Analyse der Deletionsproteine in Embryonen von Xenopus laevis

Um die Auswirkungen der Deletionsproteine auf die Entwicklung von Embryonen zu analysieren, wurden diese in Embryonen exprimiert. Als Kontrollen dienten Flag L_III -exprimierende sowie nicht injizierte Embryonen.

Für Untersuchungen im Westernblot wurden Embryonen verschiedener Stadien in flüssigem Stickstoff schockgefroren oder für die Immunhistologie fixiert. Die Eintei-lung der EntwickEintei-lungsstadien erfolgte nach Nieuwkop und Faber (1967). Die Entwick-lung von Deletionsprotein-exprimierenden Embryonen unterschied sich bis zur Ga-strula (Stadium 10 ¹₂ bis 11) nicht von der der Kontrollembryonen. Kurz nach Beginn der Gastrulation entstanden auf der Oberfläche von FlagΔN rod L_III-exprimierenden Embryonen Pigmentstörungen. Am Ende der Gastrulation (Stadium 12) (Abbildung 2.8 A und B) befanden sich Schichten von abgestorbenen Zellen auf den Embryonen.

Die Embryonen entwickelten sich allerdings weiter (Abbildung 2.8 C und D), obwohl ihre Entwicklungsgeschwindigkeit im Vergleich zu der von Kontrollembryonen verlang-samt war. Die Penetranz des beschriebenen Phänotyps war abhängig von der Qualität des Geleges. Während 60-80 % der FlagΔN rod L_III-exprimierenden Embryonen den oben beschriebenen Phänotyp zeigten, entwickelten sich die übrigen 20-40 % normal.

5-10 % der Embryonen, die den Flag ΔN rod L_III-Phänotyp zeigten, konnten die Gastrulationsbewegungen nicht abschließen. Sie zogen den Dotterpfropf nicht ein und bildeten eine Exogastrula (Abbildung 2.8 D).

Embryonen, die die Deletionsproteine Flag ΔC rod L_III (Abbildung 2.8 E-G) und Flag ΔNΔC rod L_III (Abbildung 2.8 H-J) exprimierten, entwickelten sich ähnlich.

Auch ihre Entwicklung verlief bis zum Ende der Gastrulation in Stadium 12 nor-mal, jedoch konnten sie die Gastrulationsbewegungen nicht abschließen. Der Dot-terpfropf wurde nicht vollständig eingezogen und eine Exogastrula entstand. Auch dieser Phänotyp zeigte keine 100 %ige Penetranz. Nur 40-50 % der Flag ΔC rod L_III -exprimierenden Embryonen zeigten diesen Phänotyp, während seine Penetranz bei Flag ΔNΔC rod L_III-exprimierenden Embryonen mit 20-40 % noch geringer war.

Im Gegensatz zu den Deletionsproteinen hatte die Expression von Flag Lamin L_III keine Auswirkungen auf die Embryonalentwicklung von Xenopus laevis (vgl. Abbil-dung 2.8 K,L mit M,N). Insgesamt schien die Expression von Flag ΔN rod L_III den

Abbildung 2.8 Äußerer Phänotyp von Lamin L_III-Deletionsprotein-exprimierenden Embryonen:L_III -Deletionsproteine wurden durch Injektion von mRNA in die Zygote exprimiert. Die Embryonen wur-den im Stadium 12 und 19 fotografiert. A-D zeigen FlagΔN rod L_III-exprimierende Embryonen, E-G Flag ΔC rod L_III-exprimierende Embryonen, H-J Flag ΔNΔC rod L_III-exprimierende Em-bryonen, K und L Flag L_III-exprimierende Embryonen, M und N Wildtypembryonen. Die Lamin L_III-Deletionsprotein-exprimierenden Embryonen zeigen entweder Schichten von abgestorbenen Zel-len auf ihrer Oberfläche (Pfeil) oder haben die Gastrulationsbewegung nicht vollständig abschließen

stärksten Effekt auf die Entwicklung der Embryonen zu haben. Die Expression der Deletionsproteine wurde durch eine Westernblotanalyse kontrolliert.

Dafür wurden Deletionsprotein-exprimierende Embryonen in verschiedenen Ent-wicklungsstadien in flüssigem Stickstoff schockgefroren, ihre Proteine isoliert, gelelek-trophoretisch aufgetrennt und auf PVDF Membranen übertragen. Die Immundetekti-on erfolgte mit dem mImmundetekti-onoklImmundetekti-onalen Antikörper M2, der gegen das Flag-Epitop gerichtet ist.

Für die Expressionskontrolle der Deletionsproteine wurden Embryonen der Stadien 7, 9, 10 und 19 aufgetragen und für die Expressionskontrolle von Flag LIII Wildtyp die Stadien 7, 9, 10, 12 und 21. Pro Deletionsprotein und Stadium wurden die Proteine eines Embryos aufgetrennt (Abbildungen 2.9, 2.10 und 2.11). Da die Embryonen sich auch über die Gastrula hinaus weiterentwickelten, könnte angenommen werden, dass die Deletionsproteine nicht ausreichend translatiert wurden oder in späteren Stadien bereits Protein abgebaut wurde. In diesem Fall müsste die detektierte Deletionsprote-inmenge sinken. Bei allen drei Deletionsproteinen ist allerdings ein Anstieg der Pro-teinmenge zu beobachten (Abbildung 2.9, Bahn 1-4 für Flag ΔN rod L_III, und, Bahn 6-9 für Flag ΔC rod L_III, sowie Abbildung 2.10, Bahn 1-4 für Flag ΔNΔC rod L_III).

Im Vergleich zum Stadium 10 war das Signal im Stadium 19 deutlich stärker, d.h. die Proteinmenge stieg zwischen Stadium 10 und 19 deutlich an.

Um zu sehen, wann die Embryonen detektierbare Mengen der Deletionsproteine translatiert hatten, wurden frühe Stadien aufgetragen (Abbildungen 2.12 und 2.13).

Flag ΔN rod L_III zeigte erst ab dem Stadium 6 (Abbildung 2.12, Bahn 3) ein sehr schwaches Signal, während Flag ΔC rod L_III bereits im Stadium 4 detektierbar war (Abbildung 2.12, Bahn 8). Die Doppelmutante zeigte schon ab Stadium 2 ein schwaches Signal (Abbildung 2.13, Bahn 4), im Stadium 4 konnte sie nicht detektiert werden (Bahn 5). Hier war entweder ein Embryo aufgetragen worden, der Flag ΔNΔC rod L_III nicht exprimiert hat oder bei dem die Proteine nicht vollständig isoliert worden waren. Im Stadium 6 (Bahn 6) war wieder ein schwaches Signal zu sehen.

Die unterschiedlich stark ausgeprägten Phänotypen innerhalb einer mit Flag ΔN rod L_III injizierten Injektionsserie lassen vermuten, dass die Embryonen die Möglich-keit haben, den Effekt des Deletionsproteins zu kompensieren, eventuell auf Grund von unterschiedlichen Konzentrationen von Flag ΔN rod L_III in den Embryonen. Da-her wurden neben Embryonen verschiedener Stadien auch welche mit verschiedenen Phänotypen aufgetragen (Abbildung 2.14). Die Detektion der Deletionsproteine

er-Abbildung 2.9 Westernblotanalyse von L_III-Deletionsproteinen nach Expression inXenopus Embryo-nen:Die beiden Lamin L_III-Deletionsproteine FlagΔN rod L_III und Flag ΔC rod L_III wurden durch Injektion von mRNA in die Zygote exprimiert. Embryonen wurden in den Entwicklungsstadien 7, 9, 10 und 19 fixiert und die Proteine für die Analyse aufbereitet. Proteine von jeweils einem Embryo wurden in einem 10 %igen Gel aufgetrennt, im Westernblot auf eine PVDF-Membran übertragen und durch Chemilumineszenzreaktion mit Hilfe des monoklonalen Antikörpers M2 als primären Antikör-per nachgewiesen. Die Expositionszeit betrug eine Minute. Die Position der Markerproteine ist links in kD angegeben.

Abbildung 2.10 Westernblotanalyse von L_III-Deletionsproteinen nach Expression inXenopus Embryo-nen:Das Lamin L_III-Deletionsprotein FlagΔNΔC rod L_III wurde durch Injektion von mRNA in die Zygote exprimiert. Embryonen wurden in den Entwicklungsstadien 7, 9, 10 und 19 fixiert und die Proteine für die Analyse aufbereitet. Proteine von jeweils einem Embryo wurden in einem 10 %igen Gel aufgetrennt, im Westernblot auf eine PVDF-Membran übertragen und durch Chemilumines-zenzreaktion mit Hilfe des monoklonalen Antikörpers M2 als primären Antikörper nachgewiesen.

Die Expositionszeit betrug eine Minute. Die Position der Markerproteine ist links in kD angegeben.

Abbildung 2.11 Westernblotanalyse von Flag L_III Wildtyp nach Expression in Xenopus Embryonen:

Flag L_IIIWildtyp wurde durch Injektion von mRNA in Embryonen exprimiert. Während der Ent-wicklung wurden Embryonen jeweils in den Stadien 7, 9, 10, 12 und 21 fixiert und die Proteine für die Analyse aufbereitet. Proteine von jeweils einem Embryo wurden in einem 10 %igen Gel aufge-trennt, im Westernblot auf eine PVDF-Membran übertragen und durch Chemilumineszenzreaktion mit Hilfe des monoklonalen Antikörpers M2 als primären Antikörper nachgewiesen. In den Bahnen 6-8 wurden die Proteine von nicht injizierten Embryonen der Stadien 10, 12 und 21 aufgetragen. Die Expositionszeit betrug eine Minute. Die Position der Markerproteine ist links in kD angegeben.

Abbildung 2.12 Westernblotanalyse von L_III-Deletionsproteinen nach Expression inXenopus Embryo-nen:Die beiden Lamin L_III-Deletionsproteine FlagΔN rod L_III und FlagΔC rod L_III wurden durch Injektion von mRNA in die Zygote exprimiert. Embryonen wurden in den Entwicklungs-stadien 2, 4, 6, 8 und 10 fixiert und die Proteine für die Analyse aufbereitet. Proteine von jeweils einem Embryo wurden in einem 10 %igen Gel aufgetrennt, im Westernblot auf eine PVDF-Membran übertragen und durch Chemilumineszenzreaktion mit Hilfe des monoklonalen Antikörpers M2 als primären Antikörper nachgewiesen. Die Stadien 8 und 10 von Flag ΔC rod L_III-exprimierenden Embryonen sind in Abbildung 2.13 zu finden. Die Expositionszeit betrug eine Minute. Die Position der Markerproteine ist links in kD angegeben.

Abbildung 2.13 Westernblotanalyse von L_III-Deletionsproteinen nach Expression inXenopus Embryo-nen:Proteine von jeweils einem FlagΔC rod L_III-exprimierenden Embryo im Stadium 8 bzw. 10 sowie Proteine von jeweils einem FlagΔNΔC rod L_III-exprimierenden Embryo im Stadium 2, 4, 6, 8 und 10 wurden in einem 10 %igen Gel aufgetrennt, im Westernblot auf eine PVDF-Membran übertragen und durch Chemilumineszenzreaktion mit Hilfe des monoklonalen Antikörpers M2 als primären Antikörper nachgewiesen. Die Expositionszeit betrug eine Minute. Die Position der Mar-kerproteine ist links in kD angegeben.

folgte mit dem Antikörper M2 gegen das Flag-Epitop. Wie bereits vermutet war im Embryo, der mit FlagΔN rod L_III injiziert wurde, aber keine phänotypische Verände-rung zeigte, auch weniger Protein detektierbar (Abbildung 2.14, Bahn 1). Als Vergleich wurden Embryonen desselben Stadiums aufgetragen, die entweder abgestorbene Zellen auf ihrer Oberfläche aufwiesen oder eine Exogastrula zeigten. In beiden Fällen war die detektierte Proteinmenge deutlich höher (Bahn 2 und 3).

Die Verteilung der Deletionsproteine in embryonalen Kernen wurde durch indi-rekte Immunfluoreszenzfärbung von Kryostatschnitten analysiert. Dafür wurden die Embryonen fixiert, in 15 % Fischgelatine eingebettet und durchgefroren. Es wurden 10 μm dicke Kryostatschnitte hergestellt. Die Detektion der Deletionsproteine erfolg-te mit dem primären Antikörper M2 und als sekundärer Antikörper wurde ein Cy3 konjugierter Antikörper verwendet. Die Verteilung des endogenen Lamins L_III wurde in Kontrollembryonen bis zum Stadium 9 mit dem Antikörper Nuc 195 analysiert.

Bei Embryonen im Stadium 21 wurde das somatische Lamin B2 mit dem Antikörper L7-8C6 detektiert.

Embryonen, die das Deletionsprotein Flag ΔN rod L_III exprimierten, zeigten die ersten phänotypischen Veränderungen im Stadium 10 ¹₂ - 11. In den Stadien 7 und 9 zeigten diese Embryonen eine gleichmäßige Verteilung des Deletionsproteins

(Abbil-Abbildung 2.14 Westernblotanalyse der von FlagΔN rod L_IIIerzeugten unterschiedlichen Phänotypen:

Das Deletionsprotein FlagΔN rod L_IIIwurde durch Injektion von mRNA in die Zygote exprimiert.

Embryonen unterschiedlichen Phänotyps wurden im Stadium 18 fixiert und die Proteine für die Analyse aufbereitet. Proteine von jeweils einem Embryo wurden in einem 10 %igen Gel aufgetrennt, im Westernblot auf eine PVDF-Membran übertragen und durch Chemilumineszenzreaktion mit Hilfe des monoklonalen Antikörpers M2 als primären Antikörper nachgewiesen. Die Expositionszeit betrug eine Minute. Die Position der Markerproteine ist links in kD angegeben.

dung 2.15, A-D), was durch die für Lamine typische Ring-Färbung deutlich wurde.

Zwischen Stadium 9 und 10 änderte sich bei diesen Embryonen die Morphologie der Kernhülle. Diese zeigte eine unregelmäßige Form. Zusätzlich schien das Deletionspro-tein Aggregate an der Kernmembran zu bilden. Im weiteren Verlauf der Embryonal-entwicklung (Abbildung 2.15, E+F) verstärkte sich die Aggregatbildung, wobei sich aber die Form der Kernhülle nicht mehr veränderte (Abbildung 2.15, E+F). Aller-dings bildeten sich an einigen Stellen der Kernmembran Ausstülpungen, die sich z.T.

auch von der Kernmembran abschnürten. Trotz dieser extremen Veränderungen in der Kernstruktur entwickelten sich die Embryonen weiter. Es war leider nicht möglich zu untersuchen, ob die Expression des Deletionsproteins Flag ΔN rod L_III einen Ein-fluß auf die Verteilung des endogenen Lamins L_III hatte, da es mit den vorhandenen L_III-Antikörpern keine Möglichkeit gab, zwischen L_III und den Deletionsproteinen zu diskriminieren.

Embryonen, die das Deletionsprotein FlagΔC rod L_III exprimierten, zeigten ebenso wie FlagΔN rod L_III in den Stadien 7 und 9 (Abbildung 2.16, A-D) eine gleichmäßige Verteilung des Deletionsproteins an der Kernmembran. Ab Stadium 10 (Abbildung 2.16, E+F) zeigten sich in den Kernen dieser Embryonen sowohl morphologische

Ver-Abbildung 2.15 Lokalisation von FlagΔN rod L_IIIin Embryonen durch indirekte Immunfluoreszenzfär-bung von Gefrierschnitten:FlagΔN rod L_III wurde durch Injektion von mRNA in die Zygote exprimiert. Embryonen der Stadien 7, 9, 10 und 21 wurden fixiert und nach Kryoprotektion tief-gefroren. Von diesen Proben wurden 10μm dicke Kryostatschnitte hergestellt. FlagΔN rod L_III wurde durch indirekte Immunfluoreszenzfärbung mit dem monoklonalen Antikörper M2 als primären und Cy3-gekoppelten Ziegeα-Maus-Antikörper als sekundären Antikörper nachgewiesen. Die DNA wurde mit DAPI angefärbt.

änderungen der Kernhülle als auch die Aggregatbildungen. Der in Abbildung 2.16 A und B gezeigte Kern besteht aus Karyomeren. Diese Kernform ist nicht auf die Ex-pression des Deletionsproteins zurückzuführen, sondern ist eine typische Kernform in Furchungsembryonen (Montag et al., 1988). In den Kernen von Embryonen im Sta-dium 21 zeigten sich die stärksten Aggregatbildungen, was durch die Zunahme der Synthese des Deletionsproteins erklärbar ist. Wurden die Kerne von Embryonen im Stadium 21 bei höherer Vergrößerung (Abbildung fig:EmbryonenC, I+J) analysiert, so deckte sich bei einigen Zellkernen die Verteilung des Deletionsproteins Flag ΔC rod L_III mit der der DNA.

Die Expression des Deletionsproteins Flag ΔNΔC rod L_III in Embryonen führte in den Stadien 7 und 9 (Abbildung 2.17, A-D) zu einer gleichmäßigen Verteilung entlang der Kernhülle. Ab Stadium 10 (Abbildung 2.17, E+F) bildeten sich Aggregate des Deletionsproteins Flag ΔNΔC rod L_III an der Kernhülle, deren Ausprägung sich bis zum Stadium 21 noch verstärkte. Von einigen Kernen wurden Deletionsproteine enthaltende Vesikel abgeschnürt.

Zur Kontrolle wurde Flag L_III Protein in Embryonen exprimiert (Abbildung 2.18, A-F). Diese Embryonen entwickelten sich normal, und waren von Wildtypembryonen nicht unterscheidbar (Abbildung 2.19, A-F). Das exprimierte Flag L_III zeigte die für Lamine typische Verteilung entlang der Kernmembran. Aus diesen Ergebnissen kann geschlossen werden, dass die oben beschriebenen Veränderungen durch die Expression der Deletionsproteine hervorgerufen wurden. Eine Erklärung für das identische Ver-halten der Deletionsproteine im Embryo, aber ihre unterschiedlichen phänotypischen Auswirkungen auf den ganzen Organismus, kann bislang nicht gegeben werden.