5 Diskussion 5.1 Arbeitsziel
5.8 CE12, ein neuartiges Fibronektin-Typ-II-Protein des caninen Nebenhodens
Bei den in der CE12-Klonfamilie zusammengefassten cDNA-Klone CE12a und CE12b handelt es sich wahrscheinlich um zwei durch alternatives Spleißen einer prä-mRNA enstandene, Varianten eines Gens. Beim alternativen Spleißen werden die für die reife mRNA kodierenden Exons nicht nach einem festen Schema aneinandergereiht, sondern auf unterschiedliche Weisen gespleißt. Dadurch entstehen aus einer prä-mRNA verschiedene, reife mRNAs, die für verwandte, aber unterschiedliche Proteine kodieren können (KNIPPERS, 1997). Das Vorhandensein polymorpher mRNAs wurde anhand der Northern Blot Analysen bestätigt, bei der zwei, zum Teil auch drei kreuzhybridisierende CE12-mRNA Banden mit einer Länge zwischen 1.0-1.5 kb identifiziert wurden. Eine andere Ursache für die Expression verschieden langer CE12-mRNAs besteht in der Möglichkeit zur alternativen Nutzung der beiden Polyadenylierungssignale. Da auf den Röntgenfilmen der Northern Blot Analysen zum Teil auch mehr als zwei Banden gefunden wurden, könnten neben CE12a und CE12b eventuell noch weitere Spleiß-Varianten existieren.
Anhand der Northern Blot-Untersuchungen wurde bestätigt, daß die CE12-mRNA ausschließlich im caninen Nebenhoden und in keinem anderen der untersuchten Gewebe des
Hundes exprimiert wird. Die Northern Blot-Analyse zur gewebespezifischen Expression der CE12-homologen mRNA im Nebenhoden des Rindes unterstreicht die Vermutung, daß es sich bei den CE12-homologen mRNAs der anderen Spezies ebenfalls um nebenhodenspezifische Genprodukte handelt. Die in situ-Transkript-Hybridisierung bestätigt, daß die CE12 mRNA ein Produkt des Nebenhodenepithels mit Expressionsmaximum im Corpus epididymidis ist. Die Färbung im intertubulären Bindegewebe war auf Hintergrundniveau beschränkt.
Bei den von der CE12a und CE12b cDNA-Sequenz abgeleiteten Proteinen handelt es sich um neuartige hochkonservierte Fibronektin-II-Modul-Proteine des caninen Nebenhodens, welche eine strukturelle Ähnlichkeit zu den Heparin-bindenden Proteinen aus dem Seminalplasma der Huftiere (BSPs, HSP-1, HSP-2, und pB1) aufweisen. Die Mitglieder dieser eng verwandten Proteinfamilien aus dem Seminalplasma von Rind, Pferd und Schwein sind durch zwei, in einem homologen Wiederholungsmuster angeordnete Fibronektin-Typ-II-Domänen gekennzeichnet. Die hypothetischen CE12-Proteine sind im Vergleich zu den Proteinen der Huftiere wesentlich größer und verfügen über vier solcher Domänen, die ebenfalls in einem charakteristischen Wiederholungsmuster hintereinander angeordnet sind. Da in der Literatur bisher noch keine Proteine mit vier Fibronektin-Typ-II-Domänen beschrieben wurden, handelt es sich bei den hypothetischen CE12-Proteinen um die ersten dieser Art. Die charakteristische Tandem-Anordnung der Fibronektin-II-Module könnte funktionell der Tendenz entsprechen, Oligomere zu formen, wie dies für die Phospholipid-bindenden BSP-Proteine und eine Reihe anderer Lipid-bindender BSP-Proteine beschrieben wurde (GASSET et al., 1997; YONG et al., 1995).
Es fällt auf, daß die zwei Fibronektin-II-Module von CE12, die dem N-Terminus am nächsten sind, die größte Ähnlichkeit zu den Seminalplasmaproteinen der Huftiere zeigen, wohingegen die zwei anderen Module eher dem Fibronektin-II-Modul der Gelatinase und des Hagemann Faktors ähneln (SAALMANN et al., in Vorbereitung).
Die Hypothese, daß es sich bei CE12 um eine evolutiv hochkonservierte mRNA handelt, wurde durch die Klonierung der homologen cDNA aus dem Nebenhoden des Pferdes und die Identifizierung und Sequenzierung des Human-Homologen EST-Klons HE12 bestätigt. Beide verfügen über eine hohe Sequenzhomologie zu CE12 und kodieren ebenfalls für ein hypothetisches Protein mit vier Fibronektin-Typ-II-Domänen. Im Gegensatz zur polymorphen CE12 cDNA handelt es sich bei HE12 um eine mRNA, die nur in einer Variante mit einer
Länge von ca. 1.1 kb exprimiert wird. Durch die Amplifizierung und Sequenzierung von Eq12 wurde außerdem bestätigt, daß es sich bei der für die vier Fibronektin-II-Module kodierende CE12 cDNA nicht um ein, bei der Erstellung der Nebenhodenbibliothek enstandenes, Artefakt handelt.
Da die BSP-Proteine Sekretprodukte der Samenblase sind, und der Hund über keine Samenblase verfügt, könnte die Produktion von Proteinen, die in struktureller und/oder funktioneller verwandtschaftlicher Beziehung zu den Sekretproteinen der Samenblase stehen, vom Nebenhoden übernommen werden. Anhand der Klonierung von Eq12 konnte jedoch gezeigt werden, daß beide Proteinfamilien (solche mit zwei und solche mit vier Fibronektin-Typ-II-Domänen) auch nebeneinander in verschiedenen Geweben des männlichen Genitaltraktes exprimiert werden können. Aufgrund dessen ist es möglich, daß beim Mensch neben der vermutlich aus dem Nebenhoden stammenden HE12 cDNA, auch in der Seminalblase noch andere, bisher unbekannte Fibronektin-Typ-II-Domänen tragende Proteine exprimiert werden. Andererseits besteht die Vermutung, daß auch im Nebenhoden von Rind und Schwein Proteine mit vier Fibronektin-Typ-II-Domänen produziert werden, da bei der Northern Blot-Analyse zur evolutiven Konservierung der CE12 mRNA im Nebenhoden von Rind und Schwein CE12-homologe mRNAs detektiert wurden. Die Möglichkeit einer Kreuzhybridisierung von CE12 mit den schon bekannten BSP-Proteinen und pB-1 ist unter den in dieser Versuchsreihe verwendeten hoch stringenten Bedingungen ausgeschlossen, da die Sequenzidentität auf Aminosäurenebene zwischen CE12A und BSP-A1, -A2, -A3 und pB-1 zwischen 45-50% liegt.
Es bleibt die Frage nach der funktionellen Bedeutung von CE12. Aufgrund der vor allem im Bereich der ersten beiden Fibronektin-Typ-II-Domänen vorhandenen strukturellen Ähnlichkeit zu den BSP-Proteinen könnten die vorausgesagten CE12-Proteine über ähnliche Eigenschaften verfügen. Durch in vitro-Studien wurde bestätigt, daß jede Domäne der BSP-Proteine eine potentielle multifunktionelle Bindungsstelle für verschiedene Liganden darstellt.
Anhand dieser multiplen Bindungsstellen besitzen die Proteine neben ihrer Fähigkeit Phospholipide zu binden, die Möglichkeit auch an Heparin, Fibrinogen, Lipoprotein A-I und HDL zu binden. Die funktionelle Bedeutung der BSP-Proteine wurde erst kürzlich von THÉRIEN et al. (1999) zusammenfassend dargestellt: Während der Ejakulation binden die BSP-Proteine durch Interaktion mit den Phospholipiden der Plasmamembran an die Spermienoberfläche. Sie sind an der Umverteilung der Lipidkomponenten der
Spermienmembran während der frühen Schritte der Kapazitation beteiligt und stimulieren die Entfernung von Cholesterin und Phospholipiden aus der Plasmamembran des ejakulierten Spermiums. Die Entfernung der schützenden Lipidkomponenten von der Spermienoberfläche führt zu einer Destabilisierung der Membran. Gleichzeitig wird das Spermium mit BSP-Proteinen umhüllt, welche durch Interaktion mit den Kapazitationsfaktoren HDL und den heparinähnlichen Glykosaminoglykanen die Kapazitation durch zwei verschiedene Mechanismen vorantreiben: Zum einen kann der stimulierende Effekt des Heparins auf die Kapazitation durch die Bindung von Heparin an die, auf der Oberfläche der ejakulierten Spermien befindlichen, BSP-Proteine auf das Spermium übertragen werden. Es kommt zu einer Steigerung des intrazellulären pH-Wertes sowie einer Erhöhung des intrazellulären Ca+ -und cAMP-Levels. Zum anderen wird durch die BSP-vermittelte Bindung von HDL an die Spermienoberfläche eine zweite Welle der Cholesterinentfernung von der Spermienmembran im weiblichen Genitaltrakt ausgelöst. Da dem Cholesterin eine stabilisierende Wirkung auf die Spermienmembran zugesprochen wird, könnte dessen Entfernung eine weitere Reorganisation und/oder Destabilisierung der Membranoberfläche bewirken und so einen induzierenden Effekt auf die Kapazitation ausüben oder auf diese Weise selbst am Kapazitationsvorgang beteiligt sein.
Da auch die Funktionen der anderen in enger struktureller Beziehung zu CE12 stehenden Fibronektin-bindenden Proteine des Seminalplasmas (HSP1, HSP-2 und pB-1) noch auf Vermutungen basieren, bleibt auch die Funktion des hypothetischen CE12-Proteins vorerst spekulativ. Aufgrund der vier Fibronektin-Typ-II-Domänen verfügen das hypothetische CE12-Protein jedoch mit großer Wahrscheinlichkeit über multiple Bindungsmöglichkeiten.
Es könnte daher unter anderem an die Oberfläche des epididymalen Spermiums binden und an der posttestikulären Umstrukturierung der Spermienmembran beteiligt sein. Eine Spermienbindung würde auch einen Hinweis auf die Ausübung einer Schutzfunktion gegenüber äußeren Einflüssen geben. Durch die Möglichkeit Heparin zu binden, wäre auch eine Beteiligung an dem Vorgang der Kapazitation, wie es oben für die BSP-Proteine beschrieben wurde, wahrscheinlich.
5.9 Ausblick
Zukünftige Versuche zur weiteren Charakterisierung des CE11-Transkripts sollten das Ziel verfolgen, neue, möglichst vollständige CE11-Klone zu gewinnen, um so die noch fehlende Sequenzinformation im 5´-Bereich der Nukleinsäuresequenz zu entschlüsseln, und das Rätsel um das hypothetisch vorhandene Cytosin zu enthüllen. Diese Ergebnisse könnten dann Hinweise auf die Funktionen des abgeleiteten CE11-Proteins liefern. Außerdem sollte geklärt werden, ob dem in der menschlichen Lunge identifizierten HE11-Klon aus der EST-Datenbank tatsächlich eine mRNA des humanen Nebenhodens entspricht.
In Bezug auf CE12 und die neue Familie der Fibronektin-Typ-II-Proteine werden am IHF in Hamburg zur Zeit schon weiterführende Versuche unternommen, die sich unter anderem mit der Identifizierung der im 5´-Bereich vermuteten, unbekannten Sequenzinformation beschäftigen. Desweiteren sollen polyklonale Antikörper einen Nachweis über das Vorhandensein des Proteins im Nebenhoden liefern. Ein besonderes Interesse liegt dabei in der Aufklärung der Frage, ob CE12 wie die Heparin-bindenden Proteine aus dem Seminalplamsa von Rind und Pferd auch an die Spermienoberfläche des Hundes assoziiert sind, und so den Prozeß der Kapazitation beeinflussen können. Ebenso muß geklärt werden, ob auch im Nebenhoden von Rind und Schwein Proteine mit vier Fibronektin-Typ-II-Modulen produziert werden. Eine überaus interessante Frage ist auch, ob im Genitaltrakt des Rüden Proteine existieren, die in genetisch-verwandtschaftlicher Beziehung zu den BSP-Proteinen stehen, oder ob CE12 beim Hund die entsprechenden Aufgaben der BSP-Proteine übernimmt.
Man geht mittlerweile davon aus, daß die Physiologie der Spermienreifung im Nebenhoden innerhalb der Säuger in gewissen Bereichen zwischenartlich konserviert ist. Daher können die anhand des Hunde-Nebenhodenmodells gewonnenen Ergebnisse zum Teil auf den humanen Nebenhoden übertragen werden. Der Hunde-Nebenhoden wird schon seit einigen Jahren erfolgreich als Modell zur Erforschung der epididymalen Vorgänge auf molekularbiologischer Basis eingesetzt und stellt mittlerweile ein in diesem Bereich international anerkanntes Modell dar (IVELL et al., 1998). Er trägt so zu einem besseren Verständnis und zur Aufklärung der posttestikulären idiopathischen Infertilität des Mannes bei.
Daneben können die am Hundenebenhoden gewonnenen Erkenntnisse auch bei der Suche nach einem nicht-hormonellen Kontrazeptivum für den Einsatz am männlichen Tier verwendet werden. Das Ziel wäre z.B. eine Immunisierung, die durch selektive Antikörperbildung dazu führt, daß im männlichen Genitaltrakt keine befruchtungsfähigen Spermien heranreifen können.
Die Forderung nach einer sicheren, effektiven und kostengünstigen Wachstumskontrolle der stetig wachsenden Population herrenloser Hunde und Katzen in vielen Ländern macht die Forschung auf diesem Gebiet auch für die Tiermedizin interessant. Aber auch in der Alltagspraxis wünschen die Tierbesitzer oft eine Methode der Kastration, die nicht wie die Gonadektomie das potentielle Risiko einer Operation in sich birgt. Der Vorteil einer immunologischen Kastration wäre von Seiten der Tierbesitzer auch die eventuell mögliche Umkehrbarkeit des Vorganges.
6 Zusammenfassung
Ziel der vorliegenden Arbeit war die Charakterisierung zweier neuartiger epididymaler mRNAs, CE11 und CE12. Es gelang für beide Transkripte, die in den cDNA-Klonen aus der Nebenhodenbibliothek von K. ELLERBROCK (1994) enthaltene Sequenzinformation vollständig zu entschlüsseln.
Durch Northern Blot-Analysen wurde die Expression der CE11 und CE12 mRNA im caninen Nebenhoden nachgewiesen. Ein Vergleich mit verschiedenen Kontrollgeweben zeigte, daß der Nebenhoden den Hauptexpressionsort darstellte.
Bei der Untersuchung der regionenspezifischen Expression innerhalb des caninen Nebenhodens wurde für die CE11 mRNA mit Hilfe der Northern Blot-Analyse eine distale Expression im Corpus und der Cauda epididymidis, sowie dem Ductus deferens nachgewiesen. Die in situ-Transkript-Hybridisierung mit der CE11 cRNA-Sonde zeigte eine Expression in den Epithelzellen des gesamten Nebenhodens auf, wobei jedoch auch hier der Schwerpunkt der Expression im Corpus und der Cauda epididymidis lag. Durch Northern Blot-Analyse und in situ-Transkript-Hybridisierung konnte nachgewiesen werden, daß die CE12 mRNA überwiegend in den Epithelzellen des Corpus exprimiert wird.
Auf der Suche nach homologen mRNAs bei anderen Säugerarten wurden unter Einsatz der CE11-Sonde kreuzhybridisierende Transkripte im Nebenhoden von Schwein, Pferd, Kaninchen und Rhesusaffe detektiert. CE12-homologe mRNAs konnten bei Pferd, Rind, Schwein, Rhesusaffe und Mensch identifiziert werden. Im Nebenhoden des Pferdes wurde durch RT-PCR, Klonierung und anschließende Sequenzierung die Expression eines CE12-homologen Transkripts nachgewiesen. Mit Hilfe des elektronischen Screenings einer humanen EST-Bank gelang es, einen humanen cDNA-Klon mit signifikanter Ähnlichkeit zu CE12 zu identifizieren.
Weder bei dem CE11- noch bei dem CE12-Transkript konnte auf mRNA-Ebene eine altersabhängige Expression beobachtet werden. Die Northern Blot-Analysen enthüllten jedoch, daß sowohl die CE11 als auch die CE12 mRNA im abdominalen Nebenhoden des hemi-kryptorchiden Rüden in reduzierter Menge vorliegt. Die Abnahme der Expressionsstärke ist besonders im Caput-Bereich auffällig.
Die Nukleinsäuresequenzen der CE11 und CE12 cDNA und die davon abgeleiteten Aminosäuresequenzen wurden mit den in den Datenbanken vorhandenen Sequenzen verglichen. Die CE11 cDNA zeigt signifikante Ähnlichkeit zu humanen und murinen cDNA-Sequenzen, kann aufgrund eines fehlenden Leserasters aber noch keiner bekannten Proteinfamilie zugeordnet werden. Die CE12 cDNA kodiert für ein hochkonserviertes, neuartiges Sekretprotein des caninen Nebenhodens mit vier Fibronektin-Typ-II-Domänen.
7 Summary
Sibylle Münz
Novel epididymis specific mRNAs in the dog
The aim of the present thesis was the characterization of two novel epididymis-specific mRNAs, CE11 and CE12. The identification of the whole sequence information contained within the CE11 and CE12 cDNA clones from the epididymal cDNA libary constructed by K.
ELLERBROCK (1994) was successful.
Northern blot analysis of various tissues from the dog confirmed, that CE11 and CE12 mRNAs were abundant in the canine epididymis, and that this tissue contains the highest level of expression for both mRNAs.
The canine mRNAs CE11 and CE12 were analyzed for their expression pattern along the length of the epididymis. CE11 hybridizing signals, as revealed by Northern blot analysis, were present in the corpus and caput epididymis as well as in the ductus deferens. In-situ hybridization, employing DIG-labelled antisense CE11 cRNA, showed signals in all regions of the canine epididymis with a maximum expression in the corpus and cauda epididymis.
Maximal levels of CE12 mRNA were observed in the corpus epididymis as detected by Northern blot analysis and in-situ hybridization.
The interspecies conservation among mammals was studied by non-radioactive, low stringency Northern blot hybridization. Using the heterologous canine CE11 cDNA probe, cross-hybridisation was found in the epididymis of the boar, stallion, rabbit and monkey.
CE12 cross-hybridizing homologues were found in stallion, bull, boar, monkey and human epididymis. The expression of a CE12 equine counterpart within the epididymis of the stallion could be detected by RT-PCR, followed by cloning and sequencing of the equine cDNA.
A human counterpart with significant sequence homology to the CE12 cDNA clone was identified by screening the EST database.
The mRNA frequency of both transcripts did not appear to correlate with age. Northern blot hybridization however showed that the mRNA frequency of both transcripts is reduced in the abdominal epididymis of the unilateral-cryptorchid dog. Considering the different regions of the canine epididymis, the reduction was most obvious for the Caput region.
Screening the databases, humane and murine cDNA sequences were identified showing significant homology towards the CE11 cDNA. Due to the lack of an open reading frame it is not possible to find any relationships of CE11 to known protein families. The CE12 cDNA describes a novel protein with four tandemly arranged fibronectin type II-modules.
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