änderungen der Kernhülle als auch die Aggregatbildungen. Der in Abbildung 2.16 A und B gezeigte Kern besteht aus Karyomeren. Diese Kernform ist nicht auf die Ex-pression des Deletionsproteins zurückzuführen, sondern ist eine typische Kernform in Furchungsembryonen (Montag et al., 1988). In den Kernen von Embryonen im Sta-dium 21 zeigten sich die stärksten Aggregatbildungen, was durch die Zunahme der Synthese des Deletionsproteins erklärbar ist. Wurden die Kerne von Embryonen im Stadium 21 bei höherer Vergrößerung (Abbildung fig:EmbryonenC, I+J) analysiert, so deckte sich bei einigen Zellkernen die Verteilung des Deletionsproteins Flag ΔC rod LIII mit der der DNA.
Die Expression des Deletionsproteins Flag ΔNΔC rod LIII in Embryonen führte in den Stadien 7 und 9 (Abbildung 2.17, A-D) zu einer gleichmäßigen Verteilung entlang der Kernhülle. Ab Stadium 10 (Abbildung 2.17, E+F) bildeten sich Aggregate des Deletionsproteins Flag ΔNΔC rod LIII an der Kernhülle, deren Ausprägung sich bis zum Stadium 21 noch verstärkte. Von einigen Kernen wurden Deletionsproteine enthaltende Vesikel abgeschnürt.
Zur Kontrolle wurde Flag LIII Protein in Embryonen exprimiert (Abbildung 2.18, A-F). Diese Embryonen entwickelten sich normal, und waren von Wildtypembryonen nicht unterscheidbar (Abbildung 2.19, A-F). Das exprimierte Flag LIII zeigte die für Lamine typische Verteilung entlang der Kernmembran. Aus diesen Ergebnissen kann geschlossen werden, dass die oben beschriebenen Veränderungen durch die Expression der Deletionsproteine hervorgerufen wurden. Eine Erklärung für das identische Ver-halten der Deletionsproteine im Embryo, aber ihre unterschiedlichen phänotypischen Auswirkungen auf den ganzen Organismus, kann bislang nicht gegeben werden.
Abbildung 2.16 Lokalisation von FlagΔC rod LIIIin Embryonen durch indirekte Immunfluoreszenzfär-bung von Gefrierschnitten:FlagΔC rod LIIIwurde durch Injektion von mRNA in die Zygote exprimiert. Embryonen der Stadien 7, 9, 10 und 21 wurden fixiert und nach Kryoprotektion tief-gefroren. Von diesen Proben wurden 10μm dicke Kryostatschnitte hergestellt. FlagΔC rod LIII wurde durch indirekte Immunfluoreszenzfärbung mit dem monoklonalen Antikörper M2 als primären und Cy3-gekoppelten Ziegeα-Maus-Antikörper als sekundären Antikörper nachgewiesen. Die DNA wurde mit DAPI angefärbt.
Abbildung 2.17 Lokalisation von Flag ΔNΔC rod LIII in Embryonen durch indirekte Immunfluores-zenzfärbung von Gefrierschnitten:FlagΔNΔC rod LIIIwurde durch Injektion von mRNA in die Zygote exprimiert. Embryonen der Stadien 7, 9, 10 und 21 wurden fixiert und nach Kryoprotek-tion tiefgefroren. Von diesen Proben wurden 10μm dicke Kryostatschnitte hergestellt. FlagΔNΔC rod LIIIwurde durch indirekte Immunfluoreszenzfärbung mit dem monoklonalen Antikörper M2 als
α
Abbildung 2.18 Lokalisation von Flag LIII Wildtyp in Embryonen durch indirekte Immunfluoreszenz-färbung von Gefrierschnitten: Flag LIII Wildtyp wurde durch Injektion von mRNA in die Zygote exprimiert. Embryonen der Stadien 7, 9 und 10 wurden fixiert und nach Kryoprotektion tief-gefroren. Von diesen Proben wurden 10μm dicke Kryostatschnitte hergestellt. Flag LIII Wildtyp wurde durch indirekte Immunfluoreszenzfärbung mit dem monoklonalen Antikörper M2 als primären und Cy3-gekoppelten Ziegeα-Maus-Antikörper als sekundären Antikörper nachgewiesen. Die DNA wurde mit DAPI angefärbt.
Abbildung 2.19 Lokalisation von endogenem Lamin LIII und endogenem Lamin B2 in nicht injizier-ten Embryonen durch indirekte Immunfluoreszenzfärbung von Gefrierschnitinjizier-ten:Nicht injizierte Embryonen der Stadien 7, 9 und 21 wurden fixiert und nach Kryoprotektion tiefgefroren.
Von diesen Proben wurden 10μm dicke Kryostatschnitte hergestellt. Endogenes Lamin LIII wurde durch indirekte Immunfluoreszenzfärbung mit dem monoklonalen Antikörper L046F7 als primären Antikörper und endogenes Lamin B2 mit dem monoklonalen Antikörper L7-8C6 nachgewiesen. Als sekundärer Antikörper wurde ein Cy3-gekoppelter Ziegeα-Maus-Antikörper verwendet. Die DNA wurde mit DAPI angefärbt.
Abbildung 2.20 Westernblotanalyse von LIII-Deletionsproteinen und Flag LIII Wildtyp nach Expres-sion in COS-7 Zellen:Die LIII-Deletionsproteine und Flag LIII Wildtyp wurden durch Trans-fektion der entsprechenden Plasmide in COS-7 Zellen exprimiert. 24 Stunden nach der TransTrans-fektion wurden die Zellen für die Analyse aufbereitet, in einem 7,5 %igen Gel aufgetrennt und im Western-blot auf eine PVDF-Membran übertragen. Die Proteine wurden durch Chemilumineszenzreaktion mit Hilfe des monoklonalen Antikörpers M2 nachgewiesen. Die Expositionszeit betrug eine Minute.
Die Position der Markerproteine ist links in kD angegeben.
24 Stunden nach der Transfektion wurde aus den Zellen entweder ein Zelllysat für die Westernblotanalyse hergestellt oder die Zellen wurden für eine indirekte Immunfluo-reszenzfärbung fixiert. Als primärer Antikörper für den Nachweis der Deletionsproteine diente M2. Das endogene Lamin B2 wurde mit Hilfe des primären Antikörpers L7-8C6 nachgewiesen.
Für die Westernblotanalyse wurden 15μl eines Zelllysates aus transfizierten COS-7 Zellen auf ein 7,5 %iges Gel aufgetragen und anschließend auf eine PVDF Membran übertragen. Die Flag-markierten Deletionsproteine ließen sich mit dem monoklonalen Antikörper M2 nachweisen. Firmbach-Kraft und Stick (1993) konnten in Untersuchun-gen zu den CaaX-abhängiUntersuchun-gen Modifikationen bei der Membranassoziation zeiUntersuchun-gen, dass sich isoprenyliertes Lamin LIII und nicht isoprenyliertes durch ihr Laufverhalten im Gel unterscheiden lassen. Isoprenyliertes Lamin läuft schneller als seine nicht isopre-nylierte Form, so dass es sich in Abbildung 2.20 bei der jeweils unteren Bande um das isoprenylierte Deletionsprotein und bei der jeweils oberen Bande um die nicht isoprenylierte Form handeln könnte. Das Flag ΔN rod LIII Protein scheint dann im Vergleich zu den beiden anderen Deletionsproteinen und Flag LIII vermehrt in der isoprenylierten Form vorzuliegen.
Die Expression von Flag ΔN rod LIII in Zellkulturzellen führte zu starken
Defor-mationen des Zellkerns (Abbildung 2.21, A-F). Eine Lamin-typische Ring-Färbung ist in Abbildung 2.21, A vereinzelt zu beobachten, größtenteils lag das Flag ΔN rod LIII Protein diffus im Zellkern verteilt vor (Abbildung 2.21, C). Allerdings konnte nicht bestimmt werden, ob sich das Protein im Nukleoplasma befindet, oder ob es auf die Kernhülle beschränkt ist. Die Expression des Deletionsproteins Flag ΔN rod LIII in COS-7 Zellen bewirkte auch eine Neuverteilung des endogenen Lamins B2 (Abbildung 2.21, E). Im Gegensatz zu nicht transfizierten Kontrollzellen (Abbildung 2.22, O-R) lag Lamin B2 nicht mehr entlang der Kernhülle vor, sondern in Aggregaten innerhalb des Kerns (Abbildung 2.21, F). Auch die Verteilung der DNA in diesen Kernen hatte sich verändert (vgl. Abbildung 2.21, F).
Auch die Deletionsproteine FlagΔC rod LIII und FlagΔNΔC rod LIII (Abbildung 2.21, G-J und Abbildung 2.22, K-N) zeigten keine für Lamine typische Ring-Färbung.
Sie lagen diffus verteilt im Nukleoplasma vor und bildeten dort Aggregate. Bei einigen analysierten Zellen führte die Expression der beiden Deletionsproteine zu Ausstülpun-gen der Kernhülle. Die Verteilung der DNA im Zellkern wurde durch keines der beiden Deletionsproteine verändert.
Abbildung 2.21 Lokalisation von Flag ΔN rod LIII und FLag ΔC rod LIII in COS-7 Zellen durch indirekte Immunfluoreszenzfärbung: Die LIII-Deletionsproteine wurden durch Transfektion der entsprechenden Plasmide in COS-7 Zellen exprimiert. 24 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen fixiert. Die Deletionsproteine wurden durch indirekte Immunfluoreszenzfärbung mit dem monoklonalen Antikörper M2 nachgewiesen. Die DNA wurde mit DAPI angefärbt.
Abbildung 2.22 Lokalisation von FlagΔNΔC rod LIII in COS-7 Zellen durch indirekte Immunfluores-zenzfärbung:Das LIII-Deletionsprotein wurden durch Transfektion der entsprechenden Plasmide in COS-7 Zellen exprimiert. 24 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen fixiert. Das Deleti-onsprotein wurden durch indirekte Immunfluoreszenzfärbung mit dem monoklonalen Antikörper M2 nachgewiesen. Als Kontrolle wurden nicht transfizierte COS-7 Zellen verwendet. Die DNA wurde mit DAPI angefärbt.
kern mit stark kondensiertem Chromatin entsteht. Die Histone werden zum Teil durch Spermien-spezifische Protamine ersetzt (Abé und Hiyoshi, 1991; Wehner und Gehring, 1995). Spermien inXenopus enthalten sechs Spermien-spezifische Protamine. Dagegen stoppt die Neusynthese von Histonen bereits in den Spermatiden, so dass das Histon H1 in späten Spermatiden nicht mehr vorhanden ist und die Histone 2A und 2B in stark reduzierter Konzentration vorliegen (Abé und Hiyoshi, 1991).
Benavente und Krohne (1985) konnten gegenüber somatischen Zellen eine veränder-te Laminzusammensetzung in Xenopus Spermatiden und Spermien nachweisen. Sie identifizierten ein auf die Lamina vonXenopus Spematiden und Spermien beschränk-tes Lamin. Shumaker et al. (2008) konnten zudem zeigen, dass auch Lamin LIII in den Spermien vorliegt. Für Lamin A und einige B-Typ Lamine konnte bereits die Bindung an Chromatin entweder direkt oder über Lamin-bindende Proteine wie z.B. LBR, BAF oder LAP2α und LAP2β nachgewiesen werden (Dechat et al., 2008). Es ist daher an-zunehmen, dass an der Umformung des Spermienzellkerns bzw. der Organisation des Chromatins auch die Lamine beteiligt sind.
Das von Benavente und Krohne (1985) als LIV bezeichnete Lamin wurde mit Hilfe des monoklonalen Antikörpers L046F7 identifiziert. Dieser Antikörper, der nur Lamin LIII nicht aber die Lamine B1, B2 und A erkennt, reagierte im Westernblot mit ei-nem Protein aus Xenopus Testisgewebe im Molekulargewichtsbereich von 75.000. In diesen Experimenten konnte Lamin LIII bei 68 kD detektiert werden. Eine Hoch-salzextraktion führte zur Anreicherung der Laminfraktionen aus Testisgewebe und Spermien. Der Nachweis des 75 kD Proteins in der Laminfraktion wurde als Beleg
für ein Lamin genommen. Allerdings wies ein Vergleich der Peptidmuster von Lamin LIII und LIV daraufhin, dass beide Proteine sehr unterschiedlich sind. Bisher waren noch keine Sequenzinformationen über das Lamin LIV vorhanden. Daher wurde in der NCBI (National Center for Biotechnology Information, Bethesda, USA) Datenbank nach dieser Sequenz gesucht. Wegen des Lamin-Nachweises für das LIV-Protein und seiner Kreuzreaktion mit dem Antikörper L046F7, wurde die LIII Sequenz für einen Nukleotid-BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, Altschul et al. 1990; Altschul et al. 1997) verwendet.
Mit Hilfe des Nukleotid-BLASTs wurde eine cDNA (Accession Number BC108623) gefunden, deren kodierende Region 88 % Identität zur Lamin LIII-Nukleotidsequenz (Accession Number: X13169) aufweist. Die abgeleitete Proteinsequenz (Accession Number: AAI08624) dieser cDNA wurde mit der Lamin LIII-Proteinsequenz (Accessi-on Number: P10999) unter Verwendung des Programms MultAlin aliniert (Abbildung 3.1). Beide Proteine weichen an nur 43 Aminosäurepositionen voneinander ab. Diese sind über das gesamte Protein verteilt. Außerdem findet sich ein 40 Aminosäurereste langes Segment im Coil 2B der Rod Domäne der neuen Laminvariante (Abbildung 3.1).
Eine Erklärung für die über die gesamte Sequenz verteilten Substitutionen wurde in früheren Arbeiten aufgezeigt.Xenopus besitzt zwei sehr ähnliche LIII-Gene, LIIIα und LIIIβ. Beide Gene sind wahrscheinlich durch eine Genduplikation entstanden, die vor der Verdopplung desXenopus Genoms stattfand (Döring und Stick 1990; Raab, 1990, Diplomarbeit Universität München). Ein Vergleich der Nukleotidsequenzen beider Ge-ne zeigte, dass sich LIIIα in 146 Positionen von LIIIβ unterscheidet. 82 Veränderungen der Nukleotidsequenz betreffen die dritte Position eines Codons, was in acht Fällen zu einer Aminosäuresubstitution führt, von denen sieben konservativ sind. Demnach verursachen 74 der 146 Veränderungen in der Nukleotidsequenz stumme Mutationen.
Aus den übrigen Veränderungen in der Nukleotidsequenz resultieren 43 Abweichungen in der Aminosäuresequenz, bei denen es sich in 24 Fällen um konservative Austausche handelt. Die in der Datenbank gefundene cDNA lässt sich anhand ihrer Sequenz vom LIIIβ-Gen ableiten.
Das zweite Charakteristikum der Laminvariante ist das 40 Aminosäurereste lange Segment im Coil 2B, das bisher in keinem anderen Lamin gefunden wurde. Für die bei der Datenbanksuche identifizierte Laminvariante ergab sich dadurch ein errechnetes Molekulargewicht von 72.000. Für das von Benavente und Krohne (1985) beschriebe-ne LIV-Protein wurde gelelektrophoretisch ein Molekulargewicht von 75.000 bestimmt.
Abbildung 3.1 Alignment der Aminosäuresequenzen von Lamin LIII und der in der Datenbank gefun-denen cDNA:Die Sequenz der cDNA weicht in einigen einzelnen Aminosäureresten sowie in einem 40 Aminosäurereste langen Segment von der LIII Sequenz ab (in rot dargestellt).
Die Ähnlichkeit im Molekulargewicht deutete daraufhin, dass es sich bei der Laminva-riante um das Lamin LIV handelte. Der Unterschied von 3.000 Da zwischen dem kal-kulierten und dem experimentell bestimmten Molekulargewicht von Lamin LIV könnte durch ein abweichendes Laufverhalten im Gel erklärt werden. Auch Lamin LIII zeigte eine Abweichung des errechneten Molekulargewichts (67 kD) gegenüber dem in der Gelelektrophorese bestimmten (68 kD).