Diagnostik

Die Diagnosestellung der Glässerschen Krankheit erfolgt auf der Grundlage der Anamnese, klinischer Symptome und pathologischer Untersuchungen. Erste Hinweise ergeben sich aufgrund des klinischen Bildes sowie anhand der makroskopisch sichtbaren pathologisch-anatomischen Veränderungen. Diese umfassen eine serofibrinöse bis fibrino-purulente Entzündung der serösen Häute in

Form von Polyarthritis, Peritonitis, Pleuritis mit katarrhalisch-eitriger Bronchopneumonie sowie Perikarditis und Meningoenzephalitis.

Der Nachweis erfolgt durch eine mikrobiologische Untersuchung. Hierfür eignen sich Tupfer von fibrinösen Auflagerungen, Bauchhöhlenflüssigkeit, Synovia oder Liquor.

Trotz typischer klinischer Symptomatik und entsprechender pathologisch-anatomischer Veränderungen lässt sich H. parasuis aufgrund seiner Empfindlichkeit und der häufigen Überwucherung durch andere Keime nicht immer nachweisen (RAPP-GABRIELSON 1999; VOS 2004). Bei antibiotisch vorbehandelten Tieren gelingt der Nachweis nicht (OLIVEIRA u. PIJOAN 2002). Auch andere Faktoren, wie z. B. Chronizität der Erkrankung, nehmen Einfluss auf die Nachweisrate. Sie verbessert sich, wenn Material von frisch euthanasierten, unbehandelten Schweinen statt von verendeten Tieren gewonnen wird. Idealerweise werden Proben von Perikard, Pleura, Peritoneum, Gelenken und aus Meningen genommen (OLIVEIRA 2004). Eine Isolierung des Erregers aus dem Respirationstrakt lässt nicht unbedingt auf eine systemische Infektion rückschließen, da H. parasuis im oberen Respirationstrakt auch als kommensaler Besiedler vorkommen kann (OLIVEIRA 2004). Die Isolierungshäufigkeit nimmt parallel zum zeitlichen Abstand vom Eintritt des Todes des Tieres bis zur Untersuchung ab (KIELSTEIN et al. 1984).

Abb. 1: Diagnostisches Vorgehen bei Verdacht auf Glässersche Krankheit (nach RITZMANN und HEINRITZI 2005)

Eine Charakterisierung von H. parasuis kann durch die Unterscheidung in Serotypen und Genotypen erfolgen. Dazu sind verschiedene Verfahren beschrieben worden.

Im Allgemeinen werden die serologischen Tests als widersprüchlich und ungenau eingeschätzt (DONE 1999).

In der Literatur sind verschiedene Methoden zur serologischen Typisierung von H.

parasuis beschrieben, die in Abhängigkeit vom verwendeten Testsystem und Antigen zu unterschiedlichen Einteilungen führen.

Von BAKOS et al. (1952) wurde eine serologische Typisierung von H. parasuis in die Serovare A, B, C und D auf der Grundlage der Langsamagglutination (LA) entwickelt.

Als Antigen für diesen Test werden Ganzzellen aus Bakteriensuspension sowie Antiseren gegen diese Ganzzellen verwendet. Die vier Bakos-Typen wurden durch SCHIMMEL et al. (1985) um weitere drei Serovare ergänzt, die Jena 1, 2 und 3 genannt werden.

Das Klassifikationssystem von MOROZUMI und NICOLET (1986a) beruht auf der Verwendung hitzestabiler löslicher Bakterienextrakte sowie serotypspezifischer Kaninchenhyperimmunseren im Agargelpräzipitationstest (AGPT). Sie konnten so weitere sieben Serovare beschreiben, die von KIELSTEIN (1991) um weitere sieben Gruppen sowie von RAPP-GABRIELSON und GABRIELSON (1990) um weitere vier nicht näher bezeichnete Serovare ergänzt wurden. Mit beiden genannten Serotypisierungsverfahren werden unterschiedliche Antigenstrukturen erfasst, so dass nur teilweise Zusammenhänge zwischen den Bakos- und den Morozumi-Nicolet-Typen besteht. Nach vergleichenden Untersuchungen von KIELSTEIN und RAPP-GABRIELSON (1992) können somit 15 Serovare unterschieden werden.

Dieses Kielstein-Rapp-Gabrielson-Schema, welches auf hitzestabilen Antigenen getestet mit dem Agargelpräzipitationstest (AGPT) basiert, ist der international anerkannte Test zur Serotypisierung von H. parasuis. Die Serovare variieren in ihrer Pathogenität und treten regional unterschiedlich auf. In den meisten Ländern dominiert Serovar 5, gefolgt von Serovar 4 und 13. Ein hoher Anteil an nachweisbaren H.-parasuis-Isolaten lässt sich jedoch nicht typisieren. Das gleiche Vorkommen von mehreren Serovaren in einem Bestand und sogar in einem Tier ist möglich (KIRKWOOD et al. 2001; RAPP-GABRIELSON 1993 u. 1999).

Allerdings wurde in allen Studien ein sehr hoher Anteil nicht typisierbarer Serotypen festgestellt. In den USA und Kanada lag dieser Anteil bei 15 % (RAPP-GABRIELSON u. (RAPP-GABRIELSON 1992), in Deutschland bei 26 % (KIELSTEIN u.

RAPP-GABRIELSON 1992), in Spanien bei 29 % (RUBIES et al. 1999) und in Australien bei 41 % (RAFIEE u. BLACKALL 2000). Dieser hohe Anteil nicht typisierbarer Serotypen zeigt, dass die Möglichkeit einer noch höheren Anzahl von Serotypen gegeben ist (KIELSTEIN u. RAPP-GABRIELSON 1992; RAFIEE u.

BLACKALL 2000).

H.-parasuis-Stämme aus dem oberen Respirationstrakt sind meist von geringer Pathogenität und können auch bei klinisch gesunden Schweinen isoliert werden. Als apathogen werden die Stämme 3, 6, 7, 8, 9 und 11 eingeschätzt (KIELSTEIN et al.

1992; OLIVEIRA u. PIJOAN 2002).

Eine weitere Methode zur Serotypisierung von H.-parasuis-Isolaten ist die indirekte Haemagglutination (IHA), bei der erhitzte Bakterienzellen als Antigen für Schaferythrozyten verwendet werden (MINIATS et al. 1991a). Häufig wurden negative und sehr variable Ergebnisse erzielt, und die Autoren MINIATS et al. (1991) halten die IHA für unzuverlässig und für die Serotypisierung ungeeignet. KHYALI und MITTAL (2002) konnten dagegen im Vergleich zur Immundiffusion, bei der etwa 30 % der Isolate nicht typisierbar war, mit der indirekten Haemagglutination 90 % der Isolate typisieren, ohne dass Kreuzreaktionen aufgetreten sind. DEL RÍO et al.

(2003) konnten mit der indirekten Haemagglutination 91 % der Isolate serotypisieren, mit der Immundiffusion 63 %. Sie empfehlen die IHA als nützliche Methode zur sensitiven und spezifischen Serotypisierung von H. parasuis.

Die Serotypisierung von H. parasuis kann außerdem mit dem Koagglutinationstest durchgeführt werden. DEL RÍO et al. (2003) beschreiben den Koagglutinationstest als einfach, spezifisch und sensitiv, allerdings werden häufig Kreuzreaktionen beobachtet, dass er nicht zur Serotypisierung für H. parasuis empfohlen wird.

Für den Nachweis von Antikörpern gegen H. parasuis in Serum oder Kolostrumproben können ELISA-Verfahren (Enzyme Linked Immunnosorbent Assay) angewendet werden (MINIATS et al. 1991a; SOLANO-AGUILAR et al. 1999).

MÜLLER (2004) hat für seine Untersuchungen einen indirekten spezifischen ELISA zum Antikörpernachweis gegen H. parasuis Serotyp 5 verwendet. Extrakte dieses Agens wurden als Antigen genutzt. SOLANO-AGUILAR et al. (1999) benutzten einen ELISA, der als Antigen formalininaktivierte Bakterienzellen nutzte, um maternale Antikörpertiter und die humorale Antwort der Ferkel nach einer Impfung zu testen.

Sie fanden bei den Ferkeln schon im Alter von fünf Tagen eine Antikörperbildung als Reaktion auf die Impfung.

Eine weitere Methode zum Antikörpernachweis ist der Komplementfixationstest.

NIELSEN (1993) konnte mit diesem Verfahren innerhalb einer Woche zirkulierende Antikörper nach einer Infektion mit H. parasuis nachweisen, aber auch bei dem Komplementfixationstest kommt es zu Kreuzreaktionen zwischen den einzelnen Serotypen. TAKAHASHI et al. (2001) benutzten diesen Test, um Antikörpertiter bei

einem Infektionsversuch zu bewerten. Sie fanden Antikörpertiter 19 Tage nach der zweiten Vakzination.

Neben den verschiedenen Serotypisierungsverfahren kann zur Identifizierung von H.

parasuis auch eine Genotypisierung durchgeführt werden.

Von OLIVEIRA et al. (2001) wurde ein PCR-Verfahren (Polymerase Chain Reaction) angewendet, um die Genauigkeit und Schnelligkeit in der H.-parasuis-Diagnostik zu verbessern. Mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion ist es möglich, Nukleotidsequenzen enzymatisch zu amplifizieren. Das Prinzip der PCR beruht auf der Fähigkeit von bestimmten zellulären Enzymen, sogenannten Polymerasen, DNA zu verdoppeln. Die hierfür verwendeten Primer waren hoch spezifisch für den Nachweis von H. parasuis. Die PCR kann auch im Fall eines negativen bakteriologischen Ergebnisses herangezogen werden, da Antigene sowohl aus Bakterienkulturen als auch direkt aus Probenmaterial nachgewiesen werden können (OLIVEIRA u. PIJOAN 2004). Als Material für die PCR dienen veränderte Organe, Synovia, Liquor oder Bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit (BALF). Die PCR gilt als gute Screeningmethode zur Beurteilung der einzelnen Betriebe.

Als Modifikationen der konventionellen PCR wurden die Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus (ERIC)-PCR, die nested-PCR, die Real-time PCR und die Amplifikationsfragmentlängenpolymorphismus (AFLP)-PCR entwickelt.

Die ERIC-PCR ist eine molekularbiologische Methode, mit deren Hilfe man stammspezifische Fingerabdrücke produzieren kann, die den Vergleich und die Differenzierung der verschiedenen Stämme ermöglichen (OLIVEIRA u. PIJOAN 2001). Sie erlaubt Untersuchungen zur Epidemiologie von H. parasuis innerhalb und zwischen den Herden und verbessert die Charakterisierung der verschiedenen H.-parasuis-Isolate. In Studien konnte nachgewiesen werden, dass erhebliche genetische Unterschiede innerhalb der verschiedenen Serovare vorliegen (OLIVEIRA et al. 2004). OLIVEIRA et al. (2004) haben die Reproduzierbarkeit der Methoden der AFLP- und der ERIC-PCR miteinander verglichen und sind zu dem Ergebnis gekommen, dass beide Verfahren gute Methoden zur Genotypisierung sind. Der Nachteil der ERIC-PCR ist allerdings die schlechte Reproduzierbarkeit der

Ergebnisse. Die Ergebnisse der AFLP sind abhängig von den benutzten Restriktionsenzymen und den Parametern der Amplifikation.

Bei der nested-PCR wird DNA aus formalinfixiertem, in Paraffin eingebettetem Gewebe nachgewiesen. Dieser Nachweis ist für die Routinediagnostik wichtig, da auf diese Weise viele Proben aufbereitet werden können.

Eine weitere Alternative der H.-parasuis-Diagnostik ist die Immunhistochemie. H.

parasuis konnte aus Proben von experimentell infizierten Schweinen nachgewiesen werden. Ebenso wird der Nachweis von inaktivierten Erregern aus dem Zytoplasma phagozytierender Zellen ermöglicht (AMANO et al. 1994; SEGALES et al. 1997). Es können allerdings Kreuzreaktionen mit A. pleuropneumoniae auftreten, wenn polyklonale Antikörper für den Nachweis verwendet werden.