Begleitende Versuche

3.1.5.1 Überprüfung des Kapazitationsverhaltens in TALP mittels CTC-Färbung Die Färbung der Spermien mit Chlortetrazyklin (CTC; Fa. Sigma, Deisenhofen) macht die kapazitationsbezogene Verteilung von intrazellulärem Ca²⁺ sichtbar. Dies zeigt sich in unterschiedlichen Fluoreszenzmustern (nach WANG et al. 1995):

unkapazitierte Spermatozoen weisen eine gleichmäßige Fluoreszenz des gesamten Spermienkopfes (Muster F) auf, kapazitierte Spermien zeigen bei fluoreszierendem Akrosom keine Fluoreszenz der postakrosomalen Region (Muster B) und bei akrosomreagierten Spermien erscheint bei verminderter Kopffluoreszenz eine verstärkte Linie im Äquatorialsegment (Muster AR). Durch die Zugabe von Lysophosphatidylcholin (LPC; Fa. Sigma, Deisenhofen) wird bei kapazitierten Spermien die Akrosomreaktion induziert, wodurch wiederum ein Rückschluß auf die Anzahl an kapazitierten Spermazozoen möglich ist.

Mit Hilfe der CTC-Färbung wurde während dreistündiger Inkubation die Wirkung des Inkubationsmediums TALP auf das Kapazitationsverhalten der Spermatozoen überprüft. Die Untersuchung umfasste 7 Ejakulate von 5 verschiedenen Ebern.

3.1.5.1.1 CTC-Färbung

Die CTC-Lösung wurde am Versuchstag frisch aus einer Stammlösung (s. Anhang A) erstellt.

Die Zellen der spermienreichen Phase eines Ejakulats wurden nach der Durchführung einer spermatologischen Untersuchung (s. 3.1.3) auf eine Dichte von 5 x 10⁷ Spermien/ml Androhep ohne EDTA eingestellt. In einem Eppendorfhütchen wurden 20 µl dieser Suspension mit 20 µl CTC-Lösung vermischt; es folgte die fluoreszenzmikroskopische Untersuchung eines Tropfens dieser Lösung. Dabei wurden - unter Verwendung eines 365 nm Erregerfilters - 100 Spermien hinsichtlich der Kriterien "unkapazitiert", "kapazitiert" und "akrosomreagiert" beurteilt.

Dann wurden die Spermien einem "Swim up" unterzogen (s. 3.1.4.1.) und nochmals spermatologisch untersucht (s. 3.1.3).

Für die Untersuchung des Kapazitationsverhaltens der Spermatozoen bei dreistündiger Inkubation in TALP-Medium wurden insgesamt 10 Eppendorfgefäße mit 20 Mio. Spermien/500 µl TALP gefüllt und bei 39°C und 5%CO₂ inkubiert. Nach 3, 30, 60, 90 und 180 Minuten erfolgte die CTC-Färbung zweier Proben (20 µl Spermiensuspension + 20 µl CTC-Lösung), von denen eine zuvor einer zehn-minütigen Zentrifugation bei 150 g unterzogen wurde.

Je Probe wurden 100 Spermienzellen untersucht. Bei Abschluss der Beurteilung der Spermien nach 180 Minuten wurde in beide Gefäße 10 µl LPC-Lösung (Rezepz s.

Anhang A) pipettiert. Nach 10 Minuten erfolgte nochmals die Durchführung einer CTC-Färbung. Um die Induzierbarkeit der Akrosomreaktion zu bestimmen wurde die Differenz zwischen der Menge an akrosomreagierten Spermien nach LPC-Zugabe und der Menge akrosomreagierter Zellen vor LPC-Zugabe ermittelt.

3.1.5.2 Immunhistochemische Charakterisierung der Oviduktepithelzellen

Zum Nachweis der Intermediärfilamente Zytokeratin und Vimentin erfolgte eine immunhistochemische Untersuchung der kultivierten Zellen (ELLINGTON et al. 1990;

JOSHI 1988; BOERJAN et al. 1993). Die von der Maus stammenden Primärantikörper Anti-Pan-Zytokeratin (Fa. Sigma, Deisenhofen) und Anti-Vimentin (Fa. Sigma, Deisenhofen) binden an die intrazellulären Antigene und bilden Antigen-Antikörper-Komplexe. Als Sekundärantikörper wurde ein biotinyliertes Anti-Mouse-IgG (Fa. Dianova, Hamburg) eingesetzt, an das eine Streptavidinperoxydase (Fa.

Dianova, Hamburg ) bindet. Diese setzt schließlich das Substrat Diaminobenzidin (DAB; Fa. Bio Genex, Hamburg) um, was durch eine Braunfärbung sichtbar wird.

3.1.5.2.1 Präparation der Proben für die Immunhistochemie

Es wurden vier mit jeweils vier konfluenten Oviduktepithelzellflächen bewachsene Chamber Slides verwendet.

Zunächst wurde das Kulturmedium aus allen Kammern sorgfältig entfernt. Jeweils zwei der Objektträger wurden zusammen in eine mit feuchtem Zellstoff ausgelegte Küvette verbracht; die Küvetten befanden sich auf einem auf 39°C temperierten Wärmetisch (Fa. Jürgens, Bremen). Zunächst wurden die Kulturen 1 x mit

39°C-warmer und anschließend 3 x 5 Minuten mit 4°C-kalter PBS-Lösung (Rezept s.

Anhang A) gewaschen, indem in jede Kammer 800 µl Lösung pipettiert und wieder entfernt wurde.

3.1.5.2.2 Immunhistochemie

Jeweils 800 µl des Fixationsmittels (Rezept s. Anhang A) wurden in jede Kammer gegeben und nach zehnminütiger Inkubationszeit wieder abpipettiert. Zur Absättigung des Überschusses an Aldehyd wurde anschließend 3 x 2 Minuten mit 0,1 M Glycin in PBS (Rezept s. Anhang A) inkubiert. Danach erfolgte erneut eine dreimalige 5 Minuten lange Spülung mit warmer PBS-Lösung .

Die nachzuweisenden Intermediärfilamente Zytokeratin und Vimentin stellen intrazelluläre Strukturen dar. Damit der entsprechende Antikörper das Antigen erreichen konnte, mussten zunächst die Zellmembranen permeabilisiert werden.

Dies geschah durch die Behandlung der kultivierten Zellen mit PBS-Triton (Rezept s.

Anhang A). Zunächst wurden die Kulturen einmal mit dieser Lösung vorgespült, dann folgte eine 10minütige Inkubation. Alle folgenden Waschgänge wurden von nun an mit PBS-Triton durchgeführt.

Um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren, wurden die Kulturflächen mit 3%

BSA in PBS (Rezept s. Anhang A) 60 Minuten lang inkubiert. Es folgten 3 Waschgänge à 5 Minuten. Dann wurden je Kulturfläche 100 µl der Primär-antikörperlösung aufgebracht. Nach sechzigminütiger Inkubation wurde diese wieder abpipettiert und die Kulturen nochmals 3 x 5 Minuten gewaschen.

Als Primärantikörper wurde bei zwei Objektträgern Anti-Pan-Cytokeratin (Maus) in der Verdünnung 1:100, bei zwei Objektträgern Anti-Vimentin (Maus) in der Verdünnung 1:15 (Antikörperpuffer, Rezept s. Anhang A) verwendet. Zur Kontrolle der selektiven Bindung des Primärantikörpers wurde eine Kulturfläche je Chamber Slide mit 3% BSA in PBS anstelle der Primärantikörper-Lösung inkubiert.

Der Sekundärantikörper (biotinyliertes Anti-Mouse IgG) wurde in der Verdünnung 1:1000 eingesetzt. 100 µl der Lösung wurden zu jeder Kulturfläche hinzugegeben und nach dreißigminütiger Inkubation wieder abpipettiert. Die Kulturen wurden wiederum 3 x 5 Minuten gewaschen.

Es folgte eine Inkubation von ebenfalls 30 Minuten mit der Streptavidinperoxydase-Lösung (Rezept s. Anhang A). Die starke Affinität des Glykoproteins Avidin zu Biotin

führt zu einer irreversiblen Bindung der Streptavidinperoxydase an den Sekundärantikörper. Der nicht gebundene Überschuß wurde durch drei fünfminütige Waschgänge entfernt.

Das Substrat DAB (Rezept s. Anhang A) wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten aufgebracht; es wird von der Streptavidinperoxydase zu einem braunen Farbstoff umgesetzt. Abschließend wurde nochmals 3 x 5 Minuten mit PBS-Triton und 3 x 5 Minuten mit PBS gespült.

Nach Entfernung der kammernbildenden Rahmen wurden die Objektträger mit einem Tropfen Einbettungsmittel (Rezept s. Anhang A) eingedeckelt und lichmikroskopisch beurteilt. Die Ergebnisse wurden fotografisch dokumentiert.