Einleitung
Obwohl Kuhmilch seit über 8000 Jahren von Menschen konsumiert wird, stellt die Analytik wasser-löslicher Vitamine bis zum heutigen Tag eine große Herausforderung dar. Gängige Analysenverfahren für wasserlösliche Vitamine in Milch wandeln zu Beginn verschiedene Vitamere -chemisch unter-schiedliche Formen eines Vitamins (BURK und WINZLER, 1943) - in ein gängiges Vitamer um und machen es so unmöglich, die natürliche Verteilung und das Spektrum der originär vorkommenden Vitamere in der Milch zu untersuchen. Neue Methoden und Ansätze sind daher nötig, um den nativen Gehalt und die Verteilung aller relevanten Vitamere in Milch beschreiben zu können.
Material und Methoden
UHPLC: Trennung und Quantifizierung der relevanten Vitamere für Vitamin B1 (Thiamin-Diphosphat, Thiamin-Monophosphat und Thiamin), Vitamin B2 (Riboflavin-Monophosphat, Ribofla-vin) und Vitamin B6 (Pyridoxamin-Monophosphat, Pyridoxamin, Pyridoxal-Monophosphat, Pyrido-xal, Pyridoxin und 4-Pyridoxinsäure) wurden durch unterschiedliche Methoden der Gradienten- Eluti-on auf einem Waters Acquity™ Ultra Performance Flüssigkeitschromatographie-System (UPLC™) (Waters, Milford, USA) mit einem Acquity™ Fluoreszenz-Detektor und einer Acquity UPLC™ Säule (HSS T3, 100 mm×2.1 mm i.d., 1.7 μm) durchgeführt.
Validierung: Die entwickelten Methoden wurden nach den Empfehlungen internationaler Richtlinien (ICH, 2005 Q2(R1); USP 37, 1225; etc.) durchgeführt. Die Richtigkeit der entwickelten Methoden konnte durch den Einsatz eines zertifizierten Referenzmateriales (ERM®-BD600, Trockenmilchpulver) bestätigt werden.
Proben: Unterschiedliche Handelsmilchproben sowie Rohmilch und Rohmilch-Einzelgemelke wurden untersucht.
Ergebnisse und Diskussion
Da es gerade für die Untersuchung der nativen Vitamer-Verteilung unerlässlich ist, alle möglichen Vitamere im Zuge der Probenvorbereitung zu erhalten, wurde bei der Methodenentwicklung besonde-res Augenmerk hierauf gelegt. Für die einzelnen Vitamine konnte folgende Erkenntnisse gewonnen werden:
Vitamin B1: Die für die Bestimmung von Vitamin B1 entwickelte Methode ermöglicht die Trennung dreier möglicher Vitamere innerhalb von nur 2.5 Minuten. Es konnte erstmalig gezeigt werden, dass Vitamin B1 in Kuhmilch als Thiamin-Monophosphat und Thiamin vorliegt (Abbildung 1). Die Korre-lation des Gehaltes an B1-Vitameren sowie das Verhältnis der beiden häufigsten Vitamere wies – in Hinblick auf das eingesetzte Haltbarmachungsverfahren (Pasteurisierung, Extended shelf-life durch Mikrofiltration, Ultrahocherhitzung, etc.) – keine statistische Signifikanz auf (p>0.05, CHAID Ent-scheidungsbaum) (SCHMIDT et al. 2017a).
Vitamin B2: Für die Bestimmung von Vitamin B2 war es möglich, eine Methode zu entwickeln, die alle relevanten B2- und B6-Vitamere simultan erfasst. Die Trennung der sieben Zielanalyten konnte in weniger als 6 Minuten realisiert werden (SCHMIDT et al. 2017b). Alle untersuchten Proben bestäti-gen die Annahme, dass Vitamin B2 als Riboflavin und Riboflavin-Monophosphat vorliegt (Abbildung 2).
Vitamin B6: Die Untersuchung von Vitamin B6 in Kuhmilch ergab, dass dieses in vier verschiedenen Vitameren, namentlich Pyridoxamin-Monophosphat, Pyridoxamin, Pyridoxal-Monophosphat und Pyridoxal vorliegt (Abbildung 2). Darüber hinaus konnte der biologisch nicht als Vitamin aktive
Kata-bolit des Vitamin B6-Metabolismus, die 4-Pyridoxinsäure, erstmalig umfangreich beschrieben werden, welcher in Handelsmilch mit bis zu 2.69 µmol/L vorliegen kann. Bezugnehmend auf thermische Halt-barmachungsverfahren ist festzuhalten, dass vor allem Pyridoxal durch Hitzeeinwirkung im Zuge der Prozessierung stark abgebaut wird. Dies gilt auch für die biologisch nicht aktive Form, die 4-Pyridoxinsäure.
Thiamin overlay Enzy_Herb1
Project Name: Vitamine 2013 Reported by User: System
Report Method: Thiamin overlay Enzy_Herb1 Date Printed:
17241 25/03/2015
Report Method ID: 17241
13:17:00 Europe/Vienna
EU
0.00 250.00 500.00 750.00 1000.00 1250.00 1500.00 1750.00
Minutes
0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00
Abbildung 1:Chromatographische Trennung von B1-Vitameren Thiamin-Monophosphat (TMP) und Thiamin (Thia) in pasteurisierter Kuhmilch.
Abbildung 2: Chromatographische Trennung von B6-und B2-Vitameren (Pyridoxamin-Monophosphat, PMP; Pyridoxamin, PM; Pyridoxal-Monophosphat, PLP; Pyridoxal, PL; Pyridoxin, PN;
4-Pyridoxinsäure, 4-PA bzw. Riboflavin-Monophosphat, FMN; Riboflavin, Rib) in zertifiziertem Refe-renzmaterial (ERM®-BD600, Trockenmilchpulver)
Thia
TMP
PMP PM
PL PN
PLP
4-PA FMN
Rib
Zusammenfassung
Bisher beschriebene Methoden zur Bestimmung der wasserlöslichen Vitamine B1, B2 und B6 wandeln alle möglichen Vitamere in ein gängiges Vitamer um und machen es so unmöglich, die native Vertei-lung in Kuhmilch zu bestimmen. Durch neue Ultra-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie- Me-thoden ist es erstmals möglich, die native Vitamer-Zusammensetzung in der Matrix Milch zu be-schreiben. Für Vitamin B1 konnte ermittelt werden, dass dieses in Milch als Thiamin und Thiamin- Monophosphat vorkommt, während Vitamin B2 als Riboflavin-Monophosphat und als Riboflavin vor-liegt. Bei Vitamin B6 gestaltet sich die Zusammensetzung noch komplexer, da dieses in Form von Pyridoxamin-Monophosphat, Pyridoxamin, Pyridoxal-Monophosphat und Pyridoxal auftritt. Der An-satz, den Gesamt-Vitamingehalt durch die Summe der einzelnen Vitamere zu beschreiben, führte auch erstmalig zur umfassenden Beschreibung des Kataboliten des Vitamin B6-Metabolismus, der 4-Pyridoxinsäure, welche in Kuhmilch mit bis zu 2.69 µmol/L vorliegt.
Abstract
Well established methods for the quantitation of water-soluble vitamins B1, B2 and B6 convert all pos-sible vitamers into one common vitamer, and thus annihilate the possibility to study the native distri-bution of vitamers in cow’s milk. Using newly developed ultra-high performance liquid chromatog-raphy methods, the characterization of the native distribution of vitamers in cow’s milk was possible for the first time. Results show that vitamin B1 is present as thiamine and thiamine monophosphate, and vitamin B2 as riboflavin monophosphate and riboflavin. For vitamin B6, complexity increases sig-nificantly as it is present as pyridoxamine monophosphate, pyridoxamine, pyridoxal monophosphate and pyridoxal. Furthermore, the approach of sustaining the native vitamers distribution led to the first comprehensive investigation of the vitamin B6 metabolism catabolite 4-pyridoxic acid, which was present in cow’s milk with up to 2.69 µmol/L.
Literatur
BURK D, and WINZLER RJ, 1943: Heat-labile, avidin-uncombinable, species-specific and other vit-amers of biotin. Science 97, 57-60
SCHMIDT A, PRATSCH H, SCHREINER MG, MAYER HK, 2017a: Determination of the native forms of vitamin B1 in bovine milk using a fast and simplified UHPLC method. Food Chemistry 229, 452-457
SCHMIDT A, SCHREINER MG, MAYER HK, 2017b: Rapid determination of the various native forms of vitamin B6 and B2 in cow’s milk using ultra-high performance liquid chromatography. Jour-nal of Chromatography A, http://doi.org/10.1016/j.chroma.2017.04.009
Adresse der Autoren
AG Lebensmittechemie, Department für Lebensmittelwissenschaften und -technologie, Universität für Bodenkultur, Muthgasse 11, 1190 Wien
* Ansprechpartner: DI Anatol Schmidt, anatol.schmidt@boku.ac.at