PCV 2-positiven Tiere
5.8 Erklärungsversuche für die unentdeckte Existenz von PCV 2 und das
Obwohl seit 1985 histopathologische Läsionen mit den Nachweis von PCV 2 korrelierten, ist das Virus in Deutschland weitere 13 Jahre unentdeckt geblieben. Abgesehen davon, dass mit Ausnahme einzelner Tiere die PMWS-typischen Läsionen nur gering- bis mittelgradig ausgeprägt waren, ist eine mögliche Erklärung für die unentdeckte Existenz des PCV 2, dass zum einen die Symptome bzw. Läsionen sehr unspezifisch sind und auch in heutigen PMWS-Fällen häufig Koinfektionen mit anderen viralen und bakteriellen Erregern nachgewiesen werden. Zu diesen Koerregern gehören das PRRS-Virus, porzine Influenza Virus, porzine Parvovirus, Mycoplasma hyopneumoniae sowie weitere bakterielle und virale Erreger (PALLARES et al., 2002; POGRANICHNIY et al., 2002; ALLAN und ELLIS, 2000). Der Nachweis eines dieser Erreger genügte um zumindest Teile des vorhandenen Krankheitsbildes erklären zu können. Zum anderen wurden Lymphknoten bei der Auswahl der histologisch zu untersuchenden Organe wenig bedacht, so dass die PMWS-typischen Befunde wie lymphatische Depletion, histiozytäre Infiltration und basophile zytoplasmatische Einschlusskörperchen lange Zeit nicht gefunden wurden.
Auffallend ist, dass PMWS außer in der vorliegenden Studie auch in Spanien, der Schweiz und in Großbritannien erstmals in den Jahren 1985/ 1986 gefunden wurde (GRIERSON et al., 2004; STAEBLER et al., 2004; RODRIGUEZ-ARRIOJA et al., 2003). Gemeinsam mit dem sprunghaften Anstieg der Anzahl PCV 2-positiver Tiere im Jahr 1985 in dieser Studie, könnte dies ein Hinweis darauf sein, dass in dieser Zeit Mutationen der Virussequenz des PCV 2 oder aber Veränderungen in der Schweinepopulation zum Beispiel bezüglich der
Haltungsbedingungen stattgefunden haben oder aber ein anderer neuer, das Immunsystem der Schweine stimulierender Krankheitserreger aufgetreten ist.
Die Tatsache, dass die beiden in dem jeweiligen Zeitraum bezüglich der Virusmenge herausragenden Schweine (S 1519/67 und S 2765/85), beide eine Koinfektion mit dem Erreger der Klassischen Schweinepest aufwiesen, kann als Indiz für die Bedeutung anderer Infektionserreger im Infektionsgeschehen von PCV 2 gesehen werden (ELLIS et al., 2004).
Damit erscheint die Theorie wahrscheinlich, dass ein neues Virus oder aber der gestiegene Infektionsdruck aufgrund wachsender Bestandsgrößen für das plötzliche Auftreten von PMWS verantwortlich ist, obwohl PCV 2 schon mehrere Jahrzehnte in der Schweinepopulation vorhanden war.
Da für die Studie lediglich Material bis frühestens 1961 zur Verfügung stand, der Nachweis von PCV 2 allerdings schon im Jahr 1962 gelang, liegt die Vermutung nahe, dass das Virus auch schon vor 1962 in der Schweinepopulation vorhanden war.
6 Zusammenfassung
Lars Krüger
Retrospektive Untersuchung auf das Vorliegen von porzinen Circovirus 2-Infektionen im Sektionsmaterial des Instituts für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover mittels der in situ-Hybridisierung
Ziel dieser Arbeit war es, festzustellen, ob und wann eine PCV 2-Infektion vor 1998, dem Jahr des erstmaligen Nachweises von PCV 2 in Deutschland, im Sektionsmaterial des Instituts für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover aufgetreten ist. Hierzu wurden Formalin-fixierte und Paraffin-eingebettete Gewebe von Schweinen aus dem Sektionsarchiv (1961-1998) mittels in situ-Hybridisierung mit einer PCV 2-spezifischen DNA-Sonde untersucht. Darüber hinaus sollte der PCV 2-Nachweis mit den pathologischen, insbesondere den histologischen Befunden korreliert werden. Des Weiteren wurden PCR, Immunhistologie und transmissionselektronenmikroskopische Untersuchungen durchgeführt, um die Ergebnisse zu bestätigen.
Mittels in situ-Hybridisierung konnte in Gewebeschnitten von 37 der 445 untersuchten Schweine PCV 2-DNA nachgewiesen werden. Es ergaben sich 0-53,3% positive Tiere pro untersuchtem Jahrgang. Dabei fällt der erste Nachweis auf das Jahr 1962 und stellt damit den frühesten Nachweis einer PCV 2-Infektion bei Schweinen weltweit dar. In den Jahren 1961-1984 lag die Infektionsrate bei 2,5% und war deutlich niedriger als in den Jahren 1985-1998, in denen sie 31% betrug. Virus-DNA konnte im Zeitraum von 1985-1998 häufig in lymphatischen Geweben und auch in anderen Organen gefunden werden. Im Zeitraum 1961-1984 war dies nur selten zu beobachten. Entsprechend konnte im Zeitraum von 1985-1998 auch eine größere Virusmenge in den Organen als im Zeitraum 1961-1984 dargestellt werden.
Bei neun, der in der in situ-Hybridisierung PCV 2-positiven Tieren aus den Jahren 1962-1985 wurde zur Bestätigung des Virusnachweises mit verschiedenen Primerpaaren eine PCR durchgeführt. Mit den Primern, die ein 481 bp bzw. 225 bp großes Fragment amplifizierten, konnten lediglich die in situ-Hybridisierungs-Ergebnisse von zwei Tieren aus den 80er Jahren bestätigt werden. Mittels einer TaqMan® PCR und der Immunhistologie konnte ebenfalls nur bei einem der PCV 2-positiven Tiere aus den 60er und 70er Jahren ein schwaches Signal beobachtet werden. Erst mit einem Primerpaar, das ein 66 bp großes Fragment vervielfältigte, konnten auch die verbliebenen PCV 2-positiven Ergebnisse aus den 60er und 70er Jahren bestätigt werden. Aufgrund der 100prozentigen Identität des Amplifikats dieses Primerpaares zwischen PCV 1 und PCV 2 konnte allerdings nicht anhand der Basensequenz, sondern ausschließlich über die spezifische Bindung des Primerpaares an PCV 2 der Beweis einer
PCV 2-Infektion erbracht werden. So konnte aus PCV 2-infizierten PK 15 Zellen ein Fragment entsprechender Größe amplifiziert werden, nicht aber aus PCV 1-infizierten Zellen.
Eine Infektion mit dem PCV 1 konnte mittels in situ-Hybridisierung bei keinem der 37 Tiere nachgewiesen werden. Eine Infektion mit dem PCV 1 konnte mittels in situ-Hybridisierung bei keinem der 37 Tiere nachgewiesen werden.Bei zwei der 37 PCV 2-positiven Tieren lag eine Koinfektion mit dem Virus der Klassischen Schweinepest vor. Dabei ist zu beachten, dass diese beiden Tiere diejenigen in ihrem Zeitraum mit der größten Virusmenge sind.
Zusatzuntersuchungen auf andere pathogene porzine Viren wie das porzine respiratorische Coronavirus, den Erreger der transmissiblen Gastroenteritis, das suide Herpesvirus 1, und den Erreger der Klassischen Schweinepest verliefen bei allen 37 Tieren, soweit durchgeführt mit negativem Ergebnis.
Die unterschiedliche Prävalenz der PCV 2-Infektionen in den Zeiträumen 1961-1984 und 1985-1998 spiegelte sich auch in der Pathologie wider. Während im ersten Zeitraum außer interstitiellen Nephritiden und Hepatitiden keine weiteren mit einer PCV 2-Infektion assoziierten histologischen Läsionen zu finden waren, wurden im Zeitraum von 1985-1998 in vielen der PCV 2-positiven Tieren lichtmikroskopische Alterationen wie lymphatische Depletion, zytoplasmatische basophile Einschlusskörperchen, mehrkernige Riesenzellen, interstitielle Infiltration mit Histiozyten, interstitielle Pneumonien, hämorrhagische Dermatitis und exsudativ-nekrotisierende Glomerulonephritis beobachtet. Bei vier der 37 PCV 2-positiven Tieren würde aus heutiger Sicht aufgrund des Nachweises von PCV 2-DNA und den charakteristischen Läsionen in den lymphatischen Organen die Diagnose “post weaning multisystemic wasting syndrome“ (PMWS) gestellt werden. Zwei dieser Tiere stammen aus dem Jahr 1998, eins aus dem Jahr 1996 und eins aus dem Jahr 1985. Dieses Tier stellt damit den weltweit frühesten beschriebenen Fall von PMWS dar. Bei drei der PCV 2-positiven Tieren kann aufgrund der makroskopischen und histologischen Läsionen die Diagnose porzines Dermatitis Nephropathiesyndrom (PDNS) gestellt werden. Zwei dieser Tiere stammen aus dem Jahr 1998 und eins aus dem Jahr 1985. Dieses Tier stellt damit den frühesten dokumentierten PCV 2-assoziierten Fall von PDNS dar.
Festzuhalten ist, dass in dem Zeitraum von 1961-1984 zwar Infektionen mit dem PCV 2 nachzuweisen sind, diese aber nicht mit einem spezifischen klinischen Bild bzw. mit charakteristischen histologischen Läsionen assoziiert sind. Seit dem Jahr 1985 konnten vereinzelt Fälle von PMWS und PDNS im Sektionsarchiv dargestellt werden, es kamen aber auch weiterhin zahlreiche PCV 2-Infektionen ohne PMWS-typische histologische Befunde vor. Ob der Virusnachweis in diesen Tieren eine Bedeutung hat oder es sich um lediglich um
subklinische PCV 2-Infektionen handelt, muss in weiteren Studien geklärt werden. Da für die Studie lediglich Material bis frühestens 1961 zur Verfügung stand, der Nachweis von PCV 2 allerdings schon im Jahr 1962 gelang, liegt die Vermutung nahe, dass das Virus auch schon vor 1962 in der Schweinepopulation vorhanden war.
7 Summary
Lars Krüger
Retrospective study on porcine circovirus type 2 infection in pigs from the Institute of Pathology of the University of Veterinary Medicine Hannover by in situ-hybridization
The aim of this study was to determine, if and in which year PCV 2-infections occurred in tissues of pigs that were investigated in prior to 1998, when PCV 2 was detected in Germany for the first time. Therefore, formalin-fixed, paraffin-embedded tissue samples of 445 pigs (1961-1998) were investigated by in situ-hybridization (ISH) using a PCV 2-specific probe.
Histopathological lesions were compared to in situ-hybridization results to demonstrate possible correlations. To confirm the in situ-hybridization results, polymerase chain reaction (PCR), immunohistochemistry and electron microscopy were performed on selected tissue samples.
PCV 2-DNA was demonstrated in 37 out of 445 investigated pigs by in situ-hybridization, the prevalence of PCV 2-infected pigs ranged from 0% to 53.3% per examined year. The earliest finding in the present study was in 1962, which at this point represents the earliest proof of a PCV 2-infection in pigs worldwide. The infection rate of 2.5% in the years 1961-1984 was considerably lower compared to 31% in the years 1998. During the period of 1985-1998, in addition to lymphatic tissues, viral DNA was also demonstrated more frequently in other organs, which was rarely the case between 1961 and 1984. Accordingly, the virus load was much higher in the time period 1985-1998 compared to 1961-1984. Nine PCV 2-positive animals from the 1960’s, 1970’s and 1980’s a PCR with different primers was performed to confirm the results of the in situ-hybridization.
Positive in-situ-hybridization results in animals from the 1980’s could be confirmed by PCR only in two cases using primers that amplified a 481 bp and 225 bp fragment, respectively. In in situ-hybridization positive pigs from the 1960’s and 1970’s the results could be confirmed in one animal using TaqMan® PCR and immunohistochemistry. Applying a primer pair, which amplified a 66 bp fragment, PCV 2-infection could be verified in the remaining in situ-hybridization positive pigs of the 1960’s and 1970’s. Since the 66 bp-amplicon showed a 100% identity between PCV 1 and 2, a PCV 2-infection could not be proven via nucleotide sequencing only but via specific binding of the used primers for PCV 2. While a specific fragment was amplified from PCV 2 infected PK 15 cells, there was no success in amplifying it from PCV 1 infected PK 15 cells.
PCV 1 could not be determined by in-situ-hybridization in any of the 37 PCV 2-positive pigs.Two of the in situ-hybridization positive animals revealed a co-infection with the virus of the classical swine fever, which, interestingly, also were the animals with the highest virus load in their time period. No other viral agent like transmissible gastroenteritis virus, suid herpesvirus 1, porcine respiratory coronavirus or classical swine fever virus could be detected in any of the in situ-hybridization positive animals. In the two time periods 1961-1984 and 1985-1998, pathological findings reflected also the different prevalence of PCV 2 infections.
In the first time period only lesions such as interstitial hepatitis and nephritis were found in in situ-hybridization positive animals and no other PCV 2 characteristic lesions. In contrast lymphatic depletion, granulomatous inflammation, cytoplasmic inclusion bodies, multinucleate giant cells, interstitial pneumonia, hemorrhagic dermatitis and exsudativ glomerulonephritis were observed between 1985 and 1998. Four of the 37 PCV 2 positive animals would nowadays be diagnosed as suffering from postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS). Two of those are from 1998, one from 1996 and the first from 1985, the latter represents the earliest documented case of PMWS worldwide. Three of the 37 animals showed macroscopical and histological lesions resembling porcine dermatitis nephropathy syndrome (PDNS). Two of them were from 1998 and one from 1985, which is the earliest documented PCV 2-associated case of PDNS.
In summary, in the time period 1961-1984 infection with PCV 2 was demonstrated. However no correlation to pathological findings was observed. Between 1985 and 1998, cases of PMWS and PDNS were occasionally found, but most of the PCV 2 infections were not associated with PMWS typical or other characteristic histological lesions. Whether detection of PCV 2 in these animals has a relevance or if it is just a subclinical infection, needs to be investigated in future studies. Since tissue samples from years earlier than 1961 were not available and the first PCV 2-infection was demonstrated in 1962, it seems reasonable to assume that PCV 2 was already present prior to 1961 in the pig population.
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