Die drei oben beschriebenen PCR-Produkte wurden subkloniert und sequenziert, um die Sequenz von Intron IV des LIIIβ-Gens zu bestimmen. Das Intron IV vonXenopus laevis umfasst 2637 Basenpaare. Außerdem wurden andere Lamin LIII-exprimierende Spezies mittels Datenbankanalyse auf ein alternatives Exon im entsprechenden Intron des LIII-Gens untersucht. Dafür wurde zunächst die Lamin LIII Nukleotidsequenz der zu analysierenden Spezies gesucht und diese anschließend in eine BLAST-Analyse der jeweiligen Genomdatenbank eingesetzt, um das entsprechende Intron zu identifizieren.
Durch Arbeiten von Hofemeister et al. (2002), Zimek et al. (2003) sowie Zimek und Weber (2005) war bekannt, dass Lamin LIII auch im Zebrafisch Danio rerio, im Kral-lenfroschXenopus tropicalis, im HuhnGallus gallus und im KugelfischTakifugu rubri-pes vorhanden ist. Die Nukleotidsequenzen der Lamin LIII cDNAs von Danio rerio,
Abbildung 3.3 PCR-Analyse genomischer DNA isoliert ausXenopus Erythrozyten:Mit dem Primerpaar 12/13 wurden das alternative Exon und die beiden daran anschließenden Introns IVa und IVb des LIIIβ-Gens amplifiziert (Bahn 2). Primer 12 liegt im Exon IV und Primer 13 im Exon V (siehe Abbildung 3.2. In Bahn 3 wurde das Intron IVa amplifiziert, da der 3’ Primer 17 im alternativen Exon liegt. Mit dem Primerpaar 13/16 wurde das Intron IVb amplifiziert, da der 5’ Primer 16 im alternativen Exon liegt. Die Größe der DNA-Fragmente, die als Standard verwendet wurden, sind links in Basenpaaren angegeben.
Xenopus tropicalis undGallus gallus wurden anhand der Accession Numbers der NCBI Datenbank ermittelt (Accession Number Danio rerio: AF397015; Xenopus tropicalis:
NM001083354; Gallus gallus: XM413842). Für vier weitere Spezies, dem Kugelfisch Takifugu rubripes, dem Grünen Kugelfisch Tetraodon nigroviridis, dem Dreistache-ligen Stichling Gasterosteus aculeatus und dem Reisfisch Oryzias latipes, wurde die LIII-Nukleotidsequenz durch BLAST-Analysen mit bereits bekannten LIII-Sequenzen bestimmt. Eine BLAST-Analyse der Genomdatenbank der jeweiligen Spezies mit der entsprechenden cDNA-Sequenz führte zur Identifizierung der Lamin LIII-Gensequenz.
Das zu untersuchende Intron wurde anschließend durch ein Alignment der LIII cDNA mit der entsprechenden LIII-Gensequenz lokalisiert. Dabei zeigte sich, dass die Gen-strukturen in den untersuchten Arten konserviert sind. Eine Ausnahme stellten ledig-lichTetraodon nigroviridis undOryzias latipes dar. Tetraodon besitzt ein zusätzliches Intron, während bei Oryzias die Genstruktur im Bereich des Intron IV nicht kon-serviert ist. Das Intron IV von Oryzias ist im Vergleich zum Intron IV der anderen analysierten Spezies in 5’ Richtung verschoben. Eine schematische Darstellung der LIII-Genstrukturen der untersuchten Spezies findet sich in Abbildung 3.4.
Die Länge des zu untersuchenden Introns variierte bei den verschiedenen Arten zwi-schen 17 und 3.200 Basenpaaren. Bei zwei der Fischarten, Oryzias und Gasterosteus, konnte auf Grund der Intronlänge ausgeschlossen werden, dass dieses ein für 40 Ami-nosäuren kodierendes Exon enthält.
Die Untersuchung des entsprechenden Introns bei den oben genannten Spezies er-folgte durch einen Sequenzvergleich mit dem alternativen Exon aus der neuen Lamin-variante. Nur bei Xenopus tropicalis fand sich eine signifikante Übereinstimmung der Sequenzen. Im Intron IV bzw. V des LIII-Gens der Fische und des Huhns zeigte sich keine Sequenzähnlichkeit zum alternativen Exon der Laminvariante vonXenopus lae-vis. In diesen Fällen wurde über mögliche Donator- und Akzeptor- Spleißstellen nach weiteren alternativen Exons gesucht. Die Anzahl und Länge der putativen Exons, die in den untersuchten Spezies identifiziert wurden, sind zusammenfassend in Tabelle 3.1 dargestellt.
Tabelle 3.1Putative Exons, die im Intron IV des Lamin LIII-Gens der untersuchten Spezies gefunden wurden.
Spezies Intronlänge putative Exons Länge der Exons
Gallus gallus 1245 Bp 4 26 AS; 12 AS; 14 AS;
28 AS
Danio rerio 1093 Bp 5 16 AS; 20 AS; 17 AS;
9 AS; 10 AS
Takifugu rubripes 293 Bp 2 9 AS; 22 AS
Gasterosteus aculeatus 79 Bp – –
Oryzias latipes 17 Bp – –
Tetraodon nigroviridis 626 Bp 2 10 AS; 36 AS
Abbildung 3.5 Alignment der Nukleotidsequenzen von dem Intron IV des Lamin LIII-Gens (verkürzt auf 430 Nukleotide) vonX. tropicalis, und dem 120 Basenpaar langen alternativen Exon vonX. laevis:Unterschiede zwischen beiden Sequenzen sind in rot dargestellt.
Das alternative Exon der Laminvariante von X. laevis liegt im ersten Viertel des Introns IV, während es sich bei X. tropicalis im letzten Viertel befindet. Wie ein Alignment (Abbildung 3.5) zeigen konnte, unterscheiden sich beide Exonregionen nur an 10 Nukleotidpositionen voneinander. In der Mitte des alternativen Exons von X.
tropicalisfehlten allerdings zwei Basen, was während der Translation eine Verschiebung des Leserasters und letztendlich ein vorzeitiges Translationsende bewirken würde. Die Ergebnisse des Alignments lassen zwei Schlussfolgerungen zu:
1. Das Fehlen der beiden Basen ist ein Sequenzierungsartefakt. Das Einfügen zweier Basen ermöglicht die Translation des alternativen Spleißproduktes von X. tropicalis.
Dieses Spleißprodukt kodiert für ein Protein, das sich im alternativen Exon lediglich an sechs Aminosäurepositionen vom X. laevis Spleißprodukt unterscheidet.
2. Sollten die zwei fehlenden Basen nicht auf ein Sequenzierungsartefakt zurückzufüh-ren sein, wäre die Existenz des alternativen Spleißproduktes beiX. tropicalis fraglich.
Ein Vergleich der Intron IV Sequenzen von X. laevis und X. tropicalis (Abbildung 3.6) ergibt, dass lediglich die flankierenden Intronregionen des alternativen Exons, sowie eine 80 Basenpaar lange Region im Intron IVb, deren Bedeutung nicht bekannt ist, signifikante Übereinstimmungen aufweisen. In den flankierenden Intronregionen befinden sich Sequenzabschnitte, die für die Erkennung der Spleißosomen und somit
Abbildung 3.6 Alignment der Intron IV Sequenzen von X. laevis und X. tropicalis: Die dargestellten Sequenzabschnitte beinhalten das alternative Exon sowie die flankierenden Intronregionen.
für den Spleißvorgang wichtig sind. Die Konservierung deutete daraufhin, dass die Donator- und Akzeptorspleißstellen auch in X. tropicalis verwendet werden. Sollte es sich bei den zwei fehlenden Basen nicht um einen Sequenzierungsfehler handeln, würde demnach ein verkürztes Lamin LIII entstehen, denn ein Stopcodon würde bereits direkt nach den zwei fehlenden Basen folgen. Diese Tatsache lässt die Annahme, dass es sich um einen Sequenzierungsfehler handelt, plausibel erscheinen. Der endgültige Nachweis, dass auch X. tropicalis das LIII Spleißprodukt exprimiert, lässt sich allerdings nur experimentell erbringen.