Datenauswertung - Fluorescence activated cell sorting (FACS)

3. Eigene Untersuchungen

3.1 Material und Methoden

3.1.9 Fluorescence activated cell sorting (FACS)

3.1.9.6 Datenauswertung

Die bei der Flow-Zytometrie gewonnenen Daten wurden mit Hilfe des Programmes FlowJo (Version 7.5.5, Tree Star, USA) ausgewertet. Zunächst wurden für die die Leerkontrollen in einer zweidimensionalen „Pseudocolor-Plot“-Darstellung, mit angewählter Weichzeichner-Funktion („smooth“) FSC und SSC gegeneinander aufgetragen und mit Hilfe eines Gates alle unspezifischen Signale ausgeschlossen (siehe Abb. 9a.; unspezifische Signale unterhalb der

diagonalen Linie, siehe Pfeil). Resultierend daraus wurde der FITC-A (Fluoresceinisothiocyanat)–Kanal, ein Grünkanal (Abb. 9b. Y-Achse), gegen den ECD-A (Elec-tron Coupled Dye, auch PE-Texas Red)-Rot-Kanal (Abb. 9b. X-Achse) aufgetragen. Alle Ereig-nisse, die in dieser Darstellung auf der Diagonalen und darunter liegen sind von der Wertung auszuschließen, weil sie nicht im grünen Fluoreszenzbereich liegen. Das Gate wird oberhalb der Diagonale so platziert, dass dort in der Kontrolle möglichst keine Ereignisse vorkommen.

Dasselbe Gate wird auch für alle anderen Proben eines Tieres verwendet. In der Kontrolle des Fluoreszenzantikörpers liegen in diesem Gate alle den Sekundärantikörper unspezifisch bindenden Ereignisse (Abb. 9c.). Die Punktwolke des Primärantikörpers ist in Abbildung 9d.

dargestellt. In dem Gate in dieser Darstellung kommen sowohl die spezifisch gebundenen Ereignisse zum Liegen, als auch die mit Hilfe der Kontrolle des Sekundärantikörpers schon ermittelten unspezifisch gebundenen. Deshalb müssen die Werte der Sekundärantikörper-kontrolle von den Werten der Kontrolle des Primärantikörpers subtrahiert werden, um den tatsächlichen Wert der markierten Zellen zu finden.

Abb. 9: Auswahl der Gates zur Definierung der auszuwertenden Zellen

Abb. a. Adult_KO.fcs

Abb. d. Adult_Glucagon.fcs Abb. c. Adult_KO rbt 488.fcs

Abb. b. Adult_KO.fcs

(9a: Pfeil: Abgrenzung der unspezifischen Signale; 9b: Auftragen des Grün-Kanals (Y-Achse) gegen den Rot-Kanal (X-Achse), in der Kontrolle KO liegen oberhalb der Diagonalen keine Ereignisse mit grüner Fluoreszenz; 9c: in der Kontrolle des Fluoreszenzantikörpers liegen oberhalb der Diagonalen die Ereignisse, die den Fluoreszenzantikörper unspezifisch binden;

9d: Punktwolke des Primärantikörpers mit allen spezifisch und unspezifisch gebundenen Ereignissen)

65 3.1.10 Statistische Auswertung

Eine statistische Auswertung wurde sowohl für die Ergebnisse aus der immunhistochemi-schen Untersuchung als auch für die in der Flowzytometrie erhobenen Daten durchgeführt.

Zunächst wurden mit dem Tabellenkalkulationsprogramm Microsoft® Excel® 2007 die ermit-telten Zahlenwerte für die verschiedenen Zelltypen, Inselgrößen und Ins elzahl sowie der gesamten Fläche der histologischen Schnitte einander gegenübergestellt.

Mit Hilfe des Statistikprogrammes GraphPad Prism (Version 5.04, Fa. GraphPad Software, USA) wurde eine umfassende statistische Analyse des gewonnenen Datenmaterials durchge-führt. Alle zu untersuchenden Datenreihen wurden zunächst mit dem Kolmogorov-Smirnow-Test aufgrund der geringen Stichprobengröße (n < 50) auf Normalverteilung getestet. Lag beim statistischen Vergleich zweier Gruppen eine Gauß’sche Verteilung vor und unterschie-den sich die Varianzen zwischen unterschie-den Gruppen nicht signifikant, fand der t-Test für unabhän-gige Stichproben mit zweiseitiger Hypothesenformulierung Anwendung, um die Mittelwerte beider Gruppen auf signifikante Unterschiede zu überprüfen. Konnte keine Gauß’sche Nor-malverteilung festgestellt werden, wurde der Mann-Whitney-U-Test (auch: „Wilcoxon-Mann-Whitney-Test“; „U-Test“, „Wilcoxon Rangsummentest“) verwendet. Bei dem statisti-schen Vergleich von mehr als 2 Gruppen wurde die einfache Varianzanalyse (One-way ANOVA), zum Test auf signifikante Unterschiede im Falle einer Gauß’schen Verteilung, an-gewendet. Kam es bei dieser Analyse zu signifikanten Unterschieden zwischen den Gruppen (p < 0,05) wurde als Post Hoc Test der Newman-Keuls Multiple Comparisons Test (auch Stu-dent-Newman-Keuls-Test genannt) durchgeführt, um die einzelnen Gruppen miteinander zu vergleichen. Waren die Daten nicht normal verteilt, wurde der verteilungsunabhängige Krus-kall-Wallis-Test und, zum Vergleich der einzelnen Gruppen miteinander, der Dunn’s Test verwendet.

Eine eventuelle Korrelation zwischen den Zahlen der Inseln, bzw. der verschieden Zelltypen und dem Alter der Tiere wurde mit dem Spearman-Rangkorrelationstest überprüft. Dieser Test wird zur Ermittlung des stochastischen Zusammenhangs nicht normal verteilter Variab-len angewendet. Dabei werden den ursprünglichen Messwerten RangzahVariab-len zugeordnet. Die

Werte der Rangkorrelationskoeffizienten nach Spearman rS liegen zwischen minus Eins und plus Eins. Dabei besteht bei r = 0 keine Abhängigkeit, bei rS = 1 vollständig positive bzw. rS = -1 vollständig negative Korrelation.

Für die Irrtumswahrscheinlichkeit p erfolgte die Festlegung folgender Signifikanzstufen:

0,05 ≤ p ≤ 0,10 Tendenz (*)

p < 0,05 signifikant *

p < 0,01 hoch signifikant **

p <0,001 höchst signifikant ***

67 3.2 Ergebnisse

Für die vorliegende Studie wurden die Weißbüschelaffen in zwei Gruppen unterteilt. Die Pankreas von 32 Tieren kamen in der Versuchsreihe I der immunhistochemischen Untersu-chung zu und die Organe der übrigen 25 Tiere wurden in der Versuchsreihe II mit Hilfe der Durchflusszytometrie untersucht. Die untersuchten Organe wurden im Zeitraum von 2006 bis 2010 gewonnen.

Für die retrospektiven Fallaufarbeitungen der Tiere mit Wasting Marmoset Syndrom aus dem Jahre 2006 wurde auf archivierte Sektionsberichte zurückgegriffen. Konnten im Sekti-onsgang neben chronischen und chronisch-aktiven entzündlichen Darmveränderungen bei deutlichem Gewichtsverlust keine weiteren klinisch relevanten Befunde erhoben werden, so wurde die Diagnose WMS gestellt.

3.2.1 Pankreas makroskopisch

Das Pankreas des Weißbüschelaffen liegt der dorsalen Bauchwand an und steht nach links mit der Milz und nach cranial mit dem Magen in Kontakt und wird nach ventral vom Colon transversum und der Plica duodenocolica verdeckt. Es ist eingebettet in die Serosalamellen des Mesoduodenums und in das darin enthaltene, je nach Ernährungszustand meist reichlich vorhandene Fettgewebe, welches kaum vollständig vom Pankreasgewebe zu trennen ist. Das Organ steht in enger Beziehung mit dem Duodenum, welches an seiner mesenterialen Seite großflächig und fest mit dem Pankreaskopf verwachsen ist (Abbildungen 10 und 11).

Abb. 11: Lage des Pankreas beim adulten (links) und neugeborenen (rechts) Weißbüschelaf-fen in Situ

Abb. 10: Lage des Pankreas beim adulten Weißbüschelaffen in Situ

1 Pankreas (1a: Pankreaskopf; 1b: Pankreaskörper; 1c:Pankreasschwanz); 2 Leber; 3 Gallenbla-se; 4 Magen;5 Duodenum; 6 Colon; 7 Niere; 8 Milz; 9 Pfortader; 10 mesenteriales Fettgewebe 2

69 3.2.2 Immunhistochemische Untersuchung 3.2.2.1 Die Langerhans’schen Inseln

Bei den durchgeführten histologischen und immunhistochemischen Untersuchungen des Pankreas des Weißbüschelaffen fiel auf, dass die Langerhans’schen Inseln zentral innerhalb der Pankreasläppchen gelegen waren und eine variable, polyedrische, länglich ovale bis run-de, jedoch im allgemeinen recht kompakte Form aufwiesen. Schon bei der orientierenden Durchmusterung der Schnitte der verschiedenen Tiere bei kleiner Vergrößerung war zu er-kennen, dass die im Verhältnis zum exokrinen Pankreasgewebe zahlreicheren Inseln der Neugeborenen eine deutlich vielfältigere, zum Teil stärker verzweigte Form aufwiesen, je-doch kleiner waren als die der adulten Tiere. Bei den Tieren aller Altersstufen war zu erken-nen, dass sich die Inseln in den verschiedenen Bereichen des Pankreas nicht einheitlich aus den vier verschiedenen Zelltypen zusammensetzten. Diejenigen im Pankreaskörper- und -schwanzbereich enthielten annähernd keine PP-Zellen und wurden somit in Form von Man-telinseln aus einem Kern von Insulinzellen und einer „Hülle“ von Glucagon- und Somatosta-tinbildenenden Zellen gebildet. Diese beiden Zellgruppen bildeten auch septenähnliche Strukturen in das Inselinnere, wo sie mit den Blutgefäßen in engem Kontakt standen und die B-Zellen in Gruppen unterteilen. Im dem Duodenum zugewandten dorsalen Pankreaskopfbe-reich hingegen verteilten sich sehr viele PP-Zellen. Diese lagen zwar vorwiegend außerhalb der Inseln, bildeten aber in einigen gemeinsam mit den D-Zellen einen die B-Zellen unvoll-ständig umgebenden Mantel, während der Anteil an glucagonbildenenden A-Zellen hier äu-ßerst gering war. Viele Inseln im Pankreaskopf setzten sich jedoch bizellulär nur aus B- und D-Zellen zusammen. Die Verteilung der endokrinen Pankreaszellen wird im späteren Ab-schnitt genauer erläutert.

3.2.2.1.1 Zusammenhang zwischen Alter und Anzahl der Langerhans’schen Inseln

Die Anzahl der Langerhans’schen Inseln pro mm² Fläche des histologischen Schnittes sank mit zunehmendem Alter der Tiere. Mit Hilfe des Rangkorrelationkoeffizienten nach

Spear-70

man wurde der Zusammenhang zwischen Alter der Tiere und Anzahl der Inseln geprüft. Es konnte mit rs = -0,8461 eine negative Korrelation bezüglich Alter und Inselzahl mit einer Irr-tumswarscheinlichkeit p < 0,0001 (höchst signifikant) ermittelt werden (Abbildung 12). Da für diesen Test die Inselzahlen aller Tiere ihrem Alter von 0 Tagen bis 10 Jahren gegenüber-gestellt wurden, konnte im Kolmogorov-Smirnov-Test keine Normalverteilung festgegenüber-gestellt werden. Deshalb musste an dieser Stelle der Median angegeben werden. Dieser betrug 7,98 Inseln pro mm² Pankreasschnittfläche. Zur besseren Vergleichbarkeit des Wertes mit den Mittelwerten der einzelnen Gruppen wird jedoch zusätzlich der Mittelwert von 12,67 Inseln pro mm² angegeben.

Alter in Monaten

20 40 60 80 100 120

0 20 40

60 Inseln

Inselzahl pro mm²

Abb. 12: Altersabhängige Anzahl der Inseln pro mm² Schnittfläche (p < 0,0001)

Um die mittlere Anzahl der Langerhans‘schen Inseln für neugeborene, juvenile und adulte Tiere zu ermitteln, wurden die drei Gruppen mit Hilfe der einfaktoriellen Varianzanalyse (One-way-ANOVA) verglichen. Diese wurde aufgrund der im Kolmogorov-Smirnov-Test er-mittelten Normalverteilung der Daten der Einzelgruppen durchgeführt und ergab einen höchst signifikanten Unterschied zwischen den 3 Altersgruppen (F = 20,86; p < 0,0001). So zeigten, wie mit Hilfe des Newman-Keuls Multiple Comparisons Test ermittelt und in Abbil-dung 13 verdeutlicht, die neugeborenen Tiere mit einem Mittelwert von 26.22 Inseln pro

mm² eine höchst signifikant größere Zahl an endokrinen Inseln als die juvenilen Tiere mit 11,34 Inseln pro mm² (p < 0,001) und die adulten Tiere, die 6,48 Inseln pro mm² (p < 0,001).

Die Zahl der Inseln nahm also besonders in frühen Lebensabschnitten deutlich ab (Tabelle im Anhang 7.12).

Alter

Inselzahl pro mm²

neugeboren

juvenil

adult 0

10 20 30 40 50

Abb. 13: Altersabhängige Anzahl der Inseln pro mm² Schnittfläche ( *** p < 0,001)

3.2.2.1.2 Zusammenhang zwischen Alter und Größe der Langerhans’schen Inseln

Die Größe der endokrinen Pankreasinseln variierte ebenfalls stark. Der Übergang von dis-seminierten endokrinen Einzelzellen oder kleineren endokrinen Zellgruppen („Zellcluster“) zu Langerhans’schen Inseln war fließend, so dass eine eindeutige Definition des Begriffs „In-sel“ nur schwer möglich war. Deshalb wurden alle Zellgruppen, die im zweidimensionalen Schnitt mehr als vier Zellen umfassten als Insel definiert.

Für die in Abbildung 14 dargestellte Altersabhängigkeit der mittleren Inselgröße wurde zu-nächst der Rangkorrelationkoeffizienten nach Spearman ermittelt. Mit rs = 0,7728 konnte

***

eine positive Korrelation zwischen dem Alter der Tiere und der Inselgröße mit einem p <0,0001 (höchst signifikant) gezeigt werden. Der Median der Inselgrößen aller Tiere betrug 6956 µm² (Mittelwert = 4736 µm²).

Abb. 14: Altersabhängige Größe der Langerhans’schen Inseln (p < 0,0001)

Zum Vergleich der Altersgruppen miteinander (Abbildung 15) wurde eine einfaktorielle Va-rianzanalyse durchgeführt. Sie ergab einen hoch signifikanten Unterschied von p = 0,0015 (F = 9,190) zwischen den Altersgruppen. Daraufhin wurde als Post Hoc Test der Newman-Keuls-Test durchgeführt. Der durchschnittliche Flächeninhalt der Inseln der adulten Tiere betrug 11101 µm² und war somit höher als der für die juvenilen Tiere mit 5222 µm² (p < 0,01) und für die neugeborenen Tiere mit nur 2616 µm² (p < 0,01) ermittelte Wert. Es konnte also gezeigt werden, dass die mittlere Größe der Langerhans’schen Inseln im Laufe des Lebens der Weißbüschelaffen stetig zunimmt. Die minimale Inselgröße lag bei adulten Tieren bei ca. 200 µm², während die maximale Größe ca. 120000 µm² betrug. Bei juvenilen Tieren waren die kleinsten Inseln ca. 200 µm² und die größten ca. 45000 µm² groß. Bei Neu-geborenen lag die Inselgröße zwischen 140 µm² und 17500 µm². Die Abbildungen 16 und 17 zeigen einen Vergleich zwischen den Flächeninhalten der jeweils kleinsten und größten

In-73

seln bei den 3 Altersgruppen. Während die Größenunterschiede bei den kleinsten Langerhans’schen Inseln nur zwischen neugeborenen und adulten Tieren signifikant waren (p < 0,01), waren die größten Inseln der adulten Tiere mit p < 0,001 höchst signifikant größer als die der neugeborenen und juvenilen Tiere. Die Variabilität der Inselgröße nimmt also auch mit zunehmendem Alter zu (Tabelle im Anhang 7.11).

Alter

Inselfläche in µm²

neugeboren

juvenil

adult 0

2500 5000 7500 10000 12500 15000 17500 20000 22500 25000

Abb. 15: Vergleich der mittleren Größe der Langerhans’schen Inseln bei Tieren verschiede-nen Alters (** p < 0,01)

Abb. 16: Altersabhängiger Vergleich der Grö-ße der kleinsten Inseln

Abb. 17: Altersabhängiger Vergleich der Grö-ße der größten Inseln (*** p < 0,001)

3.2.2.1.3 Vergleich der Größe von PP- und Glucagon-Inseln

Zwischen den Bereichen des Pankreas mit einem großen Anteil an PP-Zellen und wenigen Glucagonzellen und dem Bereich mit wenigen oder keinen PP-Zellen und einem großen Glu-cagonzellanteil war ein deutlicher Unterschied in Bezug auf die Inselgröße und Verteilung zu erkennen. Diese Bereiche werden nachfolgend als PP- und Glucagon-Bereich mit den ent-sprechenden PP- und Glucagon-Inseln bezeichnet. Die Abbildung 18 zeigt, dass die Langerhans’schen Inseln im Glucagonbereich des Pankreas mit einem Median von 9878 µm² (Mittelwert 10817) deutlich größer waren als die Inseln im PP-Bereich, die einen Median von 4909 µm² aufwiesen (Mittelwert 5648). Dieser Unterschied wurde mit Hilfe des Mann-Whitney-U-Tests ermittelt, da die Werte nicht normalverteilt waren, und war mit p = 0,0073 hoch signifikant.

***

Inselfläche in µm²

Glu

cagon-Inseln

PP-Inseln 0

5000 10000 15000 20000 25000

Abb. 18: Vergleichende Darstellung der Größen von PP-Inseln und Glucagon-Inseln aller ge-sunden Tiere (** p < 0,01)

Bei der histologischen Untersuchung der Pankreasschnitte aller Tiere war zu erkennen, dass die Inseln in deren PP-Bereich zahlreicher vorhanden waren als im Glucagon-Bereich. Das Pankreas des gesunden adulten Tieres mit der Nummer K1991 konnte bei der Präparation klar in Glucagon- und PP-Bereich unterteilt werden. Beide Bereiche wurden separat einge-bettet. Auf Grund dessen konnte an diesem Organ eine genauere Betrachtung hinsichtlich der Unterschiede in der Anzahl der Inseln beider Bereiche durchgeführt werden. Es zeigte sich, dass im Glucagon-Bereich des Pankreas mit durchschnittlich 7,06 Inseln signifikant mehr Inseln pro mm² Schnittfläche zu finden waren als im PP-Bereich des Pankreas (p = 0,0286) (Abbildung 19).

Inselzahl pro mm²

Glu

cagon-Inseln

PP-Inseln 5.5

6.0 6.5 7.0 7.5 8.0

Abb. 19: Vergleichende Darstellung der Anzahl von PP-Inseln und Glucagon-Inseln (* p <

0,05)

3.2.2.2 Quantitative Unterschiede zwischen den endokrinen Zellen des Pankreas bei Tie-ren verschiedenen Alters

3.2.2.2.1 B-Zellen

Die insulinproduzierenden B-Zellen stellen die größte Gruppe der endokrinen Zellen des Pankreas der Weißbüschelaffen dar (Abbildung 43). Ihr Durchmesser reicht von ca. 12 bis ca. 18 µm. Neben ihrem zahlenmäßig starken Auftreten in den Langerhans’schen Inseln, kommen sie auch als Einzelzellen oder in extrainsulären Zellclustern, also in Gruppen mit weniger als vier Zellen im zweidimensionalen Schnittbild, in monozellulärer oder auch poly-zellulärer Verteilung, vor allem gemeinsam mit D- und A-Zellen, vor. Die Granula der runden bis ovalen Zellen umgeben den Zellkern komplett, konzentrieren sich aber oft an einem Zell-pol, wobei benachbarte B-Zellen eine ähnliche Polarisierung hin zu Gefäßen zeigen.

Mit Hilfe des Rangkorrelationkoeffizienten nach Spearman wurde die Anzahl der B-Zellen pro mm² Schnittfläche (rs = -0,4636) getestet, wie in Abbildung 20 dargestellt. Sie nahm mit

zu-*

nehmendem Alter der Tiere ab. Diese Korrelation war mit p = 0,0259 signifikant. Der Median der nicht normalverteilten mittleren B-Zellzahlen aller Tiere betrug 244,1 Zellen pro mm² und der Mittelwert 270 Zellen pro mm² (Tabelle im Anhang 7.8).

Alter in Monaten

20 40 60 80 100 120

-200 0 200 400 600

800 B-Zellen

Zellzahl pro mm²

Abb. 20: Altersabhängige Anzahl der B-Zellen pro mm² Schnittfläche (p < 0,05)

Die durchschnittliche B-Zellzahl pro mm² Pankreasschnittfläche betrug, wie in Abbildung 21 gezeigt, bei Neugeborenen 445,8 Zellen, bei juvenilen Tieren 226,6 Zellen und bei adulten Tieren 215,7 Zellen pro mm² Schnittfläche. Sie zeigte sich also bei den neugeborenen Tieren deutlich höher als bei den juvenilen und adulten Tieren. Die normalverteilten Werte wurden mit der One-way ANOVA getestet (F = 11,28). Hieraus ergab sich mit einem p von 0,0005 ein höchst signifikanter Unterschied der B-Zellzahl bei den Tieren verschiedener Altersstufen.

Dabei unterschieden sich die 0-17 Tage alten Tiere von den 1-9 Monate alten Tieren und von den adulten Tieren mit jeweils einem p kleiner 0,001 höchst signifikant. Die Zahl der B-Zellen sank also vor allem in den ersten Lebenswochen der Weißbüschelaffen.

78 Alter

Zellzahl pro mm²

neugeboren

juvenil

adult 0

200 400 600 800

Abb. 21: Anzahl der B-Zellen pro mm² Pankreasschnittfläche bei den verschiedenen Alters-gruppen

Die B-Zellen befanden sich in den Inseln diffus verteilt oder durch die A- und D-Zellen in Gruppen separiert (Abbildung 47). Innerhalb der Inseln hatte jede B-Zelle Kontakt zu mindes-tens einer, meist jedoch mehreren anderen B-Zellen. Im zweidimensionalen Schnittbild zeig-ten nur wenige B-Zellen Kontakt zu den Inselgefäßen. Sie wurden durch die Nicht-B-Zellen vom Perikapillarraum separiert. Mit Hilfe des Newman-Keuls-Tests, der zum paarweisen Vergleich der Gruppen, die in der einfachen Varianzanalyse (F = 15,5) eine Irrtumswahr-scheinlichkeit von p < 0,0001 ergaben, herangezogen wurde, konnte gezeigt werden, dass der mittlere Anteil der B-Zellen an der Gesamtheit der Zellen einer durchschnittlichen Langerhans’schen Insel bei adulten Tieren mit 66,23 % signifikant größer war als bei den ju-venilen Tieren mit 55,4 % (p < 0,001) und den neugeborenen Tieren mit 48,6 % (p < 0,01) (Abbildung 22). Im Laufe des Lebens der Weißbüschelaffen machen die B-Zellen also einen immer größeren Anteil am Inselparenchym aus (Tabelle im Anhang 7.9).

***

Abb. 22: Prozentualer Anteil der B-Zellen an der gesamten Zellzahl der Langerhans'schen Inseln (** p < 0,01; *** p < 0,001)

Im Gegensatz dazu war der Anteil extrainsulärer B-Zellen bei den Tieren aller Altersgruppen verhältnismäßig klein. Aufgrund der nicht vorhandenen Normalverteilung der Daten fand für den Vergleich der extrainsulären B-Zellen zwischen den Altersgruppen der Kruskall-Wallis-Test Anwendung. Er ergab einen p = 0,0018 und zeigte sich somit als hoch signifikant. Als Post Hoc Test wurde der Dunn’s Multiple Comparison Test verwendet. Bei den adulten Tie-ren war der Anteil der extrainsuläTie-ren B-Zellen mit einem Median von 1,13 % (Mittelwert 1,26 %) von der gesamten B-Zellzahl signifikant geringer als bei den neugeborenen Tieren mit 3,51 % (Mittelwert 3,41 %) (p < 0,05) und den Juvenilen mit 3,21 % (Mittelwert 3,35 %) (p < 0,01) (Abbildung 23 und Tabelle im Anhang 7.10).

***

Alter

Zellzahl pro Insel in %

neugeboren

juvenil

adult 0

20 40 60

80 **

***

80 Alter

Zellzahl in %

neugeboren

juvenil

adult 0

2 4 6 8

Abb. 23: Prozentualer Anteil der extrainsulären B-Zellen an der gesamten B-Zellzahl (*

p < 0,05; ** p < 0,01)

Die absolute Zahl der extrainsulären B-Zellen pro mm² Schnittfläche unterschied sich zwi-schen den Tieren verschiedenen Alters wesentlich deutlicher als ihre relative Anzahl an der gesamten B-Zellmasse. Hier zeigte sich eine deutliche Abnahme der absoluten Zahl der ext-rainsulären B-Zellen mit zunehmendem Alter. Dieser Unterschied konnte mit Hilfe der One-way ANOVA als höchst signifikant festgestellt werden (F = 12,13; p = 0,0004), wobei mit zu-nehmendem Alter eine Abnahme erkennbar ist. Die Mittelwerte der extrainsulären B-Zellen betrugen bei den Neugeborenen 15,31 Zellen, bei den juvenilen Tieren 7,71 Zellen und bei den ausgewachsenen Tieren 2,52 Zellen pro mm². Wie in Abbildung 24 ersichtlich, sind die Unterschiede zwischen Neugeborenen und Adulten höchst signifikant (p < 0,001), zwischen den Neugeborenen und den juvenilen Tieren signifikant (p < 0,05) und zwischen Juvenilen und Adulten hoch signifikant (p < 0,01).

81 Alter

Zellzahl pro mm²

neugeboren

juvenil

adult 0

10 20 30

Abb. 24: Absolute Anzahl extrainsulärer B-Zellen pro mm² Schnittfläche (* p < 0,05; **

p < 0,01; *** p < 0,001)

3.2.2.2.2 A-Zellen

Der Anteil der A-Zellen am pankreatischen Inselparenchym unterschied sich sehr stark zwi-schen den Inseln des PP-Bereichs, wo sie fast gar nicht vorkamen, und denen des Glucagon-Bereichs, wo sie die zweitgrößte endokrine Zellgruppe darstellten. Sie verteilten sich als ein-zelne Zelllage entlang der äußeren Begrenzung der Inseln und folgten septenartigen Struktu-ren ins Inselinnere. Sie waStruktu-ren eher oval, mit einem Durchmesser von ca. 10 – 15 µm etwas kleiner als die B-Zellen und standen in engem Kontakt zu diesen, zu einander und zu den Inselblutgefäßen. Die Granula der vorwiegend ovoid geformten A- Zellen umgaben den Zell-kern ringförmig oder als halbmondförmiger Ring an einem Pol konzentriert. Dieser war meist zur Außenseite der Insel oder zu den Gefäßen hin orientiert (Abbildungen 44 und 48).

***

In der Abbildung 25 ist zu sehen, dass die Zahl der A-Zellen mit zunehmendem Alter sinkt. Es wurde der Rangkorrelationskoeffizient nach Spearman (r = -0,7793) bestimmt. Danach sind das Alter und die Zellzahl mit p < 0,0001 höchst signifikant korreliert. Der Median der nicht normalverteilten Werte betrug 82,49 Zellen pro mm² Schnittfläche, der Mittelwert betrug 103,2 Zellen pro mm² (Tabelle im Anhang 7.8).

Alter in Monaten

20 40 60 80 100 120

-200 -100 0 100 200 300

400 A-Zellen

Zellzahl pro mm²

Abb. 25: Altersabhängige Anzahl der A-Zellen pro mm² Schnittfläche (p < 0,0001)

Die in Abbildung 26 dargestellte Menge der A-Zellen pro mm² bei den verschiedenen Alters-gruppen war normal verteilt. Die daher verwendete One-way ANOVA ergab mit einem p = 0,0004 eine höchste Signifikanz (F = 11,93). Der Mittelwert der A-Zellen pro mm² Schnitt-fläche betrug bei den Neugeborenen 191,5 Zellen pro mm² SchnittSchnitt-fläche größer als bei den

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