Um das Lamin LIV-Protein nachzuweisen, wurden Proteinlysate von verschiedenen Xenopus Geweben hergestellt und diese im Westernblot sowohl mit dem neu generier-ten Antiserum 2294 als auch mit dem LIII spezifischen Antikörper L046F7 analysiert.
In den Abbildungen 3.17 und 3.18 sind diese Ergebnisse dargestellt. Bei dem Wes-ternblot in Abbildung 3.17 erfolgte der LIV-Nachweis durch das Antiserum 2294. La-min LIV konnte nur in den Spermienfraktionen detektiert werden (Bahn 1 und 8, obere Bande). In den anderen Gewebelysaten war Lamin LIV nicht nachweisbar, lediglich im Nierenlysat waren zwei schwache Signale im Bereich von ca. 38 kD (Bahn 3 und 6) zu detektieren. In den Spermienfraktionen konnte zusätzlich zum Lamin LIV auch das bereits oben beschriebene Abbauprodukt detektiert werden.
Mit dem Antikörper L046F7 wurde in den Spermienfraktionen (Abbildung 3.18, Bahn 1 und 8) sowohl Lamin LIII (untere Bande), als auch Lamin LIV (obere Bande) detektiert. In keinem der anderen Gewebelysate konnten Lamin LIII oder LIV detek-tiert werden. Aus der Literatur (Benavente et al., 1985) ist bekannt, dass Lamin LIII
Abbildung 3.17 Nachweis von Lamin LIV inXenopus Geweben:Aus verschiedenenXenopusGeweben wur-den Proteinlysate hergestellt und diese gelelektrophoretisch aufgetrennt. Nach der Übertragung der Proteine auf eine PVDF-Membran wurde sie mit dem polyklonalen Antiserum 2294 inkubiert. Die Expositionszeit betrug eine Minute und der Größenstandard ist links in kD angegeben.
in adulten Tieren auch in Muskelzellkernen vorkommt, was durch die oben beschriebe PCR-Analyse bestätigt wurde. In Abbildung 3.8, Bahn 7 konnte keine LIII-mRNA im Herzgewebe nachgewiesen werden. Vermutlich ist nur sehr wenig LIII-Protein vor-handen, so dass die Sensitivität des Westernblots nicht ausreichend ist, um LIII im Herzlysat nachweisen zu können.
Abbildung 3.18 Nachweis von Lamin LIV und Lamin LIII inXenopusGeweben:Aus verschiedenen Xeno-pusGeweben wurden Proteinlysate hergestellt und diese gelelektrophoretisch aufgetrennt. Nach der Übertragung der Proteine auf eine PVDF-Membran wurde sie mit dem monoklonalen Antikörper L046F7 inkubiert. Die Expositionszeit betrug eine Minute und der Größenstandard ist links in kD angegeben.
Ziel dieser Arbeit war es, Lamin LIII-Deletionsproteine herzustellen und deren Wir-kung in Xenopus Oozyten und Embryonen sowie in Kulturzellen zu analysieren. Von diesen Proteinen wurde erwartet, dass sie nach ihrer Expression in den jeweiligen Zellen dominant-negativ auf endogene Lamine bzw. die Lamina wirken. Durch diese Experimente sollten Schlüsse über die Funktion der deletierten Lamin LIII Regionen im Hinblick auf die Polymerisation zu Laminfilamenten gezogen werden und, soweit möglich, sollte geklärt werden, an welchen zellulären Prozessen Lamin LIII beteiligt ist.
Frühere Experimente mit Lamin LIII-Deletionsproteinen, denen die N-terminale Kopf Domäne bzw. zusätzlich ein Teil der C-terminalen Schwanz Domäne fehlte, zeig-ten in Xenopus Oozyten und Embryonen entgegen den Erwartungen auf Grund von Berichten aus der Literatur kein dominant-negatives Verhalten (von Moeller, 2004, Di-plomarbeit, Universität Bremen). Heitlinger et al. (1992) zeigten in vitro anhand von Lamin B2 Konstrukten, dass die Kopf Domäne für die Assoziation zu Kopf-Schwanz Polymeren wichtig ist, weshalb ein Lamin LIII Protein, dem diese Domäne fehlt, in Xenopus Oozyten und Embryonen eigentlich eine Inhibierung der Filamentbildung hervorrufen sollte. Andere Autoren konnten allerdings zeigen, dass nicht nur die Kopf Domäne für die Assoziation zu Kopf-Schwanz Polymeren wichtig ist, sondern auch die konservierten Regionen N- und C-terminal der Rod Domäne (Stuurman et al., 1996; Heald und McKeon, 1990). Deshalb wurden im Rahmen dieser Arbeit Lamin LIII-Deletionsproteine analysiert, denen jeweils eine dieser Regionen bzw. beide kon-servierten Regionen fehlen.
4.1 Deletionsproteine
In der Vergangenheit sind viele Experimente mit Lamin-Deletionsproteinen durchge-führt worden, die zum Teil unterschiedliche Ergebnisse zeigen. In vielen dieser Experi-mente wurden Lamin A-Deletionsproteine imXenopus Eiextrakt und in verschiedenen Zelllinien untersucht. Alle wiesen eine dominant-negative Wirkung auf. Spann et al.
(1997, 2002) untersuchten ein humanes Lamin A-Deletionsprotein, dem die Kopf Do-mäne fehlt (ΔN LA). Im Xenopus Eiextrakt verhinderte dieses Protein die Bildung
(Spann et al., 2002).
Izumi et al. (2000) konnten einen dominant-negativen Effekt für ΔN LA in CHO-Zellen (Epithelzellen aus dem Ovar von Chinesischen Hamstern (Chinese hamster ovary)) zeigen. Es bildet zusammen mit endogenem Lamin A Aggregate, nicht jedoch mit endogenem Lamin B1 und B2. Zudem beeinflusst ΔN LA in dieser Zelllinie die Verteilung von Replikationsfaktoren wie es von Spann et al. (1997) und Moir et al.
(2000) beschrieben wurde nicht. Auch Lamin A-Deletionsproteine, denen die CaaX-Box fehlt, verhielten sich wieΔN LA. Alle von Izumi et al. (2000) untersuchten Lamin A-Deletionsproteine unterschieden sich lediglich in der Größe der durch sie induzierten Aggregate.
Bei der Analyse vonXenopus B1 CaaX-Deletionsproteinen beobachteten Izumi et al.
(2000) einen Einfluss sowohl auf endogene A-Typ und B-Typ Lamine als auch auf die Lokalisation von PCNA. Allerdings hatte die Mislokalisation von PCNA keinen Einfluss auf aktive Replikationszentren, das generelle Zellwachstum oder die Differen-zierung der Zellen. Eine Ausnahme bildete ein B1-Deletionsprotein, dem neben der Kopf und Schwanz Domäne noch der N-terminale Teil der Rod Domäne fehlte. Dieses beeinflusste die Lokalisation von PCNA nicht, so dass sich die PCNA-Bindungsstelle möglicherweise in diesem Teil der Rod Domäne befindet.
Insgesamt sollte die Untersuchung von Deletionsproteinen somatischer Lamine in Xenopus Eiextrakten oder Embryonenextrakten kritisch betrachtet werden, da soma-tische Lamine in diesem System nicht vorhanden sind und bestimmte Bindungspart-ner wie Emerin fehlen (Gareiss et al., 2005). Daher sind die Auswirkungen der Dele-tionsproteine möglicherweise nicht leicht interpretierbar, bzw. lassen nicht unbedingt Schlüsse auf diein vivoSituation zu. Die Expression von Wildtyp Lamin A inXenopus
Embryonen verdeutlicht dies, da Lamin A in Embryonen letal wirkt. In embryonalen Zellkernen bilden sich sehr große Lamin A Aggregate, während Coexpression von La-min A und Emerin zu einer LaLa-min-typischen Verteilung führt. Die letale Wirkung von Lamin A wird dadurch allerdings nicht aufgehoben (Peter und Stick, 2008). Weiterhin ist für Lamin A bekannt, dass es sehr stabile Interaktionen eingeht, besonders hetero-typische Interaktionen (Schirmer und Gerace, 2004), so dass es im Eiextrakt vor der Bildung der Lamina besonders effizient an das in großer Menge vorliegenden Lamin LIII binden kann.
Auch für B-Typ Deletionsproteine wurde zum Teil eine dominant-negative Wirkung beobachtet. Ellis et al. (1997) konnten zeigen, dass ein Xenopus B1-Deletionsprotein, dem sowohl die Kopf Domäne als auch die C-terminale Region der Schwanz Domäne fehlt, in Eiextrakten Heterooligomere mit Lamin LIII bildet und die Bildung einer Lamina in den entstehenden Kernen inhibiert. Zudem wurde beobachtet, dass die Bil-dung von Replikationszentren gestört ist. Da die BilBil-dung von Replikationszentren von der Kerngröße abhängig ist (Hutchison, 1995) und die entstehenden Kerne bei einer In-hibierung der Laminabildung durch dominant-negativ wirkende Deletionslamine sehr klein bleiben, könnte dies der Grund sein, dass die Replikationszentren nicht gebildet werden.
Das Deletionsprotein ΔN LIII von Xenopus hat im Eiextrakt einen dominant-negativen Einfluss auf die Bildung der Lamina. Diesem Protein fehlt die Kopf Do-mäne, was wie bei anderen „kopflosen“ Deletionsproteinen die Bildung einer Lami-na verhindert und zur Mislokalisation von endogenem LIII führt (Moir et al., 2000).
Im Gegensatz dazu konnte in Xenopus Oozyten, Embryonen und in COS-7 Zellen keine dominant-negative Wirkung dieses Deletionsproteins beobachtet werden. Auch die zusätzliche Deletion eines Teils der Schwanz Domäne hatte keinen Effekt in den drei untersuchten Systemen (von Moeller, 2004, Diplomarbeit Universität Bremen).
Ebenso wies ein von Izumi et al. (2000) untersuchtes „kopfloses“ Xenopus Lamin B1-Deletionsprotein in CHO-Zellen keine dominant-negative Wirkung auf.
Ein weiteres humanes B1-Deletionsprotein, das eine massive dominant-negative Wir-kung in Zellkulturzellen zeigt, wurde von Schirmer et al. (2001) untersucht. Bei die-sem Protein wurde ein großer Teil der Rod Domäne deletiert, so dass diese lediglich aus fünf N-terminalen Heptaden und fünf C-terminalen Heptaden bestand. In vitro Assemblierungsstudien dieses Proteins zeigten, dass es sowohl dimerisieren als auch Kopf- Schwanz Polymere bilden kann, da die konservierten Regionen an den Enden
keln, die zum Kernwachstum notwendig sind, indem es Lamin-Lamin Interaktionen blockiert. Laminlöslichkeitsassays von Lamin LIII und dem Deletionsprotein zeigten, dass die Verteilung des endogenen LIII bei Inkubation mit dem Deletionsprotein ver-ändert ist. In den Kontrollen befand sich das endogene LIII in der Sedimentfrakti-on und das DeletiSedimentfrakti-onsprotein im Überstand, während nach der InkubatiSedimentfrakti-on vSedimentfrakti-on LIII mit dem Deletionsprotein, das LIII-Protein überwiegend im Überstand zu finden war.
Shumaker et al. (2005) konnten zeigen, dass die Ig-Domäne die Interaktionseigenschaf-ten des LIII-Deletionsproteins erheblich beeinflusst. Ein einziger Aminosäureaustausch (R454W) in der Ig-Domäne, schwächt die Auswirkung des Deletionsproteins im Eiex-trakt deutlich ab. Erste Untersuchungen dieser beiden Deletionsproteine im Xenopus Embryo führten jedoch zu anderen Ergebnissen. Die Embryonen, die das Deletions-protein mit normaler Ig-Domäne exprimierten, zeigten ab dem Stadium 10 die ersten Pigmentstörungen, entwickelten sich jedoch, ähnlich wie das im Rahmen dieser Arbeit beschriebene Flag ΔN rod LIII-Deletionsprotein, weiter. Die Embryonen jedoch, die das Deletionsprotein mit dem Aminosäureaustausch in der Ig-Domäne exprimierten, starben bis zum Stadium 12 ab (von Moeller, unveröffentlichte Ergebnisse). Durch den Vergleich dieser Ergebnisse wird noch einmal deutlich, wie unterschiedlich und zum Teil widersprüchlich die Ergebnisse der Analysen im Eiextrakt im Vergleich zuin vivo Systemen sind.
4.2 Die Deletionsproteine Flag Δ N rod L
III, Flag Δ C rod L
IIIund Flag Δ N Δ C rod L
IIIwirken in Oozyten nicht
dominant-negativ, bilden aber intranukleäre Membranen
Der überwiegende Teil der Deletionsproteine, die im Rahmen dieser Arbeit analy-siert wurden, wurde nach der Expression in Oozyten in den Kern transportiert. Bei den geringen Mengen, die noch im Cytoplasma detektiert wurden, handelt es sich wahrscheinlich um neu synthetisiertes Protein, das bisher noch nicht in den Kern transportiert werden konnte.
Weitere Untersuchungen haben gezeigt, dass alle drei hier beschriebenen Deletions-proteine nur zu einem geringen Teil an der Kernhülle lokalisiert sind. Da sowohl die
„kopflose“ LIII Mutante aus früheren Experimenten (von Moeller, 2004, Universität Bremen) als auch Wildtyp Lamin LIII (Ralle et al., 2004) nach ihrer Expression in Oozyten vollständig an der Kernhülle lokalisiert sind, könnten durch das Fehlen der konservierten Enden der Rod Domäne die Interaktionseigenschaften der Deletionspro-teine gestört sein.
Bei einer dominant-negativen Wirkung der Deletionsproteine würde eine Misloka-lisation von endogenem Lamin LIII im Nukleoplasma erwartet werden. Endogenes Lamin LIII befindet sich in den Kontrollkernen nur in der Kernhülle. Anhand der vor-liegenden Ergebnisse lässt sich jedoch keine eindeutige Aussage über die Verteilung von endogenem Lamin LIII in Oozyten, die die Deletionsproteine exprimieren, treffen.
Die Molekulargewichte der Deletionsproteine unterscheiden sich mit 2.000 bis 6.300 Da von dem des endogenen LIII. Daher sollten sie im Westernblot eigentlich vom Wildtyp LIII zu unterscheiden sein. In den Analysen von Kernhüllen bzw. Kerninhaltsfraktio-nen waren daher Doppelbanden erwartet worden. Allerdings konnten diese weder in den Kernhüllenfraktionen noch in den Kerninhaltsfraktionen der injizierten Oozyten beobachtet werden. Lediglich die Stärke der Signale in den Kernhüllenfraktionen las-sen vermuten, dass das endogene Lamin LIII noch immer in der Kernhülle lokalisiert ist (Abbildung 2.5). Das Flag-Epitop der Deletionsproteine, das saure Eigenschaften hat, könnte die Laufeigenschaften der Deletionsproteine so verändern, dass eine Un-terscheidung von endogenem Lamin LIII nicht möglich ist. Um dennoch die Verteilung des endogenen LIII in den Kernen injizierter Oozyten zu überprüfen, könnte in wei-terführenden Versuchen eine 2 D-Gelelektrophorese durchgeführt werden, denn gerade
Für eine Reihe CaaX-Box enthaltender B-Typ Lamine konnte bereits gezeigt wer-den, dass sie bei Überexpression intranukleäre Membranen bilden (Goldberg et al., 2008b; Prüfert et al., 2004; Ralle et al., 2004). Die Ausbildung der Membranen wird durch die Isoprenylierung induziert. Dies wurde durch die Expression von Laminen, in denen das Cystein der CaaX-Box zu Serin mutiert wurde, belegt. Diese Lamine indu-zierten kein Membranwachstum (Prüfert et al., 2004; Ralle et al., 2004). Die Ergebnisse dieser Autoren ließen erwarten, dass auch die hier analysierten Deletionsproteine intra-nukleäre Membranen bilden würden. Die elektronenmikroskopischen Untersuchungen bestätigten zwar diese Erwartung, jedoch sind die von den Deletionsproteinen indu-zierten Strukturen deutlich kleiner als die aus der Literatur bekannten Membranen.
Die Morphologie der durch Flag ΔN rod LIII induzierten Membranen unterscheidet sich von der durch die anderen beiden Deletionsproteine induzierten. Die von FlagΔN rod LIII gebildeten Membranen haben eine vesikelähnliche Struktur, FlagΔC rod LIII und Flag ΔNΔC rod LIII hingegen induzieren Membranstapel. Diese bestehen jedoch im Vergleich zu den großflächigen, langen Membranstapeln, die von Ralle et al. (2004) und Prüfert et al. (2004) beschrieben wurden, eher aus kurzen Zisternen. Da auch nach Überexpression von Wildtyp Lamin LIII solche großflächigen Membranstapel in Oozyten gebildet wurden (Goldberg et al., 2008b), können für die Deletionsproteine zwei Aussagen getroffen werden:
1. Alle drei Deletionsproteine müssen im Vergleich zu Wildtyp LIII veränderte Bindungs- oder Interaktionseigenschaften aufweisen.
2. Dabei unterscheiden sich die Eigenschaften von Flag ΔN rod LIII von denen der beiden anderen Deletionsproteine.
Zudem stellt sich die Frage, warum Flag ΔN rod LIII andere Membranstrukturen
bildet als Flag ΔC rod LIII oder die Doppelmutante. Stuurman et al. (1996) konn-ten durch Bindungsstudien mit Fragmenkonn-ten aus dem Drosophila Lamin Dm0 zeigen, dass sowohl die N-terminale als auch die C-terminale konservierte Region der Rod Domäne für die Assoziation von Lamindimeren zu Kopf-Schwanz Polymeren wichtig ist. Ihre Untersuchungen deuteten darauf hin, dass neben diesen konservierten Regio-nen auch ein Teil der N-terminalen Kopf Domäne für die Polymerisation notwendig ist. Weiterhin konnte in dieser Studie gezeigt werden, dass die N-terminale konser-vierte Region der Rod Domäne nicht nur für die Kopf-Schwanz Assoziation essentiell ist, sondern auch für die laterale Interaktion von Laminfilamenten. Dementsprechend würden bei der Integration von FlagΔN rod LIII weder Kopf-Schwanz-Polymere noch höhere, lateral-assoziierte Strukturen gebildet werden, während die Integration von FlagΔC rod LIII zwar die Kopf-Schwanz-Polymersation verhindert, aber eine laterale Assoziation von Dimeren noch möglich wäre. Die Doppelmutante hat auf Grund des Fehlens beider konservierter Regionen möglicherweise die geringste Affinität, mit dem endogenen Lamin zu interagieren, kann aber mit sich selbst noch interagieren.
Neben den Laminen kann die Bildung von Extramembranen auch durch Überex-pression von integralen Membranproteinen des ERs induziert werden. Diese werden als OSER (organized smooth ER) bezeichnet. Diese Membranen können so unterschiedli-che Formen wie konzentrisunterschiedli-che Membranwirbel, sinusoidales ER sowie Membranstapel ausbilden (Snapp et al., 2003). Snapp et al. (2003) konnten zeigen, dass der Mecha-nismus, der zur Bildung von OSER-Strukturen führt, von der Dimerisierungsfähigkeit der cytoplasmatischen Domänen der integralen Membranproteine abhängt. Dies wurde durch die Expression von GFP-markierten integralen Membranproteinen nachgewie-sen. Für GFP ist bekannt, dass es dimerisieren kann. Die Fähigkeit zur Dimerisierung kann durch einen Aminsosäureaustausch eliminiert werden (Zacharias et al., 2002).
Integrale Membranproteine, deren cytoplasmatische Domänen normalerweise nicht di-merisieren können, wurden jeweils mit GFP bzw. mit dem mutierten GFP gekoppelt.
Lediglich die mit dem nicht mutierten GFP gekoppelten Membranprotein konnten OSER-Strukturen ausbilden. Die Überexpression von integralen Membranproteinen, die nicht dimerisieren können, führt zur Membranproliferation, jedoch nicht zu OSER-Strukturen. Da auch keine OSER-Strukturen induziert wurden, wenn zur Dimerisie-rung fähiges GFP an die lumenale Domäne der Membranproteine gekoppelt wurde, müssen die cytoplasmatischen Domänen bzw. deren Interaktionen miteinander für die Bildung von OSER-Strukturen verantwortlich sein.
würde jedoch nur zutreffen, wenn Prälamin A an die innere Kernmembran transpor-tiert wird, wo es zu reifem Lamin A prozessiert wird und der abgespaltene Rest nicht abgebaut wird. Neuere Untersuchungen haben gezeigt, dass diese Modifizierungspro-zesse an der Kernmembran stattfinden können (Barrowman et al., 2008).
Falls die im Rahmen dieser Arbeit analysierten Deletionsproteine durch die fehlen-den Regionen in ihren Dimerisierungs- bzw. Polymerisierungsfähigkeiten eingeschränkt sind, könnte die Ausbildung von weniger großen Membranstapeln die Folge sein. Die Ergebnisse sprechen dafür, dass Flag ΔN rod LIII andere Bindungseigenschaften auf-weist als die beiden anderen Deletionsproteine.
