ACTA2 mRNA-Expression

Wie in Abb. 4.19 gezeigt, ist eine leicht steigende Tendenz der relativen ACTA2 Expression im Transplantat von den Tieren 3 Wochen post operationem zu den Tieren 12 Wochen post operationem zu erkennen. Bereits im Tier 3/4 liegt eine ca.

1,4fach erhöhte Expression von ACTA2 vor. Auch bei dem Tier 6/2, den Tieren der 12 Wochen Gruppe, und dem Tier 24/2 liegen die Resultate mit 1,4-1,9fach über der gemessenen ACTA2 Expressionshöhe des ZP-0 Tieres. Bei diesen Tieren ist die ACTA2 Expression auch im Vergleich zur intakten Sehne erhöht.

Im Sehnendefekt steigen die Werte vom Tier 3/4 mit 1,6 bis auf eine 2,7fache Expression im Tier 6/1 in Relation zum ZP-0 Tier an. Bei den anderen Tieren liegen die Werte um 1 oder im Vergleich zum Kontrolltier nur bei 51% (Tier 12/1) bzw. 56%

(Tier 24/2) der Expression deutlich niedriger. Die Abb. 4.19 zeigt, dass die Expression im Sehnendefekt bei 6 von 8 Tieren 2 bis 3,4fach höher ist, als die mRNA-Expression der intakten Sehne. Im Sehnendefekt kann im Vergleich zum Transplantat bereits 3 Wochen nach der Operation eine verstärkte Expression von ACTA2 festgestellt werden.

0,47 1,41 1,06 1,51 0,25 0,36 1,07 0,40

1,44 0,09 0,65 1,71 1,90 1,90 1,46 0,13

1,63 2,21 2,78 0,95 0,51 0,91 0,56 0,87

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Abb. 4.19 ACTA2 mRNA-Expression in der intakten Sehne, Transplantat und Sehnendefekt relativ zur intakten Sehne des ZP-0 Tieres (2^-∆∆Ct=1).

5 Diskussion

Die komplexen biologischen Vorgänge der Ligamentisation des Transplantates und des Heilungsprozesses im Sehnendefekt sind histologisch und durch eine Genexpressionsanalyse untersucht worden. Ergänzend sind die Gewebe immunhistochemisch und elektronenmikroskopisch beurteilt worden.

Bedingt durch den Studienaufbau kann nur eine qualitative Auswertung erfolgen, für eine quantitative, statistische Auswertung ist die Gruppengröße mit jeweils zwei untersuchten Schafen pro Zeitfenster dagegen nicht ausreichend. In diesem Fall können somit ausschließlich Befunde diskutiert werden. Für eine Beurteilung grundlegender Zusammenhänge, wäre eine statistische Auswertung nötig, die auf einer Gruppenzahl von mindestens drei, besser sogar mehr als 6 Tieren beruht. Bei zwei Tieren pro Gruppe können die Beobachtungen sowohl auf individuellen Schwankungen als auch unterschiedlichen zellulären Aktivitätszuständen beruhen.

Das Schaf als bereits etabliertes Versuchstier für orthopädische Fragestellungen wird vergleichsweise seltener für Versuche eingesetzt als die Versuchstiere Ratte, Maus und Kaninchen. Entsprechend werden von Seiten der Industrie wenige spezifische Primärantikörper für die Immunhistochemie hergestellt. Es musste unter anderem auf anti-humane Antikörper (AK) und anti-bovine AK zurückgegriffen werden. Diese sind nur eingesetzt worden, wenn in der Literatur bereits eine Kreuzreaktion mit der Spezies Schaf beschrieben wurde und sich diese in den Vorversuchen bestätigt hatte. Als Positivkontrolle diente humanes Gewebe.

Bei der Probennahme wurde darauf geachtet, die Gewebeproben an genau definierten Lokalisationen zu entnehmen. Trotz dieser Sorgfalt kann nicht ausgeschlossen werden, dass sich in den Proben für die molekularbiologischen Untersuchungen unterschiedliche Gewebeanteile befunden haben. Bei der Isolierung von Probenmaterial aus Gewebestücken besteht im Gegensatz zu Zellkulturen die Möglichkeit, dass Zelldichte und Zelltypus der jeweils gewonnenen Gewebeareale

differieren. Dieser Umstand kann die individuellen Unterschiede in der Expressionsanalyse erklären. Bereits bei der Probennahme sind die Gewebestücke möglichst klein geschnitten worden, um bei der späteren Aufreinigung der RNA eine gute Homogenisierung des widerstandsfähigen Bindegewebes zu ermöglichen.

Insbesondere im mitunter sehr inhomogenen Transplantat und im Narbegewebe kommt hinzu, dass sich die Zellen in unterschiedlichen Aktivitätszuständen befanden und somit auch eine unterschiedliche Expression vorhanden war.

Bemerkenswert ist, dass zum Design der Primer und Sonden bei 6 von 9 Zielgenen auf originäre Schafsequenzen zurückgegriffen werden konnte. NCBI (National Center of Biotechnology Information) führt eine der wichtigsten Datenbanken für das Schaf- und Rindergenom. Wie den folgenden Zahlen zu entnehmen ist, liegen für das Schaf auffallend weniger Einträge vor als beispielsweise für das Rind. So befinden sich hier für das Schaf 11104 EST (expressed sequence tags) Einträge, für das Rind 1064300 Einträge. Zu mRNA-Sequenzen findet man für das Schaf 17601 und für das Rind 42601 Einträge und auch bei den Proteinsequenzen trifft man auf 3792 Einträge beim Schaf gegenüber 58321 Einträgen beim Rind. (Stand: 09.02.2006). Durch Sequenzierung und einen BLAST Abgleich konnte bestätigt werden, dass sich die ausgesuchten Rindersequenzen zum Design der Primer geeignet haben.

Durch die Genexpressionsanalyse sollte in der vorliegenden Studie die Expression der mRNA von definierten Wachstumsfaktoren, Matrixproteinen und zytoskelettalen Proteinen im zeitlichen Verlauf nach der Operation untersucht werden. Mit der quantitativen real-time PCR können kleinste Mengen von cDNA detektiert werden.

Das Prinzip beruht, wie bei einer Standard-PCR, auf der enzymatischen Vermehrung eines bestimmten DNA-Abschnittes durch ein Primerpaar. In dieser Studie wurden TaqMan® minor groove binder (MGB) Sonden zur möglichst exakten Detektion des PCR Erfolgs eingesetzt. Die TaqMan® MGB Sonde liegt zwischen zwei spezifischen Oligonucleotid-Primern. Am 5`-Ende befindet sich der Reporter-Fluoreszenzfarbstoff FAM, am 3`-Ende der Non-Fluorescent Quencher mit dem minor groove binder.

Dieser minor groove binder stabilisiert die letzten Basenpaare am 3`-Ende und

ermöglicht den Einsatz sehr kurzer Sonden. Durch die Verwendung dieses Systems erlangt man eine hohe Spezifität des detektierten Produkts. Die kurzen sequenzspezifischen TaqMan® MGB Sonden detektieren deutlich spezifischer, als das häufig eingesetzte SYBR-Green Verfahren, das auf einer unspezifischen Interkalierung des Fluoreszensfarbstoffes mit doppelsträngigen DNA-Molekülen basiert.

Für sämtliche in dieser Studie untersuchten Wachstumsfaktoren sowie für die Kollagene und ACTA2 ist der Nachweis einer mRNA-Expression am Probenmaterial gelungen. Erwartungsgemäß ist in allen untersuchten Gewebeproben das Kontrollgen GAPDH nachgewiesen worden. Dieses Kontrollgen wird in Expressionsstudien regelmäßig zur Normalisierung eingesetzt, da man bei diesem Gen davon ausgeht, dass es in allen Geweben in gleicher Höhe exprimiert wird (HOHENSTEIN et al. 2005, SVENSTRUP et al. 2005). Als Kontrollgene werden neben GAPDH auch 18S und ACTB eingesetzt. Jedoch zeigen Untersuchungen, dass bei verschiedenen Kontrollgenen Unterschiede in der Expression auftreten (DHEDA et al. 2004). Dies muss bei kritischer Betrachtung der unterschiedlichen Expressionsergebnisse mit berücksichtigt werden. Aufgrund der geschilderten Problematik war in einzelnen Proben der mRNA Gehalt selbst für GAPDH derart gering, dass erst verhältnismäßig spät im Prozess der PCR ein exponentieller Anstieg verzeichnet werden konnte. Entsprechend war bei einigen Proben zu wenig mRNA vorhanden, um verwertbare Ergebnisse zu erhalten. Dies war der Fall im Transplantat des Tieres 3/7, hier konnten wahrscheinlich daher keine Resultate für BMP2 und FGF2 gewonnen werden. Histologisch liegt 3 Wochen post operationem im Transplantat eine ausgedehnte Nekrose vor. Wurden die Proben eventuell genau aus diesem azellulären Bereich entnommen, erklärt sich der Umstand, dass keine mRNA-Expression gemessen werden konnte.