3 Material und Methoden
3.2.3 Agarose-Gelelektrophorese von DNA
(SAMBROOK et al., 1989; modifiziert)
Nukleinsäuren sind bei pH 7 negativ geladen. Daher wandern sie in einem elektrischen Feld in Richtung Anode. Läßt man die Elektrophorese in einem Agarose-Gel ablaufen, wandern die Moleküle, abhängig von ihrer Größe und Konformation, unterschiedlich schnell. Je kleiner ein Fragment ist, desto schneller kann es sich durch das Gel bewegen. Ringförmig superhelikale Plasmid-DNA wandert schneller als ringförmig relaxierte DNA (bei der sog.
“nicks” im Doppelstrang vorhanden sind), da sich die dichter gepackte superhelikale DNA wahrscheinlich schneller durch die Poren des Agarose Gels bewegen kann.
Um die Länge der einzelnen Fragmente bestimmen zu können, wurden DNA-Längenmarker mit auf das Gel aufgetragen.
Die Nukleinsäuren können durch den interkalierenden Farbstoff Ethidiumbromid im UV-Licht als sog. Banden im Gel sichtbar gemacht werden.
10 x TAE Laufpuffer: 48,4 g Tris-Base, pH 7,5-8,0 11,42 ml Eisessig
20 ml 0,5M EDTA, pH 8,0 Ad 1000 ml aqua bidest.
10 x DNA Auftragungspuffer: 0,25% Bromphenolblau 0,25% Xylen Cyanol FF 15% Ficoll
Die für ein 1% Gel benötigte Menge Agarose (GIBCO BRL, Life Technologies; Eggenstein) wurde in einem Becherglas eingewogen und mit der entsprechenden Menge einfach konzentriertem TAE-Laufpuffer in der Mikrowelle bis zur Lösung der Agarose erhitzt. Nach Abkühlung auf etwa 70°C wurde Ethidiumbromidstammlösung (10 mg/ml; Sigma, Steinheim) bis zu einer Endkonzentration von 1 µg/ml zugegeben und das Gel auf einen Plastikgelträger (Tray) gegossen. Durch einen Kamm, dessen Zähne in das Gel hineinragen, dieses jedoch nicht durchstechen, entstehen während des Abkühlens Geltaschen zum Einbringen des Probevolumens. Nach Erstarrung des Gels und Entfernung des Kamms wurde der Gelträger in eine Elektrophoresekammer eingelegt und diese mit TAE-Laufpuffer geflutet.
Anschließend erfolgte das Auftragen der Proben, die zuvor mit 1/10 Volumen 10x DNA-Auftragungspuffer versetzt wurden.
Als DNA-Längenmarker wurden der 1 kb DNA-Ladder (GIBCO BRL) und/oder 100 bp DNA-Ladder (GIBCO BRL) verwendet. Die DNA-Längenstandards wurden mit 1/10 Endvolumen, der gleichen Menge 10x DNA-Auftragungspuffer und 4/5 Endvolumen aqua bidest. auf das jeweilige Gel aufgetragen.
Die Elektrophorese wurde bei 70-80 Volt 30-90 Minuten durchgeführt. Anschließend erfolgte die Photodokumentation der DNA-Banden im Gel unter UV-Beleuchtung.
Das beschriebene Verfahren war für präparative und analytische Gele im Prinzip identisch.
Für präparative Gele wurden 100 ml angesetzt und das Gel in einen 15 x 15 cm großen Gelträger gegossen. Minigele für analytische Zwecke wurden in einen 15 x 8,3 cm großen Gelträger gegossen. Das analytische Gel dient der Identifizierung und Längenbestimmung vorhandener DNA-Fragmente, das präparative Gel der nachfolgenden Elution bestimmter restringierter oder in der PCR hergestellter DNA-Fragmente.
3.2.4 Präparation von DNA-Fragmenten durch Elution aus Agarose-Gelen
Um einzelne DNA-Fragmente zu isolieren oder zu reinigen, wurden die Nukleinsäuren in einem präparativen Agarose-Gel elektrophoretisch aufgetrennt und die DNA-Banden auf dem UV-Leuchttisch mit einem Skalpell aus dem Agarose-Gel herausgeschnitten.
Die Elution der DNA aus dem Agarose-Gelstück erfolgte mit Hilfe des QIAquick Gel Extraction Kits (QIAGEN GmbH, Hilden) nach den Angaben des Herstellers:
Das Gelstück wurde gewogen und je 100 mg Gelblock 300 µl QX1 Puffer zum Schmelzen der Agarose zugegeben. Das Reaktionsgefäß wurde dann 10 Minuten bei 50°C inkubiert und zur besseren Lösung des Gelstückes zwischenzeitlich immer wieder gevortext. Anschließend erfolgte das Auftragen der Probe auf die DNA-bindende QIAquick Säule und im Anschluß eine 1 minütige Zentrifugation bei 14000 UpM in der Tischzentrifuge (Centrifuge 5415 C;
Eppendorf, Hamburg). Die DNA wird dabei an die QIAquick Säule gebunden und die überschüssige Flüssigkeit in einem unter der Säule befindlichen Auffanggefäß gesammelt.
Anschließend wurde die Säule mit 0,75 ml Waschpuffer gewaschen und der Durchbruch, nach 1 Minütiger Zentrifugation, verworfen. Um die Trockenheit der Säule zu gewährleisten folgte eine weitere Zentrifugation. Die Säule wurde dann in ein frisches Reaktionsgefäß überführt. Zum Lösen der DNA von der Säule wurden 30 µl aqua bidest. in die Mitte der Säule gegeben. Nach einer Ruhezeit von 5 Minuten wurde 1 Minute zentrifugiert und die gelöste DNA im Reaktionsgefäß aufgefangen.
Die Menge des isolierten DNA-Fragments wurde durch Auftragen eines Aliquots auf ein 1%iges TAE Minigel abgeschätzt. Jeweils 1 µl der gewonnenen Probe und ein DNA-Mengenmarker (Low DNA Mass Ladder; GIBCO BRL) sowie ein Längenmarker (100 bp
Ladder, GIBCO BRL) wurden 1 h bei 80 V auf einen 1% Agarose-Gel elektrophoretisch getrennt und die DNA-Banden anschließend unter UV-Licht sichtbar gemacht und fotografiert.
3.2.5 Restriktionsverdau von DNA
(SAMBROOK et al., 1998; modifiziert)
Restriktionsendonukleasen sind Enzyme, die DNA an einer für jedes Enzym spezifischen Nukleotidsequenz spalten. Die Spaltung der DNA erfolgt an der Phosphorsäure-diesterbindung. Mit Hilfe von Restriktionsenzymen können lange DNA-Molekülketten in definierte, experimentell besser handhabbare Fragmente überführt werden.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden Restriktionsenzyme zur näheren Analyse der Klone, zur Subklonierung, zur Herstellung von Sonden, zur Linearisierung von Plasmiden, für die in situ-Transkript-Hybridisierung und zur Überprüfung verschiedener Versuchsschritte auf analytischen Gelen genutzt.
Die im Handel erhältlichen Restriktionsenzyme sind meist aus Bakterien gewonnene, gereinigte, hochspezifische Enzyme, die in einem Puffer mit 50% Glyzerinanteil vorliegen.
Das Glyzerin verhindert ein für die Enzyme schädliches Gefrieren während der Lagerung bei –20°C. Um eine hohe spezifische Enzymaktivität bei kurzer Reaktionszeit zu erreichen, sind für jedes Enzym optimal passende Enzympuffer notwendig.
Pro Restriktionsverdau wurden auf 1 µg Plasmid-DNA etwa 10 U Enzym, 0,1 Volumen 10-fach konzentrierter Puffer und der entsprechenden Menge aqua bidest. in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß pipettiert. Der Ansatz wurde gemischt und bei 37°C für 3h inkubiert. Nach Zugabe von 0,1 Volumen 10-fach konzentriertem DNA-Auftragungspuffer wurde der Restriktionsverdau auf ein analytisches Agarose-Gel aufgetragen und die DNA-Fragmente elektrophoretisch getrennt.
Diente der Restriktionsverdau dem Herausschneiden bestimmter DNA-Abschnitte (Inserts) im Rahmen der gerichteten Subklonierung in einen anderen Plasmid-Vektor, so wurde die Plasmid-DNA, je nach Vorhandensein entsprechender Restriktionsschnittstellen im Vektor, gleichzeitig mit zwei Restriktionsenzymen geschnitten. Der Ansatz wurde anschließend, nach Zugabe von 0,1 Volumen 10-fach konzentriertem DNA-Auftragungspuffer, auf ein
präparatives Agarose-Gel aufgetragen und die gewünschten Banden nach der Elektrophorese ausgeschnitten.
Die für diese Arbeit verwendeten Restriktionsendonukleasen und ihre Spaltstellen:
(AGS GmbH, Heidelberg;)
Eco RI (Konz.: 20-80 U/µl ) G↓AATTC Pst I (Konz.: 5-20 U/µl ) CTGCA↓G Xho I (Konz.: 10-20 U/µl ) C↓TCGAG Bam HI (Konz.: 10-25 U/µl ) G↓GATCC Kpn I (Konz.: 5-20 U/µl ) GGTAC↓C
3.2.6 Herstellung transformationskompetenter E. coli-Bakterien
Unter Kompetenz versteht man die Fähigkeit von Bakterienzellen, Plasmid-DNA aufzunehmen. In diesen Zustand der Kompetenz werden die Escherichia coli-Bakterien durch eine Behandlung mit Calcium-Ionen versetzt, die die Zellwand für DNA durchlässig macht.
Zur Herstellung kompetenter Bakterien wurden die E.coli Stämme XL1-blue oder DH5α (Stratagene) verwendet.
Transformationspuffer (TB) 3 g PIPES (SIGMA) 2,2 g CaCL2 2 H2O 18,6 g KCl
in 950 ml aqua bidest. lösen, pH auf 6,7 - 6,8 einstellen
10,9 g MgCl2 4 H2O
ad 2000 ml, filtrieren (Porenfilter: 0,22 µm)
SOB-Medium 20 g Bacto Tryptone (Difco, Michigan, USA) 5 g Bacto Yeast Extract (Difco)
2 ml 5M NaCl 1,25 ml 2M KCl
10 ml 2 M Mg++-Lösung (1 M MgCl2+ 1 M MgSO4) ad 1000 ml, autoklavieren
Einige Kolonien einer Bakterien-Übernacht-Kultur auf LB (Luria-Bertani)-Agar wurden in 200 ml SOB-Medium gegeben und unter Schütteln bei 37°C inkubiert. Die Zelldichte wurde regelmäßig mit einem Spektralphotometer (Novaspec, Pharmacia Biosystems, Freiburg) kontrolliert. Bei Erreichen einer optischen Dichte von 0,5-0,6 (die Zellen befinden sich dann in der exponentiellen Wachstumsphase) wurde die Kultur auf Eis abgekühlt. Durch eine Zentrifugation von 10 Minuten bei 4°C mit 4000 UpM wurden die Bakterienzellen pelletiert.
Der Überstand wurde verworfen und die pelletierten Zellen dann in 70 ml eiskaltem TB durch vorsichtiges Pipettieren resuspendiert. Nach einer 10 minütigen Inkubation auf Eis wurde der obige Zentrifugationsschritt wiederholt, der Überstand abgenommen und die pelletierten Zellen in 16 ml TB aufgenommen. Anschließend wurden 1,2 ml DMSO (SIGMA) tropfenweise zugegeben und die Kultur wieder für 10 Minuten auf Eis gestellt. Danach erfolgte die Aliquotierung in 1,5 ml Reaktionsgefäßen. Die gesamte Prozedur wurde auf Eis im Kühlraum vorgenommen und die Aliquots anschließend in Flüssigstickstoff schockgefroren und bei –80°C aufbewahrt.
3.2.7 Ligation von DNA-Fragmenten
(SAMBROOK et al., 1989; modifiziert)
Um Moleküle zu vervielfältigen, baut man sie in ein vermehrungsfähiges DNA-Molekül, den sog. Vektor, ein. Diesen Vorgang bezeichnet man als Ligation. Der Vektor muß die „Passagier“ DNA aufnehmen und sollte mit hoher Effizienz in die Wirtszelle eingeführt werden können. Als Vektoren können Plasmide oder Virus-DNA eingesetzt werden. Plasmide sind natürlich vorkommende, ringförmige, doppelhelikale DNA-Moleküle, die sich unabhängig vom Chromosom der Wirtszelle vermehren können. Der in dieser Arbeit
verwendete pGEM-T Easy Vektor ist ein molekularbiologisch stark modifiziertes Plasmid, das u.a. über multiple Klonierungsschnittstellen (MCS) und ein Ampicillin-Resistenz Gen verfügt.
Für die Ligation von PCR-Produkten wurde das pGEM-T Easy Vektor System (Promega, Mannheim) verwendet. Der pGEM-T Easy-Vektor wird in linearisierter Form, EcoR V geschnitten, mit angehängten 3`T-Überhängen vom Hersteller geliefert. Da die zur PCR eingesetzte TAQ-Polymerase DNA-Fragmente mit A-Überhängen am 3´Ende synthetisiert (siehe Kap. PCR), ist der pGEM-T Easy Vektor mit diesen komplementär.
Die DNA-Fragmente werden mit dem linearisierten Vektor gemischt. Die komplementären Enden beider Moleküle hybridisieren und ein neuer DNA-Ring entsteht. Die offenen Enden der Nukleinsäureketten (5´Phosphatende und 3´OH-Ende) werden mit DNA-Ligase verbunden.
Das molare Verhältnis des einzuklonierenden DNA-Fragmentes (Insert) zum Vektor sollte im Bereich 1:3-3:1 liegen. Hier wurde ein Verhältnis von 3:1 gewählt. Die Konzentration des PCR-Produktes wurde vor Versuchsbeginn unter Zuhilfenahme eines analytischen Agarose-Gels, auf den ein DNA Mass Ladder mit aufgetragen wurde, abgeschätzt. Mit der nachfolgenden Rechnung wurde dann die Menge des eingesetzten PCR-Produktes bestimmt:
Menge des Vektors in ng x kb Größe des Insert x molares Verhältnis Insert:Vektor = ng Insert kb Größe des Vektors
Reaktionsansatz: 5 µl 2x Ligationspuffer
1 µl pGEM-T Easy Vektor (50 ng) x µl PCR Produkt
1 µl DNA Ligase (3 Weiss units/µl) x µl aqua bidest. ad 10µl
Die Reaktion wurde in einem Mikrozentrifugenröhrchen mit den oben genannten Reagentien angesetzt und über Nacht bei 4°C inkubiert.
3.2.8 Religation von Plasmiden im Rahmen von Subklonierungen
Zur Herstellung eines Subklons wurde mit Hilfe eines passenden Restriktionsenzyms ein Teilfragment des Inserts aus dem Plasmid herausgeschnitten. Der Verdau wurde auf ein präparatives Agarose-Gel aufgetragen und der Vektor mit dem anhängenden DNA-Fragment eluiert und wieder religiert.
Reaktionsansatz/Religation: 9 µl linearisierte Plasmid-DNA 10 µl 5x Ligationspuffer (Gibco BRL) 4 µl T4-DNA-Ligase (1 U/µl; Gibco BRL) 27 µl aqua bidest.
Die Reaktion wurde mit den oben genannten Reagentien angesetzt und über Nacht bei 4°C inkubiert.
3.2.9 Transformation von E. coli-Bakterien (SAMBROOK et al., 1989; modifiziert)
Kompetente E. coli-Bakterien können isolierte DNA (hier Plasmid-DNA) aufnehmen. Diesen Vorgang bezeichnet man als Transformation. Die Anwesenheit eines Plasmids in der Wirtszelle und damit den erfolgreichen Abschluß einer Transformation testet man mit Hilfe der Resistenz gegen Antibiotika, die nur den transformierten Wirtszellen das Überleben auf entsprechend zusammengsetzten Nährböden erlauben. Durch den Wachstumstest auf Ampicillin-Agar kann man zwar die untransformierten Zellen eliminieren, jedoch können sich neben dem gewünschten rekombinanten Molekül auch selbstligierte Vektormoleküle (Vektormoleküle, die sich wieder zum Ring geschlossen haben ohne neue DNA aufgenommen zu haben) und falsch rekombinierte Moleküle (DNA-Moleküle, die ein falsches DNA-Molekül z.B. ein weiteres Vektor-Molekül eingebaut haben) vermehren. Die Aufgabe besteht nun darin, die Kolonien mit den gewünschten rekombinanten Plasmiden zu identifizieren. Dazu trägt der Vektor das lacZ´ Gen. Dieses Gen steuert die Synthese eines
Teils der ß-Galactosidase. Die ß-Galactosidase gehört zu einer Reihe von Enzymen, die am Abbau der Lactose zu Glucose und Galactose beteiligt sind. Beim Einklonieren eines Fragmentes wird das lacZ´-Gen des Vektors inaktiviert. Die rekombinanten Bakterien erkennt man daran, daß sie keine ß-Galactosidase mehr synthetisieren können. Zum Test bedient man sich des Lactoseanalogen X-gal, das von der ß-Galactosidase zu einem dunkelblauen Reaktionsprodukt abgebaut wird. Setzt man dem LB-Agar X-gal und IPTG, einen Induktor für das Enzym zu, so sind die Kolonien, die kein Insert enthalten blau gefärbt. Rekombinante Kolonien, bei denen das lacZ´-Gen durch das Insert auseinandergerissen ist, können dagegen keine ß-Galactosidase herstellen, sind also weiß.
Durchführung:
In einem Eppendorfgefäß wurden 5 µl des Ligationsansatzes mit 50 µl auf Eis angetauten kompetenten XL1-Blue oder DH5-α Zellen vereint, vorsichtig gemischt und 20 Minuten auf Eis ruhen gelassen. Es folgte ein Hitzeschock von 90 Sekunden bei 42°C im Wasserbad und sofortiges Wiederabkühlen für mindestens 2 Minuten auf Eis. Anschließend wurde je Ansatz 500 µl vorgewärmtes LB-Flüssigmedium zupipettiert und 1h bei 37°C inkubiert. Während dessen wurden die im Anschluß benötigten LB-Amp Platten (LB/Amp 100 mg/ml, 9 cm Platten) mit je 50 µl 10% X-Gal und 30 µl IPTG (0,5 M) ausgestrichen und 30 Minuten bei 37°C ruhen gelassen. Anschließend wurde der Transformationsansatz auf zwei LB-Amp Platten ausgespatelt und kurz unter dem Abzug angetrocknet. Die Inkubation erfolgte über Nacht bei 37°C.
3.2.10 Midi-Präparation von Plasmid-DNA
Um die durch Ligation und Transformation gewonnenen Bakterien-Kolonien analysieren zu können und in ausreichenden Mengen für weitere Versuche zu gewinnen, wurden die rekombinanten Bakterien in LB-Flüssigmedium herangezogen und die Plasmid-DNA anschließend präpariert. Je nachdem, wieviel Bakterienkultur zur Präparation verwendet wird, spricht man von analytischer Mini- (1-5 ml) oder präparativen Midi- (10-200 ml) oder Maxi-Präparationen (> 200 ml).
Die Midi-Präparation erfolgte mit dem JETSTAR Kit (Genomed, Bad Oeynhausen, August 1994) nach den Angaben des Herstellers.
Von der über Nacht inkubierten LB-Agarplatte wurden mit einem sterilen Zahnstocher einzelne, transformierte Kolonien gepickt und 3 ml LB/Ampicillin (0,1 ng/ml) Flüssigmedium angeimpft. Nach einer Inkubationszeit von 5-8h bei 37°C im Schüttelinkubator wurde die Kultur mit 100 ml LB/Ampicillin Flüssigmedium überimpft und ebenfalls unter Schütteln bei 37°C über Nacht inkubiert.
Am nächsten Morgen wurden die Bakterienzellen durch eine 10 minütige Zentrifugation bei 4000 UpM pelletiert und im Anschluß wieder in 4 ml E1-Lösung (Waschpuffer) suspendiert.
Anschließend wurde der Reaktion 4 ml E2-Lösung (basische Lyse der Bakterienwand) zugegeben und sofort durch Schwenken des Röhrchens gemischt. Nach einer Inkubationszeit von 10 Minuten wurde 4 ml E3-Lösung (Neutralisationslösung, die die Reaktion abstoppt) zugefügt, vorsichtig gemischt und die Zelltrümmer und die chromosomale DNA durch eine 10 minütige Zentrifugation bei 4000 UpM pelletiert. Es folgte die Reinigung der gelösten Plasmid-DNA durch Säulenchromatographie. Die Säule wurde zunächst mit 10 ml E4-Lösung äquilibriert und dann der die Plasmid-DNA enthaltende Überstand auf die Säule gegeben. Die Plasmid-DNA wird während des Durchflusses an die Säule gebunden und erst nach zweimaliger Waschung der Säule mit je 10 ml E5-Lösung durch Zugabe von 5 ml E6 Kochsalz-Lösung wieder aus der Säule eluiert. Die DNA wurde dann durch Zugabe von 3,5 ml 100% Isopropanol und 30 minütiger Zentrifugation bei 4°C und 4000 UpM gefällt. Im Anschluß wurde das Pellet zweimal mit je 1 ml eiskaltem 70% Ethanol gewaschen und dann an der Luft getrocknet. Die Plasmid DNA wurde, je nach Größe des Pellet in 30-100 µl aqua bidest. gelöst und bei –20°C gelagert.
Zur Überprüfung, ob die gewonnenen Plasmide wirklich ein Insert der entsprechenden Größe tragen, wurde das Insert mit den entsprechenden Restriktionsenzymen (meist Eco RI) herausgeschnitten und der Ansatz anschließend auf ein analytisches Agarose-Gel aufgetragen.
3.2.11 Einzelstrang-cDNA-Synthese durch reverse Transkription
RNA-Moleküle sind einzelsträngige Moleküle, die aufgrund ihrer 2´-OH-Gruppe relativ leicht degradiert werden können. Um RNA für die Klonierung oder die Polymerase-Ketten-Reaktion einsetzen zu können, muß sie erst in DNA umgeschrieben werden. Dies geschieht, indem man ihre komplementäre DNA (complementary DNA, copy-DNA, cDNA) synthetisiert. Das Schlüsselenzym für diesen Vorgang ist die reverse Transkriptase. Sie kann an eine Einzelstrang-RNA binden und einen komplementären DNA-Strang synthetisieren.
Der neu entstandene komplementäre cDNA-Strang kann dann z.B. als Template in der Polymerase-Kettenreaktion (siehe Kap. 3.2.12) eingesetzt werden. Ist dieser eine reverse Transkription vorausgegangen, dann spricht man auch von einer RT-PCR (Reverse Transkriptase PCR).
Durch Erhitzen der RNA zu Anfang des Versuchs wird die Sekundärstruktur der RNA aufgelöst, und die RNA wird einzelsträngig. Die reverse Transkriptase benötigt ein kurzes Stück doppelsträngige Nukleinsäure, um die Synthese zu beginnen (“priming“). Daher wird dem Reaktionsgemisch ein komplementäres Oligonukleotid aus Deoxythymidin-Nukleotiden zugefügt. Dieses Oligo(dT) lagert sich an das Komplementär des Poly(A) Ende der mRNA-Matritze an. Auf diese Weise werden aus dem Gesamt-RNA Gemisch nur mRNAs in cDNA umgeschrieben.
Die cDNA wurde unter Verwendung der SuperScript TM II Transkriptase (GIBCO BRL) hergestellt. In einem Mikrozentrifugenröhrchen wurden je Reaktionsansatz 5 µg Gesamt-RNA und 1 µl Oligo(dT)-Primer (500 µg/ml) mit aqua bidest. auf ein Gesamtvolumen von 12 µl aufgefüllt, gemischt und 10 Minuten bei 70°C inkubiert. Anschließend wurde der Ansatz auf Eis gestellt und
4 µl 5 x Erststrangpuffer (GIBCO BRL) 2 µl 0,1 M DTT (GIBCO BRL)
1 µl 10 mM dNTP-Mix (10 mM dATP, dGTP, dCTP und dTTP) zugegeben.
Der Inhalt wurde vorsichtig gemischt, 2 Minuten bei 42°C im Wasserbad inkubiert und im Anschluß sofort 1 µl der SuperScript II Transkriptase (200 units/µl) dazupipettiert. Nach erneuter Inkubation für 50 Minuten bei 42°C erfolgte die Inaktivierung des Enzyms durch ein 15 minütiges Erhitzen des Reaktionsgemisches auf 70°C.
3.2.12 Amplifikation von DNA-Fragmenten mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction = PCR; K.B.MULLIS; 1986)
Mit der Polymerasekettenreaktion kann eine selektive Vervielfältigung (Amplifizierung) eines bestimmten DNA-Abschnitts vorgenommen werden. Dazu wird die DNA-Doppelhelix durch Erhitzen auf 95°C denaturiert. Dabei trennen sich die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den beiden Strängen auf und Einzelstrang-DNA entsteht. Diese fungiert nun als Matritze für die Synthese eines neuen, komplementären DNA-Stranges. Um die Synthese zu starten benötigt man zwei kurze Oligonukleotid-Primer (den sog. sense- und antisense-Primer), die komplementär zu den flankierenden Sequenzen des zu vervielfältigenden DNA-Abschnitts liegen und die sich bei einer für die jeweiligen Primer spezifischen Temperatur an die DNA-Matritze anlagern („annealing“). Die thermostabile DNA-Polymerase synthetisiert nun einen zur DNA-Matritze komplementären Strang, indem sie die zugegebenen Nukleotide an die 3´-OH-Primer-Enden der Primer anheftet. Durch Erhitzen des Reaktionsgemisches auf 95°C trennen sich die neu gebildeten Stränge von ihren Matritzen und stehen nun selbst als Vorlage für neue Gegenstrangsynthesen zur Verfügung. Diesen Reaktionszyklus von Denaturierung, Annealing und Polymerase-Aktivität kann man etwa 30-40 mal ablaufen lassen, wobei sich die DNA exponentiell vermehrt. In einem abschließenden Reaktionsschritt werden die begonnenen Transkripte bei 72°C vervollständigt.
Reaktionsansatz: 1 µl Plasmid-DNA bzw.cDNA(10-100 ng/µl) 5 µl 10-fach Thermo DNA Puffer (Promega) 3 µl 25 mM MgCl2 (Promega)
1 µl 10 mM dNTP-Mix (10 mM dATP, dGTP, dCTP und dTTP)
1 µl sense-Primer (100 ng/µl) 1 µl antisense-Primer (100 ng/µl)
0,5 µl Taq DNA-Polymerase (5 U/µl, Promega)
ad 50 µl aqua bidest. (PCR-Qualität; Roth, Karlsruhe)
Die verwendeten Oligonukleotid-Primer wurden speziell für diesen Zweck synthetisiert (Herstellung durch GIBCO BRL).
Die oben genannten Reagentien wurden in einem Reaktionsgefäß vereint und die PCR in einem PCR-Apparat (Multicycler PTC-200; Biozym Diagnostik GmbH, Hess. Oldendorf), der nach programmiertem Muster den Temperaturwechsel vollzieht, durchgeführt.
Beispiel für ein PCR-Programm:
Denaturierung Annealing Extension
95°C, 4 Minuten 1x
95°C, 30 Sekunden 60°C, 1 Minute 72°C, 1 Minute 29x 72°C, 10 Minuten 1x
Das Programm begann mit einer 4 minütigen Denaturierung der DNA bei 95°C, anschließend folgten 29 Schleifen, die folgendermaßen abliefen: 30 Sekunden Denaturierung der DNA bei 95°C, 1 Minute Anlagerung der Primer bei 60°C, 1 Minute Verlängerung der Primer durch die Polymerase bei 72°C. Nach der letzten Schleife schlossen sich noch 10 Minuten bei 72°C an, danach wurden die Proben auf 4°C heruntergekühlt.
Anschließend wurden 5 µl der PCR-Produkte auf ein analytisches Agarose-Gel aufgetragen um die Größe des vervielfältigten Moleküls zu bestimmen.
Parallel zu den Proben wurde immer eine Kontrolle, die anstelle von DNA Wasser enthielt, mit angesetzt, um Verunreinigungen der verschiedenen Reaktionskomponenten mit Fremd-DNA auszuschließen.
Bei eigenen Untersuchungen wurde die PCR zur Überprüfung der Größe der Inserts bei der Subklonierung und beim Einklonieren von cDNA-Inserts in Plasmide angewendet. Während der Klonierungsversuche wurden mit Hilfe der PCR positive Kolonien selektiert. Mittels PCR wurden außerdem neue, unbekannte DNA-Abschnitte amplifiziert.
3.2.13 Digoxigenin -Markierung von DNA
Mit Hilfe der PCR können DNA-Fragmente amplifiziert und durch den Einbau von Digoxigenin-11dUTP (DIG-11-dUTP, Boehringer Mannheim; Mannheim) statt dTTP dabei gleichzeitig nichtradioaktiv markiert werden.
In die PCR-Reaktion zur Herstellung der Digoxigenin-markierten cDNA-Sonden wurde Plasmid-DNA, die das zu markierende cDNA-Insert beinhaltete, eingesetzt. Als Enzym wurde die Taq DNA-Polymerase (Promega) mit den entprechenden Puffern verwendet.
Folgende Primerpaare (Herstellung durch GIBCO BRL) wurden eingesetzt (der sense-Primer ist zuerst aufgeführt):
CE1 (730 bp PCR-Produkt): 5´-AAGCAGCAGAGCTGGAG-3´/
5´-AATGTCACCTTCACCAG-3´
CE4 (370 bp PCR-Produkt): 5´-ACGCAGGAGTGCGTCTCGGA-3´/
5´-AGCGGTCACTTTATTGGTTG-3´
CE9 (386 bp PCR-Produkt): 5´-AGAGCTCGCATAACGTACATG-3´/
5´-CCAGCAGAAGAAGGTGG-3´
CE11 (540 bp PCR-Produkt): 5´-GTGCTAAGGGAGCCTCTCAG-3´/
5´-TTGCTGGTGTTCGCAGCTCC-3´
CE12-alt (597 bp PCR-Produkt): 5´-AGATTCATGTGTATTCC-3´/
5´-GGTAGTCGTTATGTGGG-3´
CE12-neu (404 bp PCR-Produkt): 5´-CTCTCCTTGGTGTGCAACC-3´/
5´-AAGTGGCAGGGAAAGCCAG-3´
Reaktionsansatz: 1 µl Plasmid-DNA (10-100 ng/µl)
5 µl 10-fach Thermo DNA Puffer (Promega) 3 µl 25 mM MgCl2 (Promega)
5 µl dNTP-Mix für DIG Labeling (66 µM
5 µl dNTP-Mix für DIG Labeling (66 µM