Die im Rahmen der Identifizierung neuartiger Nebenhodenprodukte des Hundes durchgeführte partielle Sequenzierung des CE11-Klons aus der Nebenhoden-Bibliothek von K. Ellerbrock (1994) lieferte eine neuartige, bis dahin unbekannte cDNA-Sequenz von 300 bp mit einer internen Pst I-Schnittstelle.
Zur näheren Charakterisierung des CE11-Transkripts wurden verschiedene Restriktionsverdaus durchgeführt. Zunächst wurde das in dem pBluescript SK +/- Vektor einklonierte cDNA-Insert an den Eco RI- und Xho I-Schnittstellen, und in einem zweiten Restriktionsansatz an den Kpn I- und Bam HI-Schnittstellen aus dem Plasmid herausgeschnitten. Der Restriktionsverdau wurde anschließend auf einem 1% Agarose-Gel elektrophoretisch aufgetrennt (nicht dargestellt). Die Gesamt-Insertlänge des Kpn I-/Bam HI-Restriktionsverdaus lag bei ca. 1,5 kb. Der Eco RI-/Xho I-Dau lieferte ein zweigeteiltes Insert mit einer Bande bei 400 bp und einer Bande bei 1,1 kb. Addiert man die Insertlängen beider Fragmente, so kommt man wieder auf eine Gesamtlänge von 1,5 kb. Die Zweiteilung des Inserts läßt auf eine interne Schnittstelle für Eco RI- oder Xho I-Restriktionsendonukleasen schließen. Daher wurden im Anschluß zwei Restriktionsansätze, zum einen mit der Endonuklease Eco RI und zum anderen mit Xho I, angesetzt. Zur Überprüfung der in der
Partialsequenz vorausgesagten Pst I-Schnittstelle wurde parallel noch ein Pst I-Restriktions-verdau vorbereitet. Um die Homogenität der CE11 cDNA-Präparation zu kontrollieren wurde auf das Agarose-Gel außerdem ein aus 1 µl CE11-Plasmid und 19 µl aqua bidest. bestehender Probeansatz aufgetragen. Anhand der elektrophoretischen Trennung des ungeschnittenen Plasmids kann auf die Homogenität der Präparation geschlossen werden- je nachdem ob nur eine oder mehrere Banden im Gel vorhanden sind. Anhand des Vergleichs von ungeschnittenem Plasmid mit den Banden des geschnittenen Plasmids kann dann abgeschätzt werden, wie vollständig die Restriktionsenzyme geschnitten haben. Mehrere Banden oder eine sichtbare Schlierenbildung im Agarose-Gel würde auf Verunreinigungen mit anderen cDNAs oder Degradation innerhalb der cDNA hindeuten.
Abb. 1: Restriktion der in pBluescript ligierten CE11 cDNA. 1% Agarose-Gel.
M =
Nach der elektrophoretischen Auftrennung (siehe Abb.1) zeigt der Eco RI-Dau eine Linearisierung des Plasmids, d.h. es ist keine Eco RI-Schnittstelle innerhalb des Insert vorhanden. Bei dem Xho I- und dem Pst I-Dau zeigen sich auf dem analytischen Agarose-Gel jeweils zwei Banden. Diese Zweiteilung läßt auf eine interne Schnittstelle für Xho I und eine zweite interne Schnittsstelle für Pst I schließen. Durch diese zweite Schnittstelle für das jeweilige Restriktionsenzym wurde ein Teilstück des Inserts aus dem Vektor-Insert-Fragment ausgeschnitten, zurück blieb der linearisierte Vektor mit dem Rest des Insert. Der Probeansatz läuft als einheitliche, gut abgesetzte Bande, was auf eine gute Qualität der Plasmid-DNA schließen läßt.
p Bluescript SK
+/-3´
T7 - Kpn I
Xho I 5´
Pst I Bam HI
-T3
Pst I Xho I
CE11-1000 CE11-350
Eco RI
Abb. 2: Restriktionskarte des in pBluescript ligierten CE11 cDNA-Klons mit den neu gewonnenen Ergebnissen der Restriktionsanalysen.
4.3.1 Subklonierung des CE11-Klons
Die zuvor gewonnenen Ergebnisse des Restriktionsverdaus wurden im Anschluß zur Subklonierung des CE11-Klons eingesetzt. Für die Subklonierung wurden die Restriktionsendonukleasen Pst I und Xho I gewählt, da für beide Enzyme eine Schnittstelle in
der Polylinker-Site des Plasmids und zusätzlich eine interne Schnittstelle innerhalb des Inserts vorliegt. Dadurch wurde ein Teil des Inserts herausgeschnitten, der andere Teil verblieb am Vektor, der anschließend religiert wurde.
Je 1 µg der CE11 Plasmid-DNA wurde mit Xho I und in einem zweiten Ansatz mit Pst I gedaut und in einem 1% Agarose-Gel elektrophoretisch aufgetrennt. Die bei ca. 3,3 kb (Xho I-Restriktion) bzw. 4,0 kb (Pst I-Restriktion) liegende Vektor/Insert Bande wurde aus dem präparativen Agarose-Gel ausgeschnitten und die DNA eluiert. Es folgte die Religation des Vektor/Inserts. Der religierte Vektor wurde in E. coli XL1-blue Zellen vermehrt und die Plasmid-DNA im Anschluß mit Hilfe einer sog. Midipräparation isoliert. Die Subklone bekamen, entsprechend der erwarteten Länge ihrer Inserts, die Namen: CE11-1000 (Subklon aus CE11 Pst I geschnitten) und CE11-350 (Subklon aus CE11 Xho I geschnitten).
Im Anschluß wurde ein analytischer Restriktionsverdau zur Überprüfung der cDNA-Insertlänge des subklonierten CE11 durchgeführt. Der Restriktionsverdau erfolgte bei CE11-1000 mit Bam H I/Kpn I und bei CE11-300 mit Eco R I/Xho I. Die Vektoren enthielten das entsprechende cDNA Insert mit einer Länge von 1000 bzw. 350 bp.
4.3.2 Sequenzanalyse des CE11-Klons
Die als Auftrag von MWG-Biotech durchgeführte Sequenzanalyse der CE11-Plasmid-DNA lieferte eine aus insgesamt 1426 Basenpaaren bestehende Nukleotidsequenz (siehe Abb. 3).
An Position 1406-1411 weist die Sequenz ein Polyadenylierungssignal auf, dem 15 Nukleotide später ein Poly-(A)+-Schwanz folgt. Es konnte keine Signalpeptid-kodierende Sequenz identifiziert werden. Keines der in der Nukleinsäuresequenz vorhandenen ATG-Basentriplets konnte als Startcodon festgelegt werden, da das Leseraster jedesmal schon nach wenigen Nukleotiden wieder durch ein Stopcodon beendet wurde. Die Ergebnisse der Sequenzanalyse lieferten damit keinen Hinweis auf ein offenes Leseraster und über die putative Proteinstruktur oder mögliche Funktionen des CE11 Transkripts. Es lag die Vermutung nahe, daß dem cDNA-Klon noch ein großer Teil der Sequenzinformation des 5´-Bereichs fehlt.
GAATTCGGCA CGAGCTCAGA CAAGCAGAGC GTGCAGGGGC TGCACCCCCC ATCTCCCGGG 60 AAAGCCAAGC CCCGGAGAAC GATCATCGCC CTGCTCTTTC TGGGTGCCAT CGTATATGAC 120 CTGGCAGTAG TGGGCACAGT GGACGTGATG CCCCTTTTCG TGCTAAGGGA GCCTCTCAGT 180 TGGAACCAAG TGCAGGTGGG CTATGGCATG GCTGCAGGGT ACACCATCTT CATCACCAGC 240 TTCCTGGGCG TCCTGGTCTT CTCCCGCTGC TTCCAGGACA CACCATGATC ATGATCGGTA 300 TGGTCTCTTT TGGGTCAGGA GCCCTCCTCT TGGCTTTTGT GAAAGAGACA TACATGTTCT 360 ACATTGCTCG AGCCGTCATG CTGTTCGCTC TCATCCCTAT CACAACCATC CGGTCAGCAA 420 TGTCCAAACT CATAAAGGGC TCCTCTTATG GAAAGGTGTT CGTCATCCTG CAGCTGTCCC 480 TGACTCTGAC GGGGGTGGTG ACATCCACGG TGTACAACAA GATCTATCAG GTCACCATGG 540 AAAAGTTCAT CGGCACCTGT TTTGCTCTCT CCTCCTTCCT CTCCTTCCTG GCAATCATCC 600 CGATTGGCAT CGTGGCCTAC AAACAAGCCT CGTGGTTGCA ATATGGAGAC GTCAGGGAGA 660 CGTGAAGGTT CTGGCCTACA GGAGCTGCGA ACACCAGCAA CGGTGGAGCC CCTTTGAAGG 720 CAAAGGAAGG GACTGGGTGC TGGCGACCGG AGCCACCCAC GGCCCCCCGA AGCCCCAAGT 780 TCCAGCCAGA GTTGGCCTCG GAATGACCTG CTCTGGCTCA GGGCTCCCTG GTGGGTGGGG 840 AACAGCACTT TCTTGGTGAT AGAAGAATTT TCTCAGCTTT TGGATGTCCC TGCTAGACAG 900 AGGTTGGGTT CTGGGGACAG TAAAGTATGG CCTTTCAGGG GTTATACACC GGCTGCATAC 960 ACAGTCATGC CAGACACACA AAGGGCTTCA GACGGCAGCC CCCTTTCTTG CGGGAGTTGT 1020 CCCCAGGGCT CCAAGACACG ACTAGTCATC TGGGTGCTGC GCTGGGAGCC CCACAATGAA 1080 AACTCAAACC AAAGCACACA TTTTCAACAG CCTAAGGGGA ACCCAGAGGG GGTGTTTTAT 1140 AAGAACTCCC AATGTTTTGG AAGATTTTGG GGCTCGGGCT CTTGGATTCA GGGTACTTTT 1200 ATTGCTCTTG TTACTGTTGC TTATAAGAGG CAAATATCAA AAGACTTTCT TCAGTGGAAT 1260 AGAATATTGA GTATTTTCAG CCAATGATAC TTTCAAAGTG GGTGGTGTGA AAGGAGAGAG 1320 GAGATATGCC AAGAGCCATT TTATTTGGAG GTCCCTATTT TTATAGCCTA TTTNACTTAC 1380 ATCTAGAAAA GCAGACTCAC TTCCAAATAA AATCGACATT TATTGT (A)n
Abb. 3: Nukleotidsequenz der CE11 cDNA. Die Zahlen am rechten Rand geben die
durchgehende Nummerierung der Nukleotide an. Das Polyadenylierungssignal (AATAAA) ist unterstrichen.
4.3.3 Northern Blot-Analyse zur gewebespezifischen Genexpression und zur Größenbestimmung des CE11-Transkripts
Um die gewebespezifische Genexpression und die Länge der CE11 mRNA zu untersuchen, wurde ein Northern Blot mit Gesamt-RNA-Extrakten von caninem Nebenhoden und möglichst vielen caninen Vergleichsgeweben hergestellt und mit Digoxigenin-markierten CE11 und CE1 cDNA-Sonden hybridisiert (siehe Abb. 4). CE1 wurde als Vergleichssonde verwendet, da für CE1 eine Expression in mehreren der aufgetragenen Hundegeweben bekannt war, und man so eine Referenzgröße für die Qualität der Hybridisierung zur Verfügung hatte. Aufgrund der unterschiedlichen Größe der beiden Transkripte war eine Überlagerung der Signale nicht zu befürchten.
Ly Mu Zw Mi Lu Le Ov Ho NH2 NH1
-CE 11
-CE 1
-28S
-18S
Abb. 4: Northern Blot-Analyse der Expression von CE11 und CE1 in verschiedenen Hundegeweben. Pro Spur wurden 5 µg Gesamt-RNA von caninem Lymph- (Ly), Muskel-(Mu), Zwerchfell- (Zw), Milz- (Mi), Lungen- (Lu), Leber- (Le), Ovar (Ov), Hoden- (Ho) und Nebenhodengewebe (NH) geladen und gleichzeitig mit der Digoxigenin-markierten CE 11 und CE 1 cDNA-Sonde hybridisiert. Zur Überprüfung der Intaktheit einer, in früheren Untersuchungen gewonnenen Gesamt-RNA Präparation eines Hundenebenhodens (NH2), wurden zwei Spuren mit Gesamt-RNA von caninem Nebenhodengewebe beladen.
Gleichmäßige Beladung und Integrität der ribosomalen RNA (28S und 18S) wurden überprüft (unteres Bild).
Nach einer Expositionszeit von einer Stunde lieferte das CE11-Transkript ein deutliches Signal ausschließlich im Nebenhoden. Es sind zwei Banden zu erkennen, eine Bande liegt bei etwa 2,8 kb und eine etwas stärkere Bande bei 2,5 kb. Ob es sich hierbei um alternative Spleißprodukte oder CE11-verwandte mRNAs handelt, ist nicht geklärt. Die auf dem Ethidiumbromid-gefärbten Formaldehyd-Gel im unteren Bild zu erkennende Schlierenbildung auf Höhe der Spur der Nebenhoden 2 Gesamt-RNA läßt auf eine Degradierung derselben schließen. Als Folge hiervon ist auf dem Northern Blot erwartungsgemäß kein CE11-Signal im Nebenhoden 2 zu erkennen. Alle übrigen RNAs waren intakt.
Bei zweistündiger Exposition des Films (hier nicht dargestellt) war nach Hybridisierung mit der CE11-Sonde auch im caninen Hoden eine ebenfalls zweigeteilte Bande zu sehen.
Vergleicht man das Hybridisierungssignal des Hodens mit dem im Nebenhoden, so ist die Intensität des Signals im Nebenhoden augenscheinlich etwa zehnmal so stark wie das Signal im caninen Hoden. In den anderen Vergleichsgeweben war auch nach der Überexpression des Films kein Signal festzustellen.
Das CE1-Transkript lieferte nach einer Expositionszeit von 1h ein deutliches Hybridisierungssignal in Nebenhoden, Hoden und Lunge. Verlängert man die Expositionszeit auf 2 h, so ist außer im Muskel in allen aufgetragenen Geweben eine Bande sichtbar, wobei das Hybridisierungssignal im Nebenhoden erwartungsgemäß am kräftigsten ist. Die Signalstärke nimmt in der Reihenfolge Hoden, Lunge, Lymphgewebe, Milz und Leber immer weiter ab und ist im Ovar und Zwerchfell nur noch als sehr schwache Bande detektierbar.
Ein Vergleich zwischen der im CE11 cDNA-Klon enthaltenen Sequenzlänge von 1426 bp und der anhand halblogarithmischer Größenbestimmung der Hybridisierungssignale ermittelten Länge der kreuzhybridisierenden mRNA von > 2.5 kb zeigt, daß noch mindestens 1 kb Sequenzinformation im 5´-Bereich unbekannt sind. Da diese im CE11 cDNA-Klon aus der Nebenhodenbibliothek von K. Ellerbrock (1994) nicht enthalten sind, handelt es sich hierbei offensichtlich nicht um einen „full length“ Klon. CE11-Klone mit weiter in den 5´-Bereich hineinreichende Sequenzen wurden nicht gefunden.
4.3.4 Computergestützte Suche nach homologen Sequenzen zu CE11
Die Suche nach ähnlichen Sequenzen in der Datenbank erfolgte mit Hilfe des BlastN/P Computerprogramms (NIH, Washington, USA). Gibt man die Nukleinsäuresequenz des CE11-Klons zum Vergleich in die Maus-EST Datenbank ein (BLAST, ALTSCHUL et al., 1997), so werden sieben Mäuse-Klone mit einer Identität von über 70% aufgezeigt. Bei einem Vergleich der CE11 cDNA mit diesen sieben Maus-Sequenzen, zeigten vor allem die unter der Nummer W12948 (= Me 111), AA856376 (=Me112) und AA930029 (=Me113) in der Maus-EST Bank registrierten Klone große Sequenz-Übereinstimmung mit dem CE11-Klon (siehe Abb.5).
Ebenfalls erfolgreich verlief die Suche nach CE11 Homologen beim Mensch mit Hilfe des elektronischen Screenings von humanen EST-Banken (Adams et al. 1995). In einer nicht öffentlich zugänglichen Datenbank existiert ein Klon aus der Lunge des Menschen, der auf Nukleinsäureebene eine 94% Identität mit dem CE11-Transkript aufweist.
Bei einem “Alignment” der CE11-Sequenz mit der homologen HE11-Sequenz (hier nicht dargestellt) und den Maus-Sequenzen aus der öffentlichen EST-Datenbank fiel auf, daß sowohl die Mäuse-Klone Me111, Me112 und Me113 als auch der Mensch zwischen Position 281 und 282 der CE11 cDNA zusätzlich die Base Cytosin (C) enthalten. Fügt man das Cytosin an entsprechender Stelle in die CE11 cDNA ein, so erhält man eine Sequenz mit einem offenen Leseraster von 516 bp, die für 172 Aminosäuren kodieren. Bei Hydrophobitätsanalysen (in dieser Arbeit nicht dargestellt) nach Kyte-Doolitle mit der so entstandenen „neuen“ Proteinsequenz wurden sechs hydrophobe Regionen angezeigt. Diese ließen die Vermutung eines Transmembrandomänen-Proteins mit multiplen membranumspannenden Domänen aufkommen. In dem vorausgesagten Protein war außerdem eine Konsensus-Sequenz (Asn-X-Ser/Thr) für eine mögliche N-Gykosylierung vorhanden (ScanProsite).
Bei allgemeinen BlastP-Vergleichen mit der, nach Einfügen des Cytosin erhaltenen “neuen“
Proteinsequenz wurden u.a. Ähnlichkeiten mit einem hypothetischen Protein des Kaninchens (Identität 27%) und verschiedenen Tetrazyklin Resistenz Proteinen (Identität zwischen 18-25%) angezeigt. Das hypothetische Protein des Kaninchens wird ausschließlich im Darm erwachsener Kaninchen (nicht im Darm juveniler Kaninchen) exprimiert und ist für die
enzymatische Verdauung bestimmter Nahrungsbestanteile des Futters verantwortlich, die nicht in der Milch säugender Häsinnen vorhanden sind.
Die aus den “Alignments” und den Computeranalysen gewonnenen Ergebnisse sprachen dafür, daß CE11 an oben aufgeführter Position tatsächlich ein zusätzliches Cytosin eingeschoben hat. Es bestand der Verdacht, daß die durch MWG ermittelte Nukleinsäuresequenz einen Sequenzierfehler enthielt, oder daß das „fehlende“ C das Ergebnis einer Basen-Deletion innerhalb des CE11 cDNA-Klons war.
4.3.5 Ergebnisse zur eigenen Sequenzanalyse nach der Didesoxy-Methode nach Sanger
Aufgrund dieser Vermutung wurde der betreffende Sequenzbereich nochmals mit der Didesoxy-Methode nach Sanger radioaktiv sequenziert, um so einen evtl. vorhandenen Sequenzierfehler auszuschließen. Dabei wurde von beiden Seiten, ausgehend von der Vektorsequenz, in die einklonierte Sequenz “hinein gelesen“. Um auch von der 3´-5´-Richtung bis an die gewünschte Stelle vordringen zu können, wurde für die Sequenzreaktion der CE11-350 Subklon (siehe Kap. 4.3.1) eingesetzt. Die eigenen, anhand der Autoradiographie der Sequenzgele erhaltenen Daten wurden von Hand in das „DNA-Star“-Software-Programm eingegeben und mit den von MWG-Biotech ermittelten CE11-Sequenzdaten verglichen. Obwohl der relativ kurze CE11-350 Subklon eingesetzt wurde und die Laufzeit der Elektrophorese von etwa 3 h im ersten Versuchsansatz auf eine Laufzeit von 6 h im zweiten Versuchsansatz erhöht wurde, war es nur möglich ausgehend vom 5´-Ende bis in den gewünschten Bereich vorzudringen. Bei Vergleich der Sequenzdaten zeigte sich in dem für uns interessanten Sequenzbereich absolute Übereinstimmung zwischen der von uns ermittelten Sequenz und den MWG-Daten (siehe Abb. 6). Damit konnte der Verdacht einer fehlerhaften Sequenzierung zwar ausgeräumt werden, es besteht aber weiterhin die Vermutung, daß eine Punktmutation zum Verlust des Leserasters geführt haben könnte.
Anders ist der Unterschied zu den nahe verwandten cDNAs von Maus und Mensch nicht ohne weiteres verständlich.
10 20 30 40 50