3 Eigene Untersuchungen
3.3 Methoden
3.3.5 Auswertung
Die Auswertung der klinischen Untersuchungen erfolgte deskriptiv. Auf ein Punktesystem wurde verzichtet, da die meisten Parameter nicht objektiv feststellbar waren und die Erhebungen abwechselnd von mehreren Personen durchgeführt wurden.
Folgende Parameter wurden erfasst und ausgewertet: Im Bereich der Wundheilung auftretende Rötungen und Schwellungen, Nahtdehiszenzen und Wundinfektionen und der Zeitpunkt, ab dem die Gliedmaße im Bereich der Wunde ohne besonderen Befund war; im Bereich der Palpation erfassbare Schmerzen, Schwellungen (weich/ derb/ hart) und Gasbildungen; sowie Lahmheiten gegebenenfalls mit Angabe des Lahmheitsgrades. Die genannten Parameter wurden während der Versuchsdauer täglich erfasst und notiert. Aus diesen Notizen wurde ein zusammenfassende Tabelle erstellt (Anhang Tab. I).
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Die Auswertung der radiologischen Untersuchungen erfolgte mit Hilfe eines Punktesystems (Tab. 12). Besonderheiten wurden deskriptiv erfasst und aufgeführt. Als Parameter wurde zunächst die Implantatlokalisation bestimmt. Dabei war die Lage von ⅔ des Implantates für die Zuordnung des jeweiligen Bereiches ausschlaggebend. Des Weiteren wurden röntgenologische Veränderungen im Bereich der Implantationsstelle ausgewertet. Dabei interessierten zum einen das Ausmaß der Knochenzubildungen an der Implantationsstelle und zum anderen die Detektion von Gas. Außerdem wurden röntgenologische Veränderungen des Knochens im Bereich des Implantates erfasst.
Dabei wurden nur die diaphysären Knochenzubildungen in den Score einbezogen und die sonstigen Besonderheiten deskriptiv aufgeführt. Wenn im Folgenden diaphysäre Knochenveränderungen bzw. –zubildungen beschrieben werden, so ist stets die periostale oder endostale Kortikalis im Bereich des Implantatlagers gemeint. Veränderungen des Periosts wurden als Besonderheiten deskriptiv aufgeführt. Eine wolkig strukturierte periimplantäre Aufhellung in den Röntgenaufnahmen wurde als „wolkige Markhöhle“
innerhalb der Besonderheiten beschrieben (Abb. 8B, C). Die endostale Reduktion der Kortikalis, welche auf einer beobachteten Verschmälerung des Endosts auf Höhe des Implantats beruht, wurde ebenfalls als Besonderheit erfasst (Abb. 8C). Es wurde dabei nur das Vorkommen, aber nicht der Verteilungsgrad (punktuell oder über größere Strecken verlaufend) in die Dokumentation aufgenommen. Des Weiteren wurden eine unruhige Kortikalis (Abb. 8B) sowie ein periimplantärer Knochenmantel als Parameter deskriptiv in die Auswertung einbezogen. Wenn die jeweilige Veränderung eine massive Ausprägung zeigte, so wurde dies mit einem (+) gekennzeichnet. Als Parameter für die röntgenologischen Veränderungen des Implantates wurde die Implantatstruktur und -form unter der Bezeichnung Implantatstruktur mit Hilfe des Punktesystems ausgewertet.
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Abbildung 8: Radiologische Aufnahmen zur beispielhaften Darstellung der Besonderheiten in der radiologischen Auswertung (A) Diaphyse ohne radiologische Veränderungen; (B) unruhige Kortikalis (Klammer); (C) Reduktion der endostalen Kortikalis; in (B) und (C) ist eine periimplantäre Aufhellung zu erkennen, welche als wolkige Markhöhle bezeichnet wurde.
Tabelle 12: Punktesystem der radiologischen Untersuchung Radiologische
Implantationsstelle Gas Knochenzubildungen
diaphysär Implantatstruktur Score keine nein keine wie am Tag der
Implantation 0 proximales
Drittel ggr. (<0,2cm Breite
und <0,5cm Länge) ja periostal geringer Strukturverlust ohne
Länge) endostal deutlicher Strukturverlust ohne
periostal + endostal hoher Strukturverlust mit Formveränderung 3
Ausgewertete Besonderheiten, die die Diaphyse im Bereich des Implantates betreffen:
W wolkige Markhöhle
E endostale Reduktion der Kortikalis C unruhige Kortikalis
K periimplantärer Knochenmantel + massive jeweilige Veränderung
Die Scores wurden für den jeweiligen Parameter pro Gliedmaße, Tier und Woche in einer Tabelle notiert (Anhang Tab. II bis X). Den Scores wurde keine Bewertung zugeordnet. Bei
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den Parametern Knochenzubildungen an der Implantationsstelle und Implantatstruktur wurden Mittelwerte und Standardabweichungen für die Material-Zeitgruppen für jede Woche berechnet. Die Parameter Implantatlokalisation, Gas und Knochenzubildungen diaphysär wurden ohne Erstellung von Mittelwerten und Standardabweichungen aufgeführt.
Bei der makroskopischen Untersuchung zur Beurteilung des Implantats, des Markhöhlengewebes und des Knochens nach dem Aufsägen wurde deren Beschaffenheit (Farbe und Konsistenz) deskriptiv ausgewertet.
Die Lichtmikroskopie der Implantate vor und nach der Flusssäurebehandlung wurde ebenfalls deskriptiv ausgewertet. Dabei wurden die Eigenschaften (Farbe, Verteilung, Struktur) der Implantatoberfläche, des anhaftenden Gewebes und sonstiger Auflagerungen beschrieben.
Die Auswertung der Rasterelektronenmikroskopie der Implantate vor und nach Flusssäurebehandlung erfolgte analog zur Lichtmikroskopie deskriptiv. Die Ergebnisse der EDX-Messungen auffälliger Strukturen auf der Implantatoberfläche wurden von der gerätespezifischen Software (EDAX Genesis) als Diagramme/ EDX-Spektren dargestellt und der relative quantitative sowie qualitative Gehalt der Elemente den jeweiligen Strukturen in der deskriptiven Auswertung zugeordnet.
Für die Auswertung der Gewichtsmessungen wurden von den Einzelergebnissen der Gewichtsmessungen für jede Material-Zeit-Gruppe Mittelwerte und Standardabweichungen erstellt. Für die Ergebnisse der Volumenbestimmung wurde analog verfahren, wobei zunächst ein Mittelwert aus der dreimaligen Messung eines Implantates gebildet und dieser dann als Wert für die einzelne Probe verwendet wurde.
Die Volumendarstellung der Implantate mit Hilfe der µ-CT wurde deskriptiv vorgenommen und in der Falschfarbendarstellung abgebildet.
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Für die Auswertung der Dreipunktbiegeversuche wurden während des Versuches die Kraft und der Biegeweg in einer Messwertreihe für jede einzelne Messung automatisiert aufgezeichnet. Ein abrupter Kraftabfall von 10 % bzw. ein Biegeweg von 5 mm wurde als Bruchkriterium angenommen. Aus den entstandenen Messdaten bzw. -kurven wurden die maximal aufgetretene Biegekraft und der Biegeweg, bei dem das Bruchkriterium erreicht wurde, extrahiert (Abb. 9). Die maximale Biegekraft sollte Aufschluss über die mechanische Festigkeit geben, während der Biegeweg beim Bruch ein Maß für die Duktilität ist. Für jede Material-Zeit-Gruppe wurden Mittelwerte und Standardabweichungen für die beiden Messwerte maximale Biegekraft und Biegeweg beim Bruch errechnet.
Abbildung 9: Beispielhafte graphische Darstellung des Ablesens der Werte maximale Kraft und Biegung beim Bruch aus einer Messwertkurve des Dreipunktbiegeversuchs für MgCa7.
Die semiquantitative Auswertung der µCT-Untersuchungen der Implantat-Knochenverbunde wurde mit Hilfe eines an die histologische Auswertung angelehnten Punktesystems durchgeführt. Es wurde nur der Bereich des Implantat-Knochenverbundes einbezogen, in dem das Implantat in seiner ganzen Länge lag. Dabei betrug die Anzahl der 2D-Schnitte (slices) pro Implantat 700 (±5). Die Auswertung wurde anhand von je
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neun gleichmäßig über die Länge des Implantats verteilten Schnitten pro Probe (Abb. 10) erhoben.
70
0(+-5) Schnitte über das gesamte Implantat
Schnitt 2
700(+-5) Schnitte über das gesamte Implantat
Schnitt 2
Abbildung 10: Schematische Darstellung der für die µCT-Auswertung verwendeten Schnitte; über die gesamte Pinlänge betrug die Anzahl der Schnitte 700±5; es wurden neun gleichmäßig über die Gesamtlänge des Implantats verteilte Schnittbilder in die Auswertung einbezogen.
Das Punktesystem der µCT-Untersuchungen erfasste vier Parameter (Tab. 13). Jedem Parameter wurde für alle neun 2D-Schnitte einer jeden Probe anhand seines Vorkommens bzw. seiner Ausprägung einen Score zugeordnet und dieser tabellarisch notiert. Aus den Einzelscores wurden für jede Material-Zeit-Gruppe Mittelwerte und Standardabweichungen berechnet.
Bei dem Gesamteindruck des Knochens wurde beurteilt, ob dieser aussah, wie zum Vergleich herangezogene 2D-Schnitte einer Kaninchentibia ohne Implantat (ruhiger Gesamteindruck Abb. 11A) oder ob Abweichungen in der Struktur des Knochenquerschnittes in Form von Löchern (Kavitäten) und unregelmäßigen Rändern auftraten (unruhiger Gesamteindruck Abb. 11B).
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Abbildung 11: µCT-Aufnahmen für die Scoreeinteilung der Parameter Gesamteindruck und Knochentrabekel vom Endost ausgehend (A) Tibia ohne Implantat mit ruhigem Gesamteindruck (Score 0) (B) Tibia mit unruhigem Gesamteindruck (Score 1) (C) Knochentrabekel vom Endost ausgehend (Pfeil) Score 1.
Für die Parameter Implantatdegradation (wurde nur für die Proben mit Magnesiumimplantaten bestimmt) und Knochenanwachsverhalten an den Pin, wurden die prozentualen Abstufungen geschätzt. Beispiele für die Scorewerte 0 bis 3 sind in Abbildung 12 und 13 dargestellt.
Score 0 Score 1 Score 2 Score 3
Abbildung 12: µCT-Aufnahmen für die Scoreeinteilung des Parameters Implantatdegradation; der Pfeil entspricht 1 mm.
Score 0 Score 1 Score 2 Score 3
Abbildung 13: µCT-Aufnahmen für die Scoreeinteilung des Parameters Knochenanwachsverhalten an den Pin; der Pfeil entspricht 1 mm.
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Tabelle 13: Punktesystem der µCT-Untersuchungen
Parameter Score Bedeutung
Gesamteindruck des Knochens 0 ruhig
1 unruhig 0 keine Formänderung des Querschnittes
erkennbar (nur schmaler Rand weniger röntgendicht)
1 bis 25%
2 26 bis 50%
Implantatdegradation
3 >51%
Knochenanwachsverhalten an den Pin 0 keines
(Abb. 13) 1 trabekulär
2 Knochenspange(länger als ¼ der Pinoberfläche) 3 Ringbildung um Implantat (>90%Pinoberfläche
bedeckt) Knochentrabekel vom Endost ausgehend
(ausgenommen sind periimplantäre Trabekel, die eine Spange oder Ring
formen)
0 nein
1 ja (Abb. 11C)
Die Auswertung der histologischen Untersuchung gliederte sich in drei Abschnitte.
Im ersten Abschnitt wurden die zellulären Reaktionen, die Knochenumbauvorgänge und das Knochenanwachsverhalten an den toluidinblaugefärbten Präparaten (je zwei pro Tier) mit Hilfe eines semiquantitativen Punktesystems beurteilt. Dafür wurde die Mikroskopie (Mikroskop Zeiss AxioImager Z1) und Vergabe der Punkte von zwei Personen durchgeführt, die die Bewertung unabhängig voneinander vornahmen. Im zweiten Abschnitt erfolgte eine histomorphometrische Messung der Degradationsschichtdicke bei den Implantaten aus den Magnesiumlegierungen (3- und 6-Monatsgruppen) an den gleichen Präparaten wie für den ersten Abschnitt. Für den dritten Abschnitt, die Auswertung der polychromen Fluoreszenzmarkierung, wurden die ungefärbten Schnitte (je einer pro Tier) verwendet.
Mit dem semiquantitativen Punktesystem wurden pro Magnesiumlegierung und Zeitgruppe insgesamt zehn Schnitte, für die Dreimonatsgruppe von Titan sechs, die Sechsmonatsgruppe acht Schnitte ausgewertet. Bei PLA wurden in beiden Zeitgruppen je sechs Präparate beurteilt. Jeder Parameter wurde am gesamten Präparat in den in Tabelle 14 angegebenen Vergrößerungen beurteilt.
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Die semiquantitative Auswertung der histologischen Präparate untergliederte sich in drei Bereiche: 1. das Gesamtbild, 2. die Knochenveränderungen und 3. die zellulären Reaktionen einschließlich der Bläschenbildung (Tab. 14). Bei allen Parametern außer Implantat-Knochen-Kontakt und ringförmiger bzw. trabekulärer Knochenneubildung wurden für den Vergleich und Referenz für den Score 0 mehrere histologische toluidinblaugefärbte Schnitte von Tibiae ohne Implantat, welche von aus anderen Gründen euthanasierten Kaninchen stammten, herangezogen.
Für den Bereich Gesamtbild wurde der Parameter Gesamteindruck nach unruhigem und ruhigem Aussehen des Knochens beurteilt. Als ruhig wurde das dem einer Tibia ohne Implantat ähnliche Aussehen bezeichnet (Abb. 14A). Unruhiges Aussehen resultierte aus der Beobachtung von Auflockerungen der Knochenstruktur und von Knochenkavitäten in der Kortikalis (Abb. 14B) und wurde als negatives Charakteristikum bewertet.
Abbildung 14: Übersichtsaufnahmen von toluidinblaugefärbten histologischen Präparaten; (A) Gesamteindruck ruhig (Score 0); (B) Gesamteindruck unruhig (Score 1) aufgrund von Auflockerungen der Knochenstruktur und Knochenkavitäten/ Hohlräumen in der Kortikalis.
Zu dem zweiten Bereich, den Knochenveränderungen, zählten die Parameter Knochenkavitäten, periostales und endostales Remodelling, die periostale Apposition, der Implantat-Knochen-Kontakt, die ringförmige periimplantäre Knochenneubildung und die trabekuläre Knochenneubildung in der Markhöhle.
Der Einteilung der Knochenkavitäten in die Scorewerte 0 bis 3 wurde deren Anzahl und Größe (verglichen mit der Größe eines Osteons) zugrunde gelegt (Abb. 14B). Als
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Kavitäten (lat. cavum = Höhle) wurden Hohlräume in der kortikalen Knochenstruktur bezeichnet.
Für das periostale und endostale Remodelling wurde der äußere Bereich der periostalen bzw. der innere Bereich der endostalen Kortikalis betrachtet. Mit Score 0 wurden die Präparate beurteilt, die auf weniger als einem Viertel des Umfangs der äußeren periostalen bzw. inneren endostalen Kortikalis ein Remodelling aufwiesen. Die Einteilung in die Scorewerte 1 bis 3 erfolgte durch die festgestellte Dicke des Remodeling-Bereichs, die dem x-fachen der Dicke eines Osteons entsprach (Tab. 14). Bei dem Parameter periostale Apposition wurde nur ausgewertet, ob eine solche Apposition auftrat oder nicht, dabei wurden die Ausdehnung oder Stärke nicht in Form einer Graduierung in den Score 1 mit einbezogen. Als Apposition des Periosts wurde die wellenförmige, kammartige Struktur der äußersten Knochenschicht der periostalen Kortikalis bezeichnet (Abb. 15A). Bei dem Parameter Implantat-Knochen-Kontakt wurde bewertet, ob das Implantat selbst oder im Fall der Magnesiumlegierungen deren Degradationsschicht einen direkten Kontakt zum neu gebildeten Knochen besaß (Abb. 15B). Die Ausbildung eines ringförmigen Knochenareals direkt um das Implantat herum wurde mit dem Parameter Knochenneubildung ringförmig charakterisiert (Abb. 15C). Die graduelle Abstufung bei Score 1 bis 3 wurde anhand der Dicke des Knochenrings, verglichen mit der x-fachen Dicke eines Osteons, vorgenommen. Bei der trabekulären Knochenneubildung in der Markhöhle wurde auch allen kleinsten Trabekeln ab einer Mindestlänge von 350µm der Score 1 zugewiesen.
Abbildung 15: Aufnahmen von toluidinblaugefärbten histologischen Präparaten; (A) periostale Apposition in Form kammartiger Aufwölbung der äußersten periostalen Kortikalis; (B) direkter Kontakt zwischen neu gebildetem Knochentrabekel (3) und der Degradationsschicht (2) auf einem Magnesiumimplantat (1), Markhöhle (4); (C) periimplantäre ringförmige Knochenneubildung am Beispiel eines Titanimplantats.
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Dem Bereich der zellulären Reaktionen und Bläschenbildung wurden die Parameter Fibrose/ Bindegewebsschicht, lymphoplasmazelluläre Reaktion, Makrophagen, Riesenzellen und die Bläschenbildung zugeordnet.
Bei dem Parameter Fibrose wurden je nach prozentualer Abdeckung der Implantatoberfläche die Scorewerte vergeben (Tab. 14). Es wurden alle periimplantären bindegewebigen Strukturen in die Bewertung einbezogen, wenn sie mehr als zwei Zelllagen dick waren. Als Fibrose wird ein Gewebe fischzugartig angeordneter Bindegewebszellen (Fibrozyten) und Kollagenfasern bezeichnet (JUNQUEIRA u.
CARNEIRO 2004). Als Besonderheit wurde ein bindegewebiger Saum in Endostnähe deskriptiv beschrieben und nicht mit in den Score einbezogen.
Bei dem Parameter lymphoplasmazelluläre Reaktion wurden das Vorkommen und die Anzahl von Lymphozyten und Plasmazellen in der Markhöhle bewertet. Dabei wurde die Gesamtzahl der beiden Zellen bestimmt. Demgegenüber wurde bei dem Parameter Makrophagen nur unterschieden, ob ≤3 (Score 0) oder >3 Makrophagen (Score 1) in der Markhöhle zu finden waren. Für die Zellzählungen der beiden letztgenannten Parameter wurde die Markhöhle rasterförmig in der 400fachen Vergrößerung mikroskopiert und die Anzahl der in jedem Gesichtsfeld bestimmten Zellen nach Mikroskopie des gesamten Schnittes addiert und dem Scorewert zugeordnet (Tab. 14).
Bei den Parametern Riesenzellen und Bläschenbildung wurde nur zwischen Nichtvorhandensein (Score 0) und Vorfinden solcher Zellen bzw. Strukturen (Score 1) unterschieden. Bei der Bläschenbildung wurde nicht unterschieden, ob diese intra- oder extrazellulär in der Markhöhle zu finden war. Als Bläschen wurden Strukturen charakterisiert, welche als zahlreiche ungefärbte rundliche Gebilde einer Größe von durchschnittlich 10 µm erschienen.
Tabelle 14: Punktesystem der semiquantitativen Auswertung der toluidinblaugefärbten histologischen Präparate
Lokalisation Vergrößerung Beurteilungsparameter Score Gesamtbild
12,5 Gesamteindruck
ruhig 0
unruhig 1
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Lokalisation Vergrößerung Beurteilungsparameter Score Knochenveränderungen
12,5 Knochenkavitäten
weniger als 3 osteongroße Kavitäten 0 4 bis 6 osteongroße Kavitäten oder bis 10 halbgroße 1 7 bis 10 osteongroße Kavitäten oder 11 bis 20
halbosteongroße
2
>11 osteongroßen Kav., 21 kleinere oder >3
doppeltosteongroßen Kav. 3 periostal 50 Periostales Remodeling
nein 0
ab 1/4 der Strecke 1faches Osteon dick 1 ab 1/4 der Strecke 2faches Osteon dick 2 ab 1/4 der Strecke 3faches Osteon dick 3 endostal 50 Endostales Remodeling
nein 0
ab 1/4 der Strecke 1faches Osteon dick 1 ab 1/4 der Strecke 2faches Osteon dick 2 ab 1/4 der Strecke 3faches Osteon dick 3 periostal 50 Periostale Apposition
nein 0
ja 1
Implantat 100 und 200 Implantat-Knochen-Kontakt (zum neuen Knochen)
nein 0
ja 1
periimplantär 50 bis 400 Knochenneubildung ringförmig
nein 0
bis 1fache Osteondicke 1
2fache Osteondicke 2
mehr als 3fache Osteondicke 3 Markhöhle 50 bis 400 Knochenneubildung trabekelförmig
nein 0
ja (auch kleinste Trabekel mit mind. Länge 350µm) 1 Zelluläre Reaktionen und Bläschenbildung
periimplantär 400 Fibrose/ Bindegewebsschicht
nein 0
bis 25% der Implantatoberfläche bedeckt 1 26 bis 50% der Implantatoberfläche bedeckt 2 mehr als 51%der Implantatoberfläche bedeckt 3 Markhöhle 400 lymphoplasmazelluläre Reaktion
weniger als 30 Zellen im gesamten Schnitt 0 31 bis 50 Zellen im gesamten Schnitt 1 51 bis 100 Zellen im gesamten Schnitt 2 mehr als 101 Zellen im gesamten Schnitt 3 Markhöhle 400 Makrophagen
≤3 Zellen im gesamten Schnitt 0
> 3 Zellen im gesamten Schnitt 1 Markhöhle 400 Riesenzellen
nein 0
ja 1
Markhöhle 400 Bläschenbildung
nein 0
ja 1
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Die histomorphometrische Messung der Degradationsschichtdicke im zweiten Abschnitt der histologischen Auswertung wurde an in 12,5facher Vergrößerung abfotographierten Präparatausschnitten an sechs definierten Punkten durchgeführt (12 Uhr, 2 Uhr, 4 Uhr, 6 Uhr, 8 Uhr, 10 Uhr) (Abb. 16). Diese Distanzmessung (in µm) erfolgte am Makroskop Leica M420 mit Hilfe der Software Leica IM1000. Aus den sechs Einzelwerten wurde ein Mittelwert für jedes Präparat gebildet und anschließend ein Mittelwert mit Standardabweichung für jede Material-Zeit-Gruppe errechnet.
Abbildung 16: Darstellung der Lokalisation der histomorphometrischen Messung der Degradationsschichtdicke am Beispiel des Präparates P2 von LAE6 (3 Monate); sechs Messlokalisationen wurde gewählt (12 Uhr, 2 Uhr, 4 Uhr, 6 Uhr, 8 Uhr, 10 Uhr); der homogene schwarze Bereich stellt das Implantat dar, der dunkelblau gefärbte periimplantäre Rand die zu vermessende Degradationsschicht.
Die Auswertung der polychromen Fluoreszenzmarkierung im dritten Abschnitt der histologischen Untersuchung erfolgte deskriptiv anhand der Einzelkanalbilder für alle vier Fluoreszenzfarbstoffe. Dabei wurde beurteilt, welcher Farbstoff sich in welche Strukturen und Bereiche eingelagert hatte und diese fluoreszieren ließ. Dadurch konnten Rückschlüsse auf den Zeitpunkt der jeweiligen Veränderung gezogen werden. Zu den beurteilten Strukturen und Bereichen gehörte das Implantat selbst, die Degradationsschicht, der periimplantäre Knochen in Form von Trabekeln oder eines
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Ringes, das diffus gefärbte Gewebe in der Markhöhle (exkl. durch Fluoreszenzbanden erkennbare Trabekel), in der Markhöhle befindliche Knochentrabekel mit Fluoreszenzbanden und ohne Implantatkontakt sowie die periostale und endostale Kortikalis.
Für die Auswertung der REM der histologischen Querschnitte wurden die Aufnahmen der Degradationsschicht hinsichtlich der Struktur vergleichend beschrieben. Die durch die line-scans der EDX-Analyse ermittelten Einzelwerte der Elemente Magnesium, Kalzium, Phosphor und Aluminium wurden graphisch dargestellt und damit der Verlauf des Gehaltes über die Lokalisationen Implantat, Degradationsschicht, Markhöhle und Knochen sichtbar gemacht. Nach dem gleichen Prinzip wurden die Seltenen Erden Elemente Lanthan, Cerium und Neodymium graphisch dargestellt und ausgewertet. Außerdem wurde eine einzelne Kurve für Magnesium graphisch erstellt. Dadurch, dass eine Trendlinie in die Messpunkte der Kurve gelegt wurde, war es möglich, eine mathematische Funktion für den Verlauf des Magnesiumgradienten zu bestimmen (approximieren). Die graphische Darstellung und die Aufstellung der Funktion erfolgten mit Hilfe der Software Microsoft® Excel 2002.