Diagnostische Methoden und deren Einsatzmöglichkeiten in

Rinderbeständen muss, hinsichtlich ihrer Aussagekraft, über eine hohe Sicherheit verfügen.

Die angewendeten Verfahren sollten aber auch möglichst frühzeitig infizierte Tiere, am besten vor Ausscheidung des Erregers, erkennen. Darüberhinaus ist der zu erwartende Kostenfaktor zu berücksichtigen. Der Einsatz von Diagnostika, die alleine oder in Kombination eine Spezifität und Sensitivität von nahezu 100 % erreichen, sind optimal

Testverfahrens und gibt die sogenannte „Treffsicherheit“ an, d.h. der Anteil der Test negativen Tiere, die tatsächlich nicht infiziert (also gesund) sind. Die Sensitivität gibt die Empfindlichkeit des Meßverfahrens an, d.h. die Wahrscheinlichkeit, dass ein infiziertes Tier als erkrankt erkannt wird (KREIENBROCK und SCHACH 1997). Bei einer hohen Sensitivität eines Testverfahrens erwartet man, dass Tiere schon im subklinischen Stadium erkannt werden.

2.6.1.1 Direkte Nachweismethoden

Im Rahmen von Sanierungsverfahren werden überwiegend der direkte mikroskopische Nachweis und/oder die kulturelle Anzüchtung von M. paratuberculosis aus Kot- oder Organmaterial angewendet. Vor- und Nachteile dieser Methodiken lassen sich wie folgt beschreiben. Der direkte mikroskopische Nachweis säurefester Stäbchenbakterien nach Ziehl-Neelsen-Färbung ist eine technisch einfache und kostengünstige Methode. Die angefärbten Bakterien werden in Form typischer Nesterbildung nachgewiesen (BENEDICTUS et al.

1987). Es werden in der Regel nur Tiere, die den Erreger stark ausscheiden, nicht aber subklinisch infizierte Tiere erkannt (MERKAL et al. 1968). Auf Grund der mangelnden Sensitivität ist der Einsatz dieser Methode nur zur schnellen Diagnosebestätigung bei klinisch an Paratuberkulose erkrankten Tieren einsetzbar. Der kulturelle Nachweis des Erregers ist nach MERKAL (1973) die beste Methode für die Durchführung eines Sanierungsverfahren, da sie nach Meinung des Autors im positiven Fall hoch spezifisch ist. Die Anzüchtung auf komplexen Nährböden ist aber kosten- und zeitintensiv. Die bakterielle und/oder mykologische Kontamination der Probe führt häufig zu Problemen bei der Auswertung der Kulturen (STABEL 1997). Daher muss das zu untersuchende Material zunächst mit einem Dekontaminationsmittel zur Hemmung unerwünschter Begleitkeime und Pilze vorbehandelt werden. Es ist darauf zu achten, dass das Wachstum von M. paratuberculosis durch die Vorbehandlung nicht geschädigt wird. Als Dekontaminationsmittel werden z.B. Salzsäure (15%), Oxalsäure (3-5%), Natronlauge oder Hexadecylpyridiniumchlorid (HPC) eingesetzt (CHIODINI et al. 1984). Als Nährmedien werden hauptsächlich Herold`s-Egg-Yolk-Nährmedien oder Löwenstein-Jensen-Herold`s-Egg-Yolk-Nährmedien mit Zusatz von Mycobactin verwendet (MERKAL et al. 1987). Die Identifizierung des Erregers erfolgt nach 8 – 12 Wochen über das langsame Wachstum, die mikroskopische Phänotypisierung und der Wachstumsabhängigkeit

von Mycobactin. Zur Kontrolle wird das zu untersuchende Material zusätzlich auf Nährboden ohne Mycobactin kultiviert (COLLINS 1996). Diese diagnostische Methode hat eine Spezifität von annähernd 100 %. Jedoch ist der Nachweis passagerer, nicht infizierter Ausscheider bei hoher Belastung der Umwelt mit dem Bakterium als falsch positiver Nachweis möglich.

Die Sensitivität der kulturellen Methode ist gering, da nur Tiere erkannt werden, die zum Zeitpunkt der Probenentnahme den Erreger ausscheiden. WHIPPLE (1991) schätzt die Sensitivität auf 40 – 60 %, SOCKETT et al. (1992) geben 40 – 50 % an. Nach HIETALA (1992) liegt die Sensitivität der kulturellen Nachweismethodik bei 60 – 90 %, wenn das zu untersuchende Tier klinisch erkrankt ist. In einer Vergleichsuntersuchung von MEYER ZU VILSENDORF (1995) gibt der Autor die Sensitivität der kulturellen Untersuchung von Kotproben im Vergleich zur kulturellen Untersuchung des Ileocaecallymphknotens mit 33 % an. Nach COLLINS (1996) kann die kulturelle Untersuchung durch Einsatz des Bactec -Systems (Becton Dickinson Laboratories, Inc., Sparks, MD) optimiert werden. Diese Methode basiert auf der Detektion von Radioisotopen. Ergebnisse stehen schon nach 7 – 12 Wochen zur Verfügung und der Nachweis von M. paratuberculosis ist auch bei Tieren mit geringer Ausscheidung möglich. Das System ist kostenintensiver als die herkömmliche kulturelle Anzüchtung. Ein weiterer Nachteil ist der Umgang mit radioaktivem Material.

Eine Steigerung der Sensitivität durch zusätzliche Hochgeschwindigkeitszentrifugation nach Sedimentation bei der Bearbeitung der Kotproben weisen KIM et al. (1989) und KALIS et al.

(1999) nach.

Der positive Nachweis der kulturellen Untersuchung von Kotproben wird als Goldstandard bezeichnet (HIETALA 1992; RIDGE und MORGAN 1991; WHITLOCK 1991). Der Goldstandard ist die Methode, die ein Tier als sicher infiziert erkennt. Da auf Grund der langen Inkubationszeit und der intermittierenden Erregerausscheidung häufig falsch negative Ergebnisse in der Untersuchung der Kotproben zu erwarten sind, gibt der kulturelle Nachweis des Erregers im Ileocaecallymphknoten und/oder in der Darmmukosa des Dünndarms einen größeren Anteil von infizierten Tiere wieder und ist daher als Goldstandard geeigneter. Neben dem direkten mikroskopischen und dem kulturellen Nachweis von M. paratuberculosis im Untersuchungsmaterial ist der Einsatz der Polymerase – Kettenreaktion (PCR) als weitere direkte Nachweismethodik zu nennen. Diese Methodik wird für Massenuntersuchungen im

und nur in wenigen Untersuchungseinrichtungen etabliert ist (ONET 1997; WHIPPLE 1991).

Der Vorteil dieser Methode ist die schnelle Verfügbarkeit der Ergebnisse (SWEENEY et al.

1995). Nach AWAD-MASALMEH et al. (1999) ist der Einsatz der PCR trotz höherem Arbeits- und Kostenaufwand, als Ergänzung zur kulturellen Anzüchtung für die flächendeckende Untersuchung der Paratuberkulose sinnvoll. COLLINS et al. (1993) berichten dagegen, dass die Untersuchungen von Kotproben mit einem kommerziell angebotenem PCR - Test (IDEXX – DNA – Testkit) auf Grund der mangelnden Sensitivität wenig sinnvoll ist.

2.6.1.2 Indirekte Nachweismethoden

Zu den indirekten Nachweismethoden, die im Rahmen von Sanierungsmaßnahmen zur Bekämpfung der Paratuberkulose eingesetzt werden, zählen allergologische Verfahren und serologische Methoden zur Ermittlung eines Antikörpertiters. Allergologische Methoden dienen dem Nachweis der zellulären Immunität. MERKAL (1973) unterscheidet zwei Reaktionstypen, die nach intrakutaner Injektion von 0,1 ml Tuberkulin- bzw. Johnin-Lösung auftreten. Die allergische Reaktion vom Soforttyp ist durch eine ödematöse Schwellung im Bereich der Injektionsstelle nach ca. 2 Stunden gekennzeichnet und wird als unspezifische Reaktion gewertet. Die zweite Reaktion ist vom verzögerten Typ, bei der nach 24 – 72 Stunden eine Umfangsvermehrung an der Injektionsstelle auftritt. Diese Reaktion ist als positiv zu werten. Durch intravenöse Injektion von 2 – 4 ml Johninlösung wird die Sensitivität wesentlich gesteigert, höhere Kosten und die Gefahr eines anaphylaktischen Schocks sind entscheidende Nachteile dieser Methodik (CHIODINI et al. 1984; MERKAL 1973).

Zum Erkennen der Infektion bei Jungtieren bzw. Tieren mit geringer humoraler, aber noch bestehender zellulärer Immunität empfehlen zahlreiche Autoren den Einsatz eines gamma-Interferon-ELISA (COLLINS 1996; HIETALA 1992; ONET 1997). Dieser dient zur Messung der T-Zellantwort bei Stimulation durch das Antigen von M. paratuberculosis. Die Sensitivität und Spezifität eines kommerziell erhältlichen gamma-Interferon-Elisa (IDEXX-Laboratories) liegt nach HIETALA (1992) bei 70 – 94 % für die Sensitivität und bei 97 – 99

% für die Spezifität. Nach MCDONALD et al. (1999) ist der Einsatz dieser Methode wenig

sinnvoll, da in ihren Untersuchung auch nicht infizierte Tiere im gamma-Interferon-Elisa positiv reagierten.

Zu den serologischen Verfahren, die bei der Sanierung von infizierten Beständen eingesetzt werden, zählen die Komplementbindungsreaktion (KBR), der Agargel-Immundiffussionstest (AGID) und der Enzym-linked-Immunsorbent-Assay (ELISA). Der Einsatz serologischer Untersuchungsmethoden ist durch die Höhe des Antikörpertiters sowie der Sensitivität und Spezifität der Methode begrenzt. Da der Antikörpertiter bis zum Auftreten klinischer Symptome langsam steigt (COLLINS 1996), ist der Nachweis subklinisch infizierter Tiere mit sinkender Sensitivität der Methode nicht oder nur geringgradig möglich. Die Sensitivität von KBR und AGID ist für den Einsatz einer erfolgreichen Bestandssanierung zu gering (BELLETTI et al. 1992; HILBINK et al. 1994; KREEGER 1991; RIDGE und MORGAN 1991). Der Einsatz der AGID-Methode ist nur bei Tieren mit klinischer Symptomatik sinnvoll, da nur bei diesen Tieren der Test über eine akzeptable Sensitivität von 50 % verfügt.

Bei subklinisch infizierten Tieren werden Werte für die Sensitivität von 27 – 29 % ermittelt (HIETALA 1992). Die Sensitivität der KBR – Methode in Bezug auf den kulturellen Nachweis geben REICHEL et al. (1999) mit 17,9 % an. Die Ergebnisse der Untersuchungen mit einer ELISA-Methodik sind in der Regel signifikant besser (REICHEL et al. 1999). In ihrer Untersuchung haben die Autoren für einen kommerziellen ELISA (Paracheck ^TM , Commonwealth Serum Laboratories, Australien) eine Sensitivität von 31,1 % und für einen selbst entwickelten ELISA eine Sensitivität von 47,2 % in Bezug auf den kulturellen Nachweis des Erregers aus Kotproben ermittelt. Die Spezifität beider ELISA-Systeme lag bei 99,7 % sowie 97,9 % und für die KBR bei 97,1 %. Die Autoren haben die Sensitivität und Spezifität der serologischen Methoden in Bezug auf die Nachweisbarkeit von M.

paratuberculosis in der Untersuchung von Kotproben ermittelt.

Nach SWEENEY et al. (1995) liegt für einen kommerziellen ELISA (Idexx-Laboratories) die Sensitivität im Mittel bei 45 % und die Spezifität bei 99 %. Die Autoren demonstrieren in ihrer Untersuchung jedoch signifikante Schwankungen der Sensitivitätswerte in den unterschiedlichen Stadien der Infektion. Diese Ergebnisse hinsichtlich der Variation der Sensitivität der ELISA-Methode bestätigen auch COLLINS und SOCKETT (1993).

ROSSITER und BURHANS (1996) geben eine Sensitivität von 57 % und eine Spezifität von 99,7 % in Bezug auf die Untersuchung von Kotproben für den vom Bundesinstitut für

gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinärmedizin (BgVV) zugelassenen IDEXX-ELISA (IDEXX, Scandinavia AB), der in dieser Studie verwendet wird, an.

Für den kommerziell erhältlichen SVANOVIR-ELISA (SVANOVA Biotech) geben JARK (1996) und JARK et al. (1997) im Titrationsverfahren, bezogen auf die Ergebnisse der kulturellen Untersuchung des Ileocaecallymphknotens, eine (scheinbare) Sensitivität von 99

% und eine (scheinbare) Spezifität von 93,75 % an. Zur Steigerung der Effizienz in Bezug auf den Kosten- und Arbeitszeitfaktor hat REHM (1999) diesen LAM – ELISA in der

„Einpunktmessung“ etabliert und gibt eine Erkennungsrate von 67 % an. Der Einsatz des LAM-ELISA in Verbindung mit einer zusätzlich durchgeführten kulturellen Untersuchung der Tiere steigert nach REHM (1999) die Erkennungsrate auf 88 %. Die kombinierte Anwendung von kulturellen und serologischen Untersuchungsmethoden liefern den größtmöglichen Erfolg in einem Sanierungsverfahren (GAY und SHERMAN 1992;

ROSSITER und BURHANS 1996; WHITLOCK 1991). Zur Erhebung der Prävalenz einer Herde gibt COLLINS (1996) als sichersten und kosteneffizientesten Weg die serologische Untersuchung aller Tiere über zwei Jahren mit einem ELISA-System an. JORDAN (1996) weist darauf hin, dass genaue Aussagen zur Prävalenz einer Herde durch eine einmalige Untersuchung mit einem ELISA-System nicht möglich ist. Die Ermittlung der Prävalenz durch Einsatz unterschiedlicher Methoden, z.B. ELISA und kulturelle Untersuchung von Kotproben ist, insbesondere in Herden in denen nur einzelne Tiere infiziert sind, wesentlich exakter. Nach ROSSITER und BURHANS (1996) ist die Stichprobenuntersuchung zur Bestimmung der Prävalenz einer Herde nicht geeignet, da sich die Erkrankung nicht randomisiert verteilt.

Der Nachweis von Antikörpern in der Milch mittels ELISA ist nach SWEENEY et al. (1994) für ein Sanierungsverfahren noch nicht ausreichend etabliert. Die Gründe werden von den Autoren mit einer zu geringen Spezifität und einer zu geringen Reproduzierbarkeit der Ergebnisse in der Milch- und Blutprobenuntersuchung angegeben.