Aquasafe 300 Plus Szintillator (Zinsser Analytic, U.K.) [1,2,3,4-3H] Dexamethason Lösung in Ethanol, (Amersham Pharmacia Biotech, U.K.) Spezifische Aktivität:
1,44 TBq/mmol; 39,0 Ci/mmol
Aktivkohle zur Analyse (E. Merck, Darmstadt) Dexamethason (Sigma, München) (9α-Fluoro-16α-metyl-prednisolon)
Dextran T 70 (Carl Roth GmbH & Co., Karlsruhe) Di-Natriumhydrogencarbonat-Dihydrat (E. Merck, Darmstadt) (Na2HPO4 x 2 H20)
Ethanol (absolut) (Mallinckrodt Baker B.V., Holland) Ethylacetat
Gelatine (Bio Rad Laboratories, USA) Natriumchlorid (NaCl) (E. Merck, Darmstadt) Salzsäure (HCl) (J.T. Baker, Groß Gerau) Stickstoff (Messner, Langenhagen) 3.4 Medikament
Dexamethasonhaltige Augensalbe mit folgender Zusammensetzung:
0,29 mg Dexamethason / g Augensalbe (S & K Pharma Schuhmann u. Kohl GmbH, Perl) in öliger Suspension (Corti Biciron ®)
Tropffähige Augensalbe zum Einbringen in den Bindehautsack.
Weiterer Wirkstoff: 5,76 mg Oxytetracyclinhydrochlorid / g Salbe.
Sonstige Bestandteile: Siliciumdioxid, Isopropylmyristat, Wollwachs, Paraffin, Vaseline.
Dosierungsanleitung: 1 Tropfen der Augensalbe 3 x täglich in den Bindehautsack einträufeln.
3.5 Puffer und Lösungen
Die Herstellung aller während der Probenaufarbeitung sowie Messung verwendeter Puffer und Lösungen erfolgte mit destilliertem Wasser (Aqua dest.). Die Aufbewahrung der Puffer und Lösungen erfolgte bei 4°C.
3.5.1 Gelatine-Phosphat-Puffer (GPP)
Ein Liter einer 0,01 molaren Di-Natriumhydrogenphosphat-Lösung wird unter Zugabe von 0,01 molaren Natriumdihydrogenphosphat-Lösung auf einen pH-Wert von 7,8 eingestellt. In einem Liter dieser Lösung werden 8,77 g NaCl gelöst. Es erfolgt eine Korrektur des pH-Wertes der Lösung auf 7,6 unter Zugabe von Natriumhydroxid oder Salzsäure. 200 mg Gelatine werden abschließend in 200 ml dieser Pufferlösung gelöst.
3.5.2 Dextran-Aktivkohle-Suspension
In 100 ml Gelatine-Phoshat-Puffer werden 500 mg Aktivkohle und 50 mg Dextran 70 gelöst.
3.5.3 Dexamethason-Standardreihe
Zur Herstellung einer Stammlösung werden 10 mg Dexamethason in 10 ml Ethanol gelöst.
Diese Lösung wird soweit mit GPP verdünnt, daß am Ende Lösungen mit 16.000, 8.000, 4.000, 2.000, 1.000, 500, 250, 125 pg DXM/200 µl vorliegen.
3.5.4 3H-Dexamethason-Lösung
Die 3H-Dexamethason-Lösung wurde mit Ethanol auf 7.500 - 8.000 CPM / 100 µl eingestellt.
3.6 Patientengut
Die im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Proben stammen von 30 Hunden. Alle Hunde wurden einmal lokal mit der Augensalbe behandelt und in 3 Gruppen aufgeteilt. Es handelt sich bei diesen Hunden um Patienten der Tierärztlichen Klinik Dr. S. Kaiser / Dr. H.
Lindenstruth (Werl / Westfalen), die in der Zeit von Mai 2002 bis Dezember 2002 behandelt und wegen anderer Erkrankungen euthanasiert wurden. Klinische Besonderheiten sowie Befunde der Augenuntersuchung sind den Tabellen 3.1 bis 3.3 zu entnehmen. Die Patienten der 1.Gruppe wurden 6 Stunden, die Patienten der 2. Gruppe 11 Stunden, die Patienten der 3.
Gruppe 16 Stunden nach der Salbenapplikation euthanasiert. Augenpaare von drei weiteren Hunden dienten vorab dem Erlernen und der Etablierung von Entnahmetechnik und Sektionsgang.
Tab. 3.1 Rasse, Alter (in Jahren) sowie klinische Besonderheiten bei Patienten der 1.Gruppe
1 Mischling 1 geringgradige Konjunktivitis beidseits 2 Deutsch Langhaar 1 geringgradige Konjunktivitis beidseits
3 Langhaardackel 5 --
4 Deutscher
Schäferhund 1 geringgradige Konjunktivitis links 5 Berner Sennenhund 4 Kachexie, Anämie, Ikterus
6 Mischling 18 Katarakt beidseits matur
7 Boxer 12 Nukleosklerose beidseits
8 Rottweiler 8 Kornea links: Panus + Gefäßeinsproßung 9 Pudel-Mischling 12 Nukleosklerose beidseits
10 Boxer 10 Nukleosklerose beidseits
Tab. 3.2 Rasse, Alter (in Jahren) sowie klinische Besonderheiten bei Patienten der 2.Gruppe (Euthanasie und Probengewinnung 12 Stunden nach der Behandlung)
Schäferhund 1 Ellenbogendysplasie + Hochgradige Panostitis Konjunktivitis geringgradig beidseits
3 Malinois 2 ---
4 Collie 10 Nukleosklerose beidseits
5 Foxterrier 12 Azotämie
6 Deutscher
Schäferhund 5 ---
7 Dackel-Mix. 16 Beidseits Katarakt matur / Konjunktiven geringgradig verwaschen
8 Deutscher
Schäferhund 2 Hochgradige Hüftgelenksdysplasie 9
Deutscher
Schäferhund 1 Hochgradige Hüftgelenksdysplasie 10 West Highland
Terrier 11 Aggression / Nukleosklerose beidseits
Tab. 3.3 Rasse, Alter (in Jahren) sowie klinische Besonderheiten bei Patienten der 3.Gruppe (Euthanasie und Probengewinnung 16 Stunden nach der Behandlung)
Patienten Gruppe 3 [16 Stunden Salbenverweildauer]
Rasse Alter in
Jahren
Klinische Besonderheiten / Augenuntersuchung
1 Deutscher
Schäferhund 3 Konjunktivitis follicularis geringgradig rechts 2 Golden Retriever 9 Nukleosklerose beidseits
3 Spanischer Hütehund 8 rechts: Linsenluxation + Ablatio Retinae
4 Malinois 1 ---
5 Dackelmix 14 Katarakt beidseits matur, Retina leicht abzulösen
6 Dobermann 6 ---
7 Foxterrier-Mix ca. 12 Nukleosklerose beidseits
8 Malteser 14 Katarakt matur Gefäßatrophie Retina 9 Deutscher
Schäferhund 10 Plasmazelluläre Infiltration 3. Augenlid 10 Deutscher
Schäferhund 10 ---
3.7 Klinische Untersuchung
Die in die Untersuchung einbezogenen Patienten spiegeln ein zufälliges Spektrum der zur Euthanasie gelangenden Tiere in einer Tierärztlichen Klinik für Kleintiere wider. Ein Großteil der Patienten wurde vor dem Eintritt in die Studie über einen unterschiedlich langen Zeitraum bis zur Entscheidung zur schmerzlosen Tötung mit Arzneimitteln therapiert, für die im Schrifttum keine Hinweise für einen Einfluß auf die Glukokortikoidkinetik vorliegen (siehe Tab 3.6.1 bis 3.6.3). Es gelangten keine Patienten in die Studie, die mit Dexamethason vorbehandelt waren. In dieser Arbeit werden lediglich die Informationen über den klinischen Allgemeinzustand der Patienten angeführt, welche für das untersuchte Kompartimentsystem Auge von Bedeutung sein können.
Unmittelbar vor dem Eintritt eines Patienten in die Studie erfolgte eine Untersuchung. Hierbei wurden neben der Körpertemperatur, die Atmung, der Zustand der Schleimhäute, die kapilläre Rückfüllungszeit sowie die Mandibular- und Popliteallymphknoten untersucht. Die Auskultation des Herzens und der Lunge schloss die klinische Untersuchung ab.
Die Patienten der vorliegenden Studie wurden aufgrund verschiedener Erkrankungen euthanasiert. Tab. 3.4 listet die Erkrankungen auf. Die klinischen Untersuchungen der einzelnen Tiere ergab keine Befunde, die über die durch die jeweilige Erkrankung verursachten Veränderungen hinausgingen.
Tab. 3.4 Patientenanzahl und Grund der Euthanasie
Patientenanzahl Grund der Euthanasie
n = 16
Orthopädische Erkrankungen
(Hochgradige Hüftgelenksdysplasie, Ellenbogen-dysplasie, Cauda equina, Discopathie, Wobbler-Syndrom)
n = 3
Multiples Organversagen
(Hochgradige Herzinsuffizienz, Chronische Niereninsuffizienz, Hepathose u.a.)
n = 3 Epilepsie n = 3 Aggression
n = 1 Maligne Histiozytose n = 1 Milztumoren (rupturiert) n = 1 Leishmaniose
n = 1 Nierentumoren n = 1 Schlaganfall
3.7.1 Ophthalmologische Untersuchung
Vor Auswahl eines Patienten erfolgte eine spezielle ophthalmologische Untersuchung. Diese diente der Feststellung des Status praesens der Augengesundheit des jeweiligen Tieres. Tiere die bei der ophthalmologischen Untersuchung Symptome einer Augenkrankheit aufwiesen, wurden ausgeschlossen. Symptome, die auf altersabhängige, physiologische Veränderungen des Auges zurückzuführen sind, wurden vermerkt.
Zunächst wurde die Umgebung des Auges einer adspektorischen Kontrolle unterzogen. Dabei wurde auf Entzündungserscheinungen, die Lidstellung inklusive etwaiger fehlgestellter Wimpern, Spuren eines übermäßigen oder verminderten Tränenflusses sowie Veränderungen des 3. Augenlides (soweit ohne Anästhesie möglich) untersucht. Die Feststellung der Sehfähigkeit erfolgte durch Prüfung des Drohreflexes, die Durchführung eines Wattebausch-Tests sowie in Einzelfällen durch den Lauf des Patienten über Hindernisse.
Die spezielle Untersuchung der Augen begann mit der adspektorischen Untersuchung beider Augen ohne technische Hilfsmittel. Daran schloss sich die Untersuchung mittels Spaltlampe an. Auf die Verwendung von Medikamenten zur Verbesserung der ophthalmologischen Untersuchung ( z.B. Lokalanästhetika oder Mydriatika) wurde verzichtet. Es wurden ebenfalls keine Untersuchungen vorgenommen, die in Folge der Manipulation im Bereich der Kornea einen erhöhten Tränenfluß provozieren können (Schirmer – Tränentest, Fluoresceinprobe).
3.8 Probengewinnung und Lagerung
3.8.1 Voruntersuchungen
Zur Etablierung der Entnahmetechnik der einzelnen Proben wurde die Entnahmetechnik innerhalb eines Vorversuchs erprobt. Drei unbehandelten Augenpaaren wurden dabei Proben von Kammerwasser, Kornea, 3. Augenlid, Iris, Linse, Glaskörper und Retina (incl.
Choroidea) entnommen. Die Entnahme und Sektion der Augen erfolgte in unmittelbarem Anschluß an die Euthanasie des Patienten. Die Aufbewahrung erfolgte bei -20°C. Die Probeneinwaage erfolgte in Analogie zu REICHENBECKER (2002) in gefrorenem Zustand unmittelbar vor der Homogenisierung.
3.8.2 Versuchsaufbau
Die in den Tabellen 3.1 bis 3.3 aufgeführten Tiere erhielten einmalig eine Gabe von 0,2 ml einer 0,029 %igen dexamethasonhaltigen Augensalbe mit einer 1 ml–Spritze in den Konjunktivalsack eingegeben. Dies entspricht einer absoluten Menge von 0,058 mg Dexamethason. Die Salbengabe erfolgte am wachen Tier unter Praxisbedingungen. 6 Stunden (Gruppe 1), 11 Stunden (Gruppe 2) sowie 16 Stunden (Gruppe 3) nach der Applikation wurden die Tiere euthanasiert. Die Euthanasie erfolgte durch intravenöse Injektion von T61®
nach vorheriger intravenöser Injektionsnarkose mit Xylazin (2 mg/kg) / Levomethadon (0,2 mg/kg) oder Azepromazin (0,5 mg/kg) / Levomethadon.
3.8.3 Enukleation der Bulbi oculi
Die Enukleation beider Bulbi erfolgte unmittelbar im Anschluß an die Euthanasie des Patienten. Dabei wurde mittels eines Skalpells die Haut parallel zu den Augenlidern durchtrennt. Im weiteren Verlauf konnten die freipräparierten Lidränder mit einer Klemme gefaßt und der Bulbus unter Schonung der Konjunktiven aus der Tenon-Kapsel freipräpariert werden. Mit einer gebogenen Metzenbaumschere konnten nun nacheinander die intraorbitalen Muskeln am Bulbus abgetrennt werden. Zuletzt wurde der N. opticus mit den versorgenden Blutgefäßen dargestellt und abgesetzt.
3.8.4 Entnahme des Kammerwassers
Mittels einer Kanüle (23G x 1“) und einer 2 ml Spritze wurde im ersten Sektionsschritt Kammerwasser entnommen. Dazu wurde im medialen Augenwinkel im Übergangsbereich von Sklera und Kornea in flachem Winkel in die vordere Augenkammer eingegangen und zwischen 0,75 und 1,2 ml Kammerwasser gewonnen. Das so gewonnene Kammerwasser wurde dann 5 Minuten bei 3000 g zentrifugiert und der zellfreie Überstand bei –20 °C bis zur Probenaufarbeitung gelagert.
3.8.5 Entnahme von 3. Augenlid, Kornea, Iris und Linse
Nach Entnahme des Kammerwassers wurde das 3. Augenlid mit einer Augenpinzette und einer spitzen Schere in toto inklusive der Nickhautdrüse vorgelagert und entnommen. Durch die Inzision im Bereich der Einstichstelle für die Kammerwasserentnahme wurde anschließend die vordere Augenkammer eröffnet. Die Kornea wurde nun zirkulär am Limbus abpräpariert. In gleicher Weise wurde die Iris entnommen. Die so zugängliche Linse wurde vorsichtig aus ihrem Halteapparat gelöst. Alle Proben wurden in einzelnen Gefäßen bei –20
°C aufbewahrt.
3.8.6 Entnahme von Glaskörperanteilen und der Retina (Choroidea)
Durch den nach der Entnahme der Linse entstandenen Zugang zur hinteren Augenkammer wurden mittels einer Spritze Anteile des Glaskörpers aufgenommen. Die Menge lag bei 1,5 bis 2,5 ml. Nach Zentrifugation (5 Minuten bei 3000 g) wurde etwa 1 ml zellfreier Überstand abpipettiert und gemäß Angaben unter 3.8.5 aufbewahrt. Mit einer feinen Pinzette konnte nun die Retina in Verbund mit der Choroidea vom Ziliarkörper bis zum Sehnervenkopf, welcher mit einer feinen Schere umschnitten wurde, in toto gelöst werden. Die Probenaufbewahrung erfolgte bis zur Aufbereitung ebenfalls bei –20 °C.
3.9 Probenaufarbeitung
Die Einwaage von Kornea, Linse sowie Retina / Choroidea erfolgte in gefrorenem Zustand.
Die durchschnittlichen Mengen der eingewogenen Proben betrugen: 0,10 g für die Kornea, 0,13 g für das 3. Augenlid, 0,06 g für die Iris, 0,19 g für die Linse sowie 0,18 g für Retina / Choroidea. Nach grober Zerkleinerung der Proben mittels eines feinen Präparierbestecks wurden alle festen Proben ausschließlich Kammerwasser und Glaskörper in einem Reaktionsgefäß mit 1 ml GPP versetzt und homogenisiert (Ultra-Turrax, 8.000 U/Minute).
Kammerwasser und Glaskörper wurden bei Zimmertemperatur aufgetaut und Aliquote von
500 µl in ein Reaktionsgefäß pipettiert. Alle Proben wurden mit 1,5 ml Ethylacetat versetzt und 12 Minuten geschüttelt (Überkopfschwenker). Danach erfolgte eine Zentrifugation (3.000 g, 10 Minuten). Die Überstände wurden nach Protokollierung der Menge unter Stickstoff eingedampft. Die Lagerung der eingedampften Proben erfolgte bei –80 °C.
Vor der radioimmunologischen Messung wurden die Proben bei Raumtemperatur aufgetaut und anschließend in 210 µl GPP gelöst. Hierzu wurden alle Proben fünf Minuten in das Ultraschallbad verbracht und unmittelbar vor der Messung geschüttelt. Für die nachfolgende Messung wurden 200 µl der so gelösten Probe verwendet.
3.10 Radioimunassay (RIA)
3.10.1 Prinzip des Radioimunassay
Der RIA beruht auf einer Antigen-Antikörperreaktion (BERSON und YALOW 1964). Der zu bestimmenden Substanz, dem Antigen Dexamethason (Ag), stehen eine bekannte Menge Antikörper (Ak) sowie eine ebenfalls bekannte Menge des markierten Antigens 3 H-Dexamethason (Ag*) gegenüber.
Die Antigen-Antikörperreaktion läuft beim RIA in einem geeigneten Reaktionsmedium ab, dem unmarkiertes und markiertes Antigen zugesetzt sind. Dabei sollte die Menge des markierten Antigens in etwa der zu bestimmenden Menge Antigen entsprechen. Im anschließenden Schritt wird soviel Antiserum hinzugegeben, daß etwa die Hälfte des markierten Antigens gebunden wird. In einer definierten Inkubationszeit stellt sich ein Gleichgewicht zwischen den Komplexen A und B ein:
Komplex A: Komplex B:
Ag + Ak ↔ [ Ag Ak] Ag* + Ak ↔ [ Ag* Ak]
Ag + Ag* + Ak ↔ [ Ag Ak] + [ Ag* Ak]
Ag = unmarkiertes Antigen (zu bestimmendes Dexamethason in der Probe) Ag* = markiertes Antigen (3H-Dexamethason)
Ak = Antikörper
Die Stabilität der Komplexe hängt unmittelbar von der Affinität der Antikörper ab. Die Affinität bestimmt hierbei die Festigkeit, mit der das Antigen an den Antikörper gebunden wird.
Im Meßansatz wird nach der Inkubationszeit freies Antigen durch die Zugabe der Dextran-Aktivkohle-Suspension gebunden und abgetrennt. Das freie Antigen wird von der Aktivkohle adsorbiert und anschließend abzentrifugiert. Der großmolekulare Antigen-Antikörper-Komplex verbleibt im Überstand. Die gemessene Radioaktivität entspricht der Menge der verbliebenen Antigen*-Antikörper-Komplexe und damit auch der Menge des zu bestimmenden Antigens. Je mehr Antigen (Dexamethason aus der Augensalbe) also in der untersuchten Probe vorliegt, desto weniger radioaktives Antigen (3H-Dexamethason) wird vom Antikörper gebunden.
Für die Konzentrationsbestimmung in unbekannten Proben wird eine Eichkurve erstellt, anhand welcher die Konzentration der Proben abgelesen werden kann. Zu diesem Zweck wird dem Inkubationsmedium unmarkiertes Antigen in bekannten Konzentrationen zugesetzt.
Dadurch wird das Gleichgewicht in Abhängigkeit zur Konzentration zu Gunsten des nichtmarkierten Komplex A verschoben. Über die Messung der Gesamtradioaktivität in den jeweiligen Versuchsansätzen kann somit auf die Konzentration von unmarkiertem Antigen rückgeschlossen werden.
3.10.2 Spezifität des Antiserums
Bei dem im vorliegenden Versuchsansatz verwendeten Antikörper handelt es sich um einen polyklonalen Antikörper gegen Dexamethason-21-hemisuccinat vom Schaf. Tabelle 3.5 zeigt die Kreuzreaktivität des Antikörpers gemäß den Angaben des Herstellers (Biogenesis Ltd., Poole UK).
Tab. 3.5 Angaben zur Kreuzreaktivität des verwendeten Dexamethason-Antiserums (Angaben von Biogenesis Ltd., Poole UK).
Substanz Reaktivität (in %)
Dexamethason 100
Kortisol 1,6
11-Deoxykortisol 0,5
6-Hydrokortisol 0,3
Kortikosteron 0,5
Testosteron 0,1
Estriol < 0,1
Progesteron < 0,1
Cholesterol < 0,1
Kortison < 0,1
Das Antiserum wurde gemäß der Herstellerempfehlung mit GPP auf einen Titer von etwa 1:3200 eingestellt. Anschließend wurde das Antiserum in Portionen zur Verwendung bei jeweils 25 Proben bei –20 °C eingefroren.
3.10.3 Untersuchung der Proben
In Reaktionsgefäße (1,5 ml) wurden 100 µl 3H-Dexamethason-Ethanol-Lösung gegeben und unter Stickstoff eingedampft. Nun wurden zu jedem Ansatz 200 µl der zuvor in 210 µl GPP gelösten Probe sowie 100 µl der Antikörperlösung gegeben. Es folgte eine Inkubation über eine Stunde bei 30 °C. Unmittelbar anschließend wurden alle Proben 15 Minuten bei 4°C gekühlt. Nach der Zugabe von 500 µl Dextran-Aktivkohle-Suspension wurden alle Probenansätze weitere 17 Minuten bei 4 °C inkubiert. Nach zehnminütiger Zentrifugation (3000 g, 4 °C) wurden die Überstände abpipettiert und in 5 ml Szintillator (Aquasafe 300 Plus) gegeben. Die Messung der enthaltenen Radioaktivität erfolgte mittels β-Counter. Tab 3.6 faßt die Methode zusammen.
Tab 3.6 RIA-Arbeitsanweisung für die Standardreihe (1-22) sowie Probenmessung (23 ff.)
Röhrchen Nr. Dexamethason- Konzentration pro Ansatz 3 H-Dexamethason [µl] GPP [ µl ] Standard-Lösung (Reihe) [µl] Antikörper-Lösung [µl] Inkubation Aktivkohle- Suspension [µl] Inkubation Szint. Lsg. [ml]
1 100 800 - - - 5 - Eindampfen unter N2-Atmosphäre bis zur Trocknung -
- 200 100
- 60 Minuten bei 30 °C, danach 15 Minuten bei 4 °C -
500 - 17 Minuten bei 4 °C, dann 10 Minuten zentrifugieren ( 400 U / Minute ), flüssigen Überstand in Szintill.- Röhrchen -
5
3.10.4 Eichkurve und Berechnung
Bei der Messung liefert der β-Counter ein Ergebnis in CPM / Probe. Es werden bei jeder Messung erfaßt:
• Gesamtradioaktivität Total count (TC)
• Unspezifische Bindung non-specific binding (NSB)
• Spezifische Bindung maximum specific binding (MSB)
• Blanc Leerwert
• DXM-Standardreihe
Zur Berechnung der Dexamethasonkonzentration der einzelnen Proben wird die in Prozent errechnete Bindungsrate (in Bezug auf die Gesamtradioaktivität TC) nach Probit-Transformation mit Hilfe einer mit linearer Regression errechneten Funktion in die Dexamethasonkonzentration je Ansatz umgerechnet. Anschließend erfolgt die Korrektur der Werte mit Hilfe der für die jeweiligen Probenmatrix ermittelten Wiederfindungsrate. Die endgültige Umrechnung in pg DXM / mg Probe bzw. pg DXM / µl Probe erfolgt unter Berücksichtigung der Probeneinwaage und aller Verdünnungsstufen anhand folgender Formel:
DXM- (Wert Eichkurve) · (1,5 ml Ethylacetat-Proben-Lsg.) · (210 µl GPP-Proben-Lsg.) Konz. =
[pg/mg] (x ml Überstand Etylacetat-Proben-Lsg.) · (200 µl GPP-Proben-Lsg.) · ( x mg Probe)
3.10.5 Wiederholbarkeit und Nachweisgrenzen
Tabelle 3.7 verdeutlicht die gute Wiederholbarkeit mit dem durchgeführten radioimmunologischen Verfahren.
Tab. 3.7 Angaben zur Wiederholbarkeit (Total count = 100 %)
Für Kornea, Iris, 3. Augenlid, Linse und Retina/Choroidea (Tab. 3.4), sowie Kammerwasser und Glaskörperflüssigkeit ergeben sich unter Berücksichtigung der entsprechenden Wiederfindungsraten die in Tab. 3.8 aufgeführten Nachweisgrenzen. Die Wiederfindung liegt für die Kornea bei im Mittel 79 %, für das Kammerwasser bei 90 %, für die Iris bei 83 %, für die Linse bei 76 %, für den Glaskörper bei 90 % sowie für Retina/Choroidea bei 81 % (KIETZMANN, persönliche Mitteilung 2002).
Tab. 3.8 Nachweisgrenzen (NG) für Dexamethason (DXM) in den verschiedenen Kompartimenten des Hundeauges
Gewebe Nachweisgrenzen
(pg DXM/mg bzw. pg DXM/µl)
Retina / Choroidea 1,82
3.11 Statistische Auswertung
Die statistische Auswertung der Ergebnisse erfolgte mit Hilfe des Programms Sigma Stat®.
Für die statistische Auswertung wurden die mit der Wiederfindungsrate korrigierten und die in DXM/mg Probe bzw. DXM/µl Probe umgerechneten Werte verwendet. Der statistische Vergleich der Gruppen 1 und 2 erfolgte mit dem Mann-Whitney-Test für unabhängige, nicht normalverteilte Proben. Für alle statistischen Verfahren wurden die in Tabelle 3.9 dargestellten Signifikanzstufen in Abhängigkeit von der Irrtumswahrscheinlichkeit p ≤ 0,05 festgelegt.
Tab. 3.9 Signifikanzstufen in Abhängigkeit von der Irrtumswahrscheinlichkeit p ≤ 0,05
p- Wert Signifikanzstufe Symbol
≤ 0,001 hoch signifikant ···
≤ 0,01 signifikant ··
≤ 0,05 schwach signifikant ·
≥ 0,05 nicht signifikant
Die Angabe der Daten erfolgte als Median, 1. und 3. Quartil. Die graphische Darstellung erfolgte in Form von Median-Boxen (Abb. 3.1).
Oberer Extremwert
75.Percentil (3. Quartil)
Median 25.Percentil
(1.Quartil) Unterer Extremwert
Abb. 3.1 Darstellung einer Median-Box
4 ERGEBNISSE
4.1 Spezielle ophthalmologische Untersuchung
Tab 4.1 beinhaltet die Ergebnisse der ophthalmologischen Untersuchung. Zur Feststellung der Sehfähigkeit wurden die Drohreflexe geprüft. In Zweifelsfällen wurde ein Wattebauschtest und bei einigen Tieren auch ein Lauf über Hindernisse durchgeführt. Alle Patienten, mit Ausnahme derjenigen, die beidseits einen maturen Katarakt aufwiesen, waren sehfähig. Die anderen Patienten zeigten einen verzögerten bis teilweise fehlenden Drohreflex sowie deutliche bis vollständige Ausfälle beim Wattebauschtest und im Ausweichen von Hindernissen. Alle Patienten, die eine altersbedingte Nukleosklerose des Linsenkerns aufwiesen, zeigten keinerlei Beeinträchtigungen bei Untersuchung der Sehfähigkeit.
Zusammenhangstrennungen der Lider wurden ebenso wie fehlgestellte oder zusätzlich vorhandene Wimpern nicht auffällig. Ein Patient der Gruppe 3 wies zusätzlich einseitig eine Linsenluxation sowie eine Ablatio retinae auf. Das Sehvermögen auf diesem Auge war nicht mehr gegeben.
Tab. 4.1 Ophthalmologische Befunde in den Gruppen 1 bis 3 (Anzahl der erkrankten Augen) Ophthalmologischer
4.2 Dexamethasonkonzentration in den einzelnen Kompartimenten des Hundeauges
In den Tab. 4.2 bis 4.4 sowie den Abbildungen 4.1 bis. 4.7 sind die ermittelten Dexamethasonkonzentrationen in den einzelnen Augenkompartimenten dargestellt.
Tab. 4.2
Dexamethasonkonzentrationen in Kornea, 3. Augenlid, Iris, Linse und Retina (pg/mg) sowie Kammerwasser und Glaskörper (pg/µl); Angaben von Mittelwert, Standardabweichung sowie Median der Patienten der 1.Gruppe (6 Stunden Salbenverweildauer)
Kompartiment li 2,33 18,30 <2,52 10,12 <1,73 <0,66 <1,82 5 li 0,83 20,29 10,05 <5,47 <1,73 <0,66 <1,82 8
Tab. 4.3
Dexamethasonkonzentrationen in Kornea, 3. Augenlid, Iris, Linse und Retina (pg/mg) sowie Kammerwasser und Glaskörper (pg/µl); Angaben von Mittelwert, Standardabweichung sowie Median der Patienten der 2.Gruppe (11 Stunden Salbenverweildauer)
Kompartiment
Tab. 4.4
Dexamethasonkonzentrationen in Kornea, 3. Augenlid, Iris, Linse und Retina (pg/mg) sowie Kammerwasser und Glaskörper (pg/µl); Angaben von Mittelwert, Standardabweichung sowie Median der Patienten der 3.Gruppe (16 Stunden Salbenverweildauer)
Kompartiment li <0,66 <3,28 <2,52 <5,47 <1,73 <0,66 <1,82 3
re <0,66 <3,28 <2,52 <5,47 <1,73 <0,66 <1,82 li <0,66 <3,28 <2,52 <5,47 <1,73 <0,66 <1,82 4 li <0,66 <3,28 <2,52 <5,47 <1,73 <0,66 <1,82 9
Standard-Abweichung <0,66 4,89 9,26 <5,47 <1,73 <0,66 <1,82 Median <0,66 2,07 6,66 <5,47 <1,73 <0,66 1,83
Abb. 4.1 Vergleichende Darstellung der Dexamethasonkonzentration im Kammerwasser (pg Dexamethason / µl Kammerwasser) 6, 11 und 16 Stunden nach der Behandlung mit Angabe der entsprechenden statistischen Signifikanz
0 3 6 9 12 15
pg DXM / µ l Kammerwasser
1. 2. 3.
Gruppe 1 (6 Stunden) Gruppe 2 (11 Stunden) Gruppe 3 (16 Stunden) DXM im Kammerwasser in pg / µ l
Die Konzentration des Dexamethason im Kammerwasser liegt 6 Stunden nach Applikation mit einem Mittel von 4,13 pg Dexamethason / µl Kammerwasser deutlich niedriger als in den übrigen Strukturen der vorderen Augenkammer. Die Messungen nach 11 und 16 Stunden belegen einen schwach signifikanten Konzentrationsabfall (p=0,03) von der 1. Gruppe (6 Stunden) zur 2. Gruppe (11 Stunden) sowie einen stark signifikanten Abfall (p=0,00) zur 3.
Gruppe (16 Stunden).
Abb. 4.2 Vergleichende Darstellung der Dexamethasonkonzentration in der Kornea
(pg Dexamethason / mg Kornea) 6, 11 und 16 Stunden nach der Behandlung mit Angabe der entsprechenden statistischen Signifikanz
0 10 20 30 40 50 60 70 80
DXM in pg / mg Kornea
1. 2. 3.
Gruppe 1 (6 Stunden) Gruppe 2 (11 Stunden) Gruppe 3 (16 Stunden) DXM in der Kornea in pg / mg
In der Kornea läßt sich 6 Stunden nach Applikation eine im Mittel 36,43 pg Dexamethason / mg Kornea betragende Arzneimittelkonzentration nachweisen. Der Abfall der Konzentration von 6 bis 11 Stunden nach der Behandlung auf ein Mittel von 25,20 pg Dexamethason / mg Kornea ist statistisch nicht signifikant (p=0,117). Zur 16 Stunden-Gruppe fällt die Arzneimittelkonzentration dann signifikant ab (Mittelwert 4,31 pg Dexamethason / mg Kornea; p=0,00).
Abb. 4.3 Vergleichende Darstellung der Dexamethasonkonzentration im 3. Augenlid
(pg Dexamethason / mg 3. Augenlid) 6, 11 und 16 Stunden nach der Behandlung mit Angabe der entsprechenden statistischen Signifikanz
0 10 20 30 40 50 60 70
pg DXM / mg 3. Augenlid
1. 2. 3.
Gruppe 1 (6 Stunden) Gruppe 2 (11 Stunden) Gruppe 3 (16 Stunden) DXM im 3.Augenlid in pg / mg
Im 3. Augenlid finden sich sowohl 6 Stunden (Mittelwert 18,53 pg Dexamethason / mg 3.
Augenlid) als auch 12 Stunden (Mittelwert 24,59 pg Dexamethason / mg 3. Augenlid) und 16 Stunden nach der Behandlung (Mittelwert 9,17 pg Dexamethason / mg 3. Augenlid) deutlich meßbare Werte. Der Konzentrationsabfall findet über den gemessenen Zeiträumen in geringerem Umfang als in den Strukturen innerhalb der vorderen Augenkammer statt. Die Konzentrationsabnahme von der 1. zur 2. Gruppe ist statistisch nicht signifikant (p=0,617).
Die Abnahmen von der 2. zur 3. Gruppe (p= 0,013) ist ebenso wie von der 1. zur 3. Gruppe (p= 0,022) schwach signifikant.
Abb. 4.4 Vergleichende Darstellung der Dexamethasonkonzentration in der Iris
(pg Dexamethason / mg Iris) 6, 11 und 16 Stunden nach der Behandlung mit Angabe der entsprechenden statistischen Signifikanz
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
pg DXM / mg Iris
1. 2. 3.
Gruppe 1 (6 Stunden) Gruppe 2 (11Stunden) Gruppe 3 (16 Stunden) DXM in der Iris in pg / mg
In der Iris finden sich nach 6 (Mittelwert 22,44 pg Dexamethason / mg Iris) und 11 Stunden Salbenverweildauer (Mittelwert 15,49 pg Dexamethason / mg Iris) deutlich meßbare Werte.
Nach 16 Stunden läßt sich ein deutlich niedriger Wert (Mittelwert 2,63 pg Dexamethason / mg Iris) messen. Während die Konzentrationsabnahme von der 1. zur 2. Gruppe statistisch nicht signifikant ist (p= 0,25) ist, erfolgt ein hoch signifikanter Abfall zur 3. Gruppe (p=
0,00).
Abb. 4.5 Vergleichende Darstellung der Dexamethasonkonzentration in der Linse
(pg Dexamethason / mg Linse) 6, 11 und 16 Stunden nach der Behandlung mit Angabe der entsprechenden statistischen Signifikanz
0 1 2 3 4 5
pg DXM / mg Linse
1. 2. 3.
Gruppe 1 (6 Stunden) Gruppe 2 (11 Stunden) Gruppe 3 (16 Stunden) DXM in der Linse in pg / mg
In der Linse lassen sich im Gegensatz zu den Kompartimenten der vorderen Augenkammer und dem 3. Augenlid kaum Konzentrationen oberhalb der Nachweisgrenze messen. Die Mittelwerte in allen 3 Gruppe liegen unterhalb der kleinsten zuverlässig nachweisbaren
In der Linse lassen sich im Gegensatz zu den Kompartimenten der vorderen Augenkammer und dem 3. Augenlid kaum Konzentrationen oberhalb der Nachweisgrenze messen. Die Mittelwerte in allen 3 Gruppe liegen unterhalb der kleinsten zuverlässig nachweisbaren