen mit einem größeren Durchmesser zu finden, deren Anteil durch enzymatischen Abbau und einen Ersatz durch Kollagen Typ III weiter reduziert wird. Dieses Phänomen der hohen Expression von Kollagen Typ III wird nicht nur in der Sehnenheilung beobachtet, sondern auch wenn Sehnen transplantiert und in eine neue Umgebung gebracht werden (BLAND u. ASHHURST 1996). Der Kollagen III Gehalt soll nach 30 Wochen dem des gesunden VKB entsprechen (AMIEL et al. 1986).

In diversen Studien wird darauf hingewiesen, dass das nachgebildete Kollagen III auf Grund seines kleineren Fibrillendurchmessers keiner so großen Belastung stand hält wie Kollagen I (AMIEL et al. 1986, BOSCH u. KASPERCZYK 1992, DAHLGREN et al. 2005a, GOODSHIP et al. 1994). Es kann davon ausgegangen werden, dass auch in der vorliegenden Studie das Transplantat und die Sehne nicht wieder die Reißfestigkeit der entsprechenden gesunden Strukturen erlangen werden.

5.2.8 Alpha smooth muscle actin

In der qRT-PCR zeigt sich im Sehnendefekt schon nach 3 Wochen ein Anstieg der mRNA-Expression von ACTA2. Im Transplantat kommt es erst nach 6 bzw. 12 Wochen zu einem Anstieg. In der immunhistochemischen Färbung ist die positive Reaktion in den Tieren der 3 Wochen Gruppe sowohl im Transplantat als auch im Sehnendefekt am stärksten. Bis zum letzten Beobachtungszeitpunkt mit 24 Wochen nehmen die positiv gefärbten Zellen stetig ab. Diese Anfärbung lässt sich mit dem Ergebnis aus der qRT-PCR in Einklang bringen. In den angefärbten Zellen, den sogenannten Myofibroblasten, findet eine ACTA2 mRNA-Expression und in weiterer Folge auch die Translation zum Protein statt. SMA wird als charakteristisch für Myofibroblasten angesehen (MASUR et al. 1996, UNTERHAUSER 2004). Die Schwankungen in den Ergebnissen der qRT-PCR zu ACTA2 lassen sich durch die Tatsache erklären, dass in der glatten Muskulatur der Blutgefäße α-SMA immunhistochemisch nachgewiesen wird (MURRAY et al. 2004). Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass bei der Probennahme unterschiedlich viele Blutgefäße in den Gewebeproben vorhanden waren. Die Ergebnisse der Histomorphometrie könnten diese Ergebnisse und die mögliche Korrelation mit den Blutgefäßen erklären. So zeigt sich histologisch ein Vaskularisierung im Sehnendefekt nach 3 Wochen und im Transplantat nach 6 Wochen.

Elektronenmikroskopisch können die Resultate aus der Genexpressionsanalyse und Immunhistochemie bestätigt werden. Zu den erwähnten Zeitpunkten sind Aktinfilamente zu erkennen. Diese ermöglichen dem Ersatzgewebe der Zugkraft entgegen zu wirken. Der Raum der extrazellulären Matrix wird zunächst mit

Proteoglykanen aufgefüllt. Mit der fortschreitenden Synthese von Kollagenen und deren Einlagerung in die extrazelluläre Matrix kann die stabilisierende Funktion mehr und mehr von den Kollagenfasern übernommen werden. Diese richten sich in Zugrichtung aus und können nun der Zugkraft standhalten. Dadurch wird wiederum mit der Zeit immer weniger SMA benötigt und entsprechend auch geringer von den Zellen exprimiert. Seit der Entdeckung der Schlüsselrolle, die Myofibroblasten während der Gewebekontraktion bei der Wundheilung und bei Organfibrosen spielen (GABBIANI et al. 1972, SCHURCH et al. 1998), wird die Hypothese gestellt, dass diese Zellen die Fähigkeit haben, Zugkräfte auf die extrazelluläre Matrix auszuüben und damit das Gewebe zu kontrahieren (FARYNIARZ et al. 1996, GABBIANI 1999, SERINI u. GABBIANI 1999).

Ziel dieser Studie war es, durch histologische Untersuchungen sowie eine Genexpressionsanalyse den Prozess der Ligamentisation und die Sehnendefektheilung in einem Modell juveniler Schafe zu analysieren. Damit sollte das Fenster zwischen den bereits bestehenden Studien für fetale und adulte Individuen geschlossen werden. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass diese Heilungsprozesse bei juvenilen Tieren mit offener Epiphysenfuge im Vergleich zu adulten Individuen schneller ablaufen. Als Teil des Gesamtprojektes zum Kreuzbandersatz bei offenen Wachstumsfugen konnten mit dieser Arbeit grundlegende Erkenntnisse zur Ligamentisation und Sehnendefektheilung bei juvenilen Individuen gewonnen werden. Die Hypothese einer schnelleren Ligamentisation im Vergleich zu Studien am adulten Individuum konnte bestätigt werden. Nach Fusion dieser vorliegenden biologischen Daten mit den noch ausstehenden biomechanischen Ergebnissen und den Resultaten aus der Einheilung des Transplantates in den Knochentunnel wird die Gesamtstudie über den Kreuzbandersatz im juvenilen Individuum abgrundet werden. Auf dieser Grundlage könnte im Falle eines notwendigen Kreuzbandersatzes bei Patienten mit noch offenen Wachstumsfugen ein differenzierteres Nachbehandlungsschema erwogen werden.

6 Zusammenfassung

Friederike Fritz

Untersuchungen zum Prozess der Ligamentisation und der Sehnendefektheilung beim Ersatz des vorderen Kreuzbandes im juvenilen Schafmodell

Werden Sehnen als Bandersatz transplantiert, nehmen sie nach einer Umbauphase teilweise die Eigenschaften des ersetzten Bandes an. Die während diesem als Ligamentisation bezeichnetem Prozess stattfindenden grundlegenden Veränderungen sollten im Rahmen dieser Studie im Tiermodell durch histologische Untersuchungen sowie eine Genexpressionsanalyse untersucht werden. Ziel dieser Arbeit war es, den Prozess der Ligamentisation und Sehnendefektheilung im juvenilen Individuum darzustellen. Auf Grund der steigenden Inzidenz der kindlichen Kreuzbandrupturen wird eine Übertragung der Verfahren zum Ersatz des vorderen Kreuzbandes, wie sie bei Erwachsenen durchgeführt werden, auch für Kinder mit offenen Epiphysenfugen diskutiert. Daher wurde im Schafmodell bei 32 vier Monate alten Schwarzköpfigen Fleischschafen mit offenen Epiphysenfugen ein anatomischer Kreuzbandersatz vorgenommen. Nach einem Zeitraum von 3, 6, 12 und 24 Wochen post operationem wurden jeweils 8 Tiere euthanasiert, wovon jeweils 2 Tiere für die in dieser Studie beschriebenen Verlaufsuntersuchungen eingesetzt worden sind. Im Transplantat konnte histologisch derselbe Prozess der Ligamentisation, mit den Phasen Nekrose, Revitalisierung und Remodellierung, wie zuvor im adulten Individuum beobachtet werden. In der Sehnendefektheilung bestand durch die reparative Heilung ein klarer Unterschied zur regenerativen Heilung in fetalem Sehnengewebe. Im Vergleich zu Studien im adulten Tiermodell ging der Prozess der Ligamentisation insgesamt wesentlich schneller vonstatten. Durch qRT-PCR assays konnte eine Expression von relevanten Wachstumsfaktoren (BMP2, FGF2, PDGFB, TGFB2, VEGF), zentralen Matrixproteinen (COL1A1, COL3A1) und des zytoskelettalen Protein alpha smooth muscle actin (ACTA2) während der Ligamentisation im Transplantat sowie der Sehnendefektheilung nachgewiesen

werden. Dabei wurde insgesamt die stärkste Aktivität der Zellen durch die relativ erhöhte Expression der untersuchten Wachstumsfaktoren im Transplantat 6 Wochen und im Sehnendefekt 3 Wochen post operationem beobachtet. Während die ACTA2 Expression zu Beginn des Prozesses relativ am höchsten lag, konnte insbesondere eine besonders stark erhöhte COL3A1 Expression im Gegensatz zur relativ geringen Expressionssteigerung von COL1A1 über den gesamten Verlauf der Studie nachgewiesen werden. Die Hinweise der Expressionsanalyse konnten durch elektronenmikroskopische und immunhistochemische Untersuchungen teilweise bestätigt werden.

7 Summary

Friederike Fritz

Examination of the process of ligamentization and tendon defect healing after cranial cruciate ligament reconstruction in a juvenile sheep model.

Tendons that are transplanted as graft adopt partially the characteristics of ligaments after reconstruction. In this study the phases of conversion in the so called process of ligamentization have been examined in an animal model by an accompanying histological investigation and a gene expression study. The aim of this study was to describe the process of ligamentization and tendon defect healing in a juvenile individual. As the incidence of anterior cruciate ligament rupture is increasing in children, the reconstruction as used in adults is discussed as method for adolescent with open physis. In a sheep model with 32 blackheaded mutton, four month old with open physis, we reconstructed the cranial cruciate ligament in an anatomical manner.

After a period of 3, 6, 12 and 24 weeks after surgery 8 animals each were euthanised and 2 animals of each group were examined with the methods described within this study. Histologically the process of ligamentization in the graft could be seen in the same phases of necroses, revitalization and remodelling as reported for adult individuals. The tendon defect was healing reparatively, while foetal tendon tissue heals in a regenerative fashion. The hypothesis that the healing in juvenile sheep is progressed in comparison to an adult individual at a higher rate was supported. In a qRT-PCR based gene expression study expression of relevant growth factors (BMP2, FGF2, PDGFB, TGB2, VEGF), central matrix proteins (COL1A1, COL3A1), and the cytoskeleton protein alpha smooth muscle actin (ACTA2) was shown during ligamentization and tendon defect healing. Relative gene expression of the examined growth factors showed the highest activity of cells in the graft after 6 weeks and in the tendon defect 3 weeks after surgery. While the relative expression of ACTA2 did play a decisive role in the beginning of the process, COL3A1 has to be pointed out because of its very high relative expression, in particular in relation to a moderate

expression of COL1A1 during the whole study period. The results of the gene expression study could partially be confirmed by electron microscopy and immunohistochemistry.

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