DNA-Degradierung

Die Tatsache, dass aus den Jahren 2004 (S 998/04) und 1985 (S 2765/85) ein 481 bp großes Fragment, 1985 aus nur noch einem weiteren Tier (S 2714/85) ein 225 bp großes Fragment aber 1962 -1973 nur noch 66 bp große Fragmente des PCV 2-Genoms amplifiziert werden konnten, lässt darauf schließen, dass eine Degradierung der Virus-DNA vorlag. Die Degradierung der DNA steigt mit der Lagerdauer des Paraffin-eingebetteten Gewebes (LISOWSKI et al., 2001; COOMBS et al., 1999). Die Degradierung von DNA Formalin-fixierten und Paraffin-eingebetteten Gewebes wird auf den quervernetzenden Effekt des Formalin zurückgeführt, der zu Brüchen des DNA-Strangs führt (LEHMANN und KREIPE, 2001). Dabei hat sowohl die Art und Konzentration des Fixationsmediums als auch die Dauer und Temperatur der Fixation Einfluss auf die Konservierung der DNA (SRINIVASAN et al., 2002; GOELZ et al., 1985; HOPWOOD, 1975). Eigene Untersuchungen belegen, dass schon die um zwei Tage verlängerte Fixationsdauer signifikant den Virus-DNA-Nachweis mittels ISH beeinträchtigt. Ein sogenannter „Alters-Effekt“ wurde auch in einer retrospektiven Studie zum Nachweis von PCV 2 aufgezeigt (GRIERSON et al., 2004). Um die DNA-Extraktion zu überprüfen und auszuschließen, dass keine PCR-Inhibitoren vorliegen, wurde TNFα des Schweinegenoms amplifiziert. Während in den 80er und 90er Jahren aus mehr als 90% der Gewebe ein Fragment amplifiziert werden konnte, waren es in den 70er Jahren nur noch 67%.

Allerdings wurde aus Geweben, aus denen keine Wirts-DNA amplifizierbar war trotzdem PCV 2-DNA isoliert. Das bedeutet, dass entweder die Kopienzahl des PCV 2 sehr groß war oder aber die Virus-DNA weniger anfällig für Degradierungen durch das Fixationsmedium ist als das Wirtsgenom (GRIERSON et al., 2004). Trotz einer vermeintlich hohen Tenazität des Virus, war dieser „Alterseffekt“ auch bei dem PCR-Nachweis von PCV 2 zu erkennen (GRIERSON et al., 2004). Während mittels der TaqMan^® PCR in 21 Fällen aus den 70er, 80er und 90er Jahren ein 160 bp großes PCV 2-Fragment amplifiziert wurde, konnte ein 246 bp großes Amplifikat nur in 5 der 21 Fälle und ein 501 bp großes Fragment nur noch in 3 der 21 Fälle vervielfältigt werden (GRIERSON et al., 2004). Dabei konnten auch in diesem Fall in den 70er Jahren nur kürzere Fragmente, in den 80er und 90er Jahren hingegen auch das längere 501 bp große Fragment amplifiziert werden (GRIERSON et al., 2004).

Als Fixationsmedium von Geweben, die vor mehr als 20 Jahren fixiert worden waren, wurde vor allem ungepuffertes Formalin verwendet (BONIN et al., 2003). Ungepuffertes Formalin oxidiert zu Ameisensäure. Eine saure Umgebung ist einer der Hauptgründe für die DNA-Degradierung. Während die durchschnittliche Fragmentlänge aus Paraffin-eingebetteten Geweben extrahierter DNA zwischen 300 und 400 bp liegt (LEHMANN und KREIPE, 2001), konnten aus Geweben, die in ungepuffertem Formalin fixiert wurden, keine Fragmente, die länger als 90 bp sind, amplifiziert werden (BONIN et al., 2003). Andere Studien belegen, dass aus Geweben, die in ungepuffertem Formalin fixiert wurden die DNA-Ausbeute 50-fach geringer ausfiel als in gepuffertem Formalin fixierten Geweben (ZSIKLA et al., 2004).In einer anderen Studie konnten noch aus 70 Tage in ungepuffertem Formalin gelagertem Gewebe Fragmente von mehr als 500 bp amplifiziert werden (WIEGAND et al., 1996).

Die Verwendung von ungepuffertem Formalin könnte die kurzen noch amplifizierbaren Fragmente dieser Studie erklären. Allerdings gibt es keine Angaben zu den in den 60er und 70er Jahren im Institut für Pathologie verwendeten Fixationsmedien.

Die Tatsache, dass die ISH mit der in dieser Untersuchung verwendeten 40 bp langen Oligonukleotidsonde entgegen den Ergebnissen anderer Studien (CALSAMIGLIA et al., 2002b; QUINTANA et al., 2001) eine höhere Sensitivität hat als die PCR mit den 225 bp und dem 481 bp Primerpaaren, ist auch durch die starke Degradierung der Virus-DNA zu erklären.

In diesen Studien wurde die Sensitivität der ISH mit einer 40 bp Oligonukleotidsonde mit der Sensitivität einer PCR mit einem 404 bp großen Amplikon verglichen. Dabei zeigte sich, dass die PCR eine größere Sensitivität besaß als die ISH, diese allerdings besser mit den histologischen Veränderungen korrelierte (CALSAMIGLIA et al., 2002b). Im Gegensatz zu der vorliegenden retrospektiven Arbeit stammten die ältesten Gewebe aus dem Jahr 1997.

Das Ausmaß der Degradierung der Virus-DNA ist abhängig von der Gewebeart. In Weichteilgeweben wie Leber und Gehirn schreitet die Degradierung wesentlich schneller fort als z.B. in Knochengewebe (WIEGAND et al., 1996). Ein Vorliegen falsch-negativer ISH-Ergebnisse kann aufgrund der möglichen DNA-Degradierung nicht ausgeschlossen werden, so dass der tatsächliche Anteil PCV 2-positiver Tiere, entsprechend dem anderer Studien (GRIERSON et al., 2004; WALKER et al., 2000), auch in den 60er und 70er Jahren höher liegen könnte. Während in Großbritannien mittels TaqMan^® PCR in acht von 25 (32%) untersuchten Geweben PCV 2-DNA nachgewiesen werden konnte (GRIERSON et al., 2004), zeigten 1973 in Nordirland 56 von 80 (69,1%) der mittels ELISA untersuchten Seren von Schweinen PCV 2-spezifische Antikörper (WALKER et al., 2000). Serologische Untersuchung an Schlachtschweinen in Nord- und Ostdeutschland von 1979-1982 ergaben

eine Prävalenz zwischen 77 und 95% für PCV-Antikörper unbekannten Typs (TISCHER et al., 1986).

5.3 Immunhistologie

Ein Nachweis von PCV 2-Antigen konnte in den Geweben der ISH-positiven Tiere aus den Jahren 1962-1984, mit Ausnahme einzelner positiver Zellen im Lymphknoten des Tieres S 1519/67 nicht erbracht werden. Vermutlich liegt auch hier eine Degradierung bzw.

Maskierung der Epitope durch eine formalinbedingte Quervernetzung der Proteine vor.

Zudem ist die Beeinträchtigung der Sensitivität des Virusnachweises durch die Formalin-bedingte Quervernetzung für die Immunhistologie möglicherweise ausgeprägter als für die in situ-Hybridisierung (KIM und CHAE, 2001). Die Verteilung und Intensität der immunhistologischen Signale der PCV 2-positiven Tiere aus dem Jahr 1985 entsprechen den Signalen der ISH.

5.4 Pathologie

Ein möglicher Grund warum PCV 2 über Jahrzehnte unentdeckt blieb, ist, dass Infektionen mit dem PCV 2 zwischen 1961 und 1984 nur sporadisch auftraten, so konnte nur in 9 der 24 in diesem Zeitraum untersuchten jährlichen Stichproben PCV 2-DNA nachgewiesen werden.

6,7 bis 11,7% der Schweine der jährlichen Stichprobe waren in diesem Zeitraum positiv für PCV 2. Außerdem zeigten die Schweine, in denen PCV 2 zwischen 1962 und 1984 nachgewiesen wurde, kein einheitliches Krankheitsbild. Die Erkrankungen der PCV 2-positiven Tiere entsprachen dem Spektrum der Schweinekrankheiten und denen, die auch bei PCV 2-negativen Tieren zu finden waren. Hierzu gehören die katarrhalisch-eitrige Bronchopneumonie, interstitielle Hepatitis, Enteritis, Lymphadenitis purulenta und andere.

Ausgeprägte mit einer PCV 2-Infektion assoziierte histologische Läsionen wie basophile zytoplasmatische Einschlusskörperchen, lymphatische Depletion, Synzytien, histiozytäre Infiltration, interstitielle Pneumonie, exsudativ-nekrotisierende Glomerulonephritis, PNP lagen bei den PCV 2-positiven Tieren zwischen 1962 und 1984 nicht vor. Die einzigen PCV 2-assoziierten histopathologischen Läsionen, die bei den PCV 2-positiven Tieren der Jahre 1962 - 1984 gefunden wurden sind interstitielle Hepatitiden und Nephritiden bei sieben und drei der PCV positiven Tiere. Diese wurden in dieser Studie signifikant häufiger bei PCV 2-positiven Tieren als bei PCV 2-negativen Tieren beobachtet. Weitere Studien dieser Art sind nicht bekannt.

Mit Ausnahme der pathognomonischen basophilen zytoplasmatischen Einschlusskörperchen, werden die anderen charakteristischen mit PCV 2-Infektionen assoziierten histologischen Veränderungen auch im Zusammenhang mit anderen bakteriellen und viralen Erkrankungen beobachtet. Jede dieser Läsionen kann einzeln auftreten und ganz unterschiedliche Ursachen haben. Bei einer Infektion mit dem Virus der Klassischen Schweinepest kann zum Beispiel neben einer generalisierten Lymphknotenschwellung mitunter auch eine lymphatische Depletion nachgewiesen werden (SANCHEZ-CORDON et al., 2003; NARITA et al., 2000).

Mehrkernige Riesenzellen im Lymphknoten können auch im Zusammenhang mit Mykobakterien- und PRRSV-Infektionen auftreten (ROSSOW, 1998).

Interstitielle Pneumonien treten auch bei verschiedenen anderen bakteriellen und viralen Erkrankungen auf, zum Beispiel bei Infektionen mit dem porzinen Influenza Virus, dem PRRS-Virus, dem porzinen respiratorischen Coronavirus, dem porzinen Zytomegalievirus, dem porzinen Herpesvirus Typ 1 und bei Infektionen mit Mycoplasma hyorhinis und M. hyopneumoniae. Eine interstitielle Hepatitis kann auch bei Infektionen mit dem Hepatitis E-Virus, dem Adenovirus und dem PRRS-Virus (ROSSOW, 1998) nachgewiesen werden. Die interstitielle Nephritis ist eine häufig beobachtete Läsion, deren Ursache häufig nicht abzuklären ist. Außer bei Infektionen mit dem PCV 2 werden interstitielle Nephritiden auch bei Infektionen mit dem Adenovirus und dem PRRS-Virus (ROSSOW, 1998) beobachtet.

Die erwähnten Veränderungen sind nicht in 100% der mit PCV 2 infizierten Tiere zu beobachten, sondern treten in unterschiedlicher, abgestufter Häufigkeit auf (SEGALES und DOMINGO, 2002). Das bedeutet, dass trotz Fehlens einiger charakteristischer Läsionen eine PCV 2-Infektion vorliegen kann. Zudem variiert der Grad der Veränderungen im Lymphknoten nicht nur zwischen den einzelnen PCV 2-Infektionen unterschiedlicher Tiere, sondern auch innerhalb der Lymphknoten eines Tieres (ROVIRA et al., 2002; ALLAN et al., 2000b; ROSELL et al., 1999). Eine größere Virusmenge und ausgeprägtere Läsionen werden in den Mesenteriallymphknoten und Inguinallymphknoten festgestellt (SEGALES et al., 2000; ROSELL et al., 1999). Die in der in situ-Hybridisierung untersuchten Lymphknoten konnten nicht einer bestimmten Körperregion zugeordnet werden. Folglich ist nicht auszuschließen, dass die Läsionen und die Virusmenge in anderen nicht untersuchten Lymphknoten des Tieres stärker ausgeprägt sein können.

Nachdem in den Jahren 1983 und 1984 keines der untersuchten Tiere positive Signale zeigte, stieg deren Anteil 1985 auf 53,3% (8/15) an. Zeitgleich mit diesem Anstieg treten auch die

ersten charakteristischen mit einer PCV 2-Infektion assoziierten histopathologischen Läsionen in den positiven Tieren auf.

Insgesamt wurde im Zeitraum 1985 bis 1998 in 4 der 8 (50%) positiven Lymphknoten eine lymphatische Depletion und in je einem Lymphknoten basophile zytoplasmatische Einschlusskörperchen (12,5%) bzw. mehrkernige Riesenzellen (12,5%) festgestellt. Eine interstitielle Infiltration mit Histiozyten (37,5%) sowie mit eosinophile Granulozyten (37,5%) war in jeweils drei Lymphknoten zu sehen. In 14 der positiven Tier konnte eine interstitielle Pneumonie (60,9%) unterschiedlichen Grades nachgewiesen werden, in einem Fall eine proliferativ nekrotisierende Pneumonie (4,35%). Neun Tiere zeigten je eine interstitielle Nephritis (81,8%) bzw. interstitielle Hepatitis (90%). In drei der positiven Tiere war eine exsudativ nekrotisierende Glomerulonephritis (27,3%) nachzuweisen. Ein signifikanter Unterschied zu PCV 2-negativen Tieren konnte allerdings nur für die interstitielle Pneumonie, die interstitielle Hepatitis und Nephritis sowie für die exsudativ-nekrotisierende Glomerulonephritis dargestellt werden. In einer Studie aus Spanien in der 455 Schweine mit PMWS histopathologisch untersucht wurden lag die prozentuale Häufigkeit der lymphatischen Depletion (89%), der interstitiellen histiozytären Infiltration (78%), der zytoplasmatischen Einschlusskörperchen (32%), der mehrkernigen Riesenzellen (29%) sowie der interstitiellen Pneumonie (78%) deutlich höher als in den eigenen Untersuchungen (SEGALES und DOMINGO, 2002). Der Prozentsatz an proliferativ nekrotisierenden Pneumonien (6%) war annähernd gleich. Interstitielle Nephritiden (39%) und interstitielle Hepatitiden (44%) konnten in der eigenen Studie häufiger in PCV 2-infizierten Schweinen nachgewiesen werden (SEGALES und DOMINGO, 2002). Es ist nicht bekannt mit welcher Methode PCV 2 in der Studie aus Spanien nachgewiesen worden ist und welches die Selektionskriterien für die 455 untersuchten Schweine waren. Die Ausprägung der histopathologischen Befunde und die Anzahl der betroffenen Organe ist abhängig vom Infektionsstadium in dem sich das Tier zum Zeitpunkt des Todes befand (CHIANINI et al., 2003; ROVIRA et al., 2002). Folglich kann eine unterschiedliche Sensitivität des PCV 2-Nachweises zu einer verschobenen Häufigkeit der histologischen Läsionen führen.

Eine exakte Definition bei welchen histologischen Befunden PMWS vorliegt, ist mit Ausnahme des Nachweises von basophilen zytoplasmatischen Einschlusskörperchen, nicht vorhanden. Das unterstreicht die Bedeutung der gleichzeitigen Beurteilung des klinischen Bildes, der histologischen Läsionen, der Virusmenge und -verteilung bei der Diagnosestellung PMWS (QUINTANA et al., 2001; SORDEN, 2000).