zur Erlangung des Grades eines Doktors
der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)
im Fachbereich Biologie/Chemie
der Universität Bremen
vorgelegt von
Friederike von Moeller
2. Gutachter: Prof. Dr. Friederike Koenig
Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Dissertation „Analyse von dominant-negativ wirkenden Lamin-Deletionsproteinen und Identifizierung eines Spermien-spezifischen Lamins in Xenopus laevis“ ohne unerlaubte fremde Hilfe angefertigt und keine anderen als die von mir angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt habe. Ich habe die den benutzten Werken wörtlich oder inhaltlich entnommenen Stellen als solche kenntlich gemacht.
Bremen, 24.02.09
1.5 Die Frühentwicklung des Krallenfrosches Xenopus laevis . . . 22
1.6 Deletionsproteine von Laminen und ihre Wirkung . . . 23
2 Ergebnisse Teil A 26 2.1 Herstellung der für die Deletionsproteine kodierenden Plasmide . . . 26
2.2 Analyse der Deletionsproteine in Oozyten von Xenopus laevis . . . 27
2.3 Analyse der Deletionsproteine in Embryonen von Xenopus laevis . . . . 36
2.4 Analyse der Deletionsproteine in Zellkulturzellen . . . 44
3 Ergebnisse Teil B 53 3.1 Identifizierung einer von LIIIβ abgeleiteten Laminvariante . . . 53
3.2 Charakterisierung der Genstruktur der Laminvariante . . . 56
3.3 Untersuchung des Intron IV im LIII-Gen verschiedener Spezies auf al-ternative Exons . . . 57
3.4 Nachweis des Lamin LIII Spleißproduktes in verschiedenen Geweben von Xenopus laevis . . . . 62
3.5 Untersuchungen des Lamins LIV in Oozyten . . . 65
3.6 Generierung eines Lamin LIV-Antikörpers . . . 67
3.7 Nachweis von Lamin LIV in verschiedenen Xenopus Geweben . . . . 71
4 Diskussion Teil A 74 4.1 Deletionsproteine . . . 74
4.2 Die Deletionsproteine Flag ΔN rod LIII, Flag ΔC rod LIII und Flag ΔNΔC rod LIII wirken in Oozyten nicht dominant-negativ, bilden aber
intranukleäre Membranen . . . 78
4.3 Die Deletionsproteine zeigen in Embryonen dominant-negative Eigen-schaften . . . 81
4.4 Flag ΔN rod LIII führt in Kulturzellen zu Verformungen des Zellkerns 83 4.5 Ausblick . . . 86
5 Diskussion Teil B 88 5.1 Charakterisierung des Lamins LIV . . . 88
6 Material 93 6.1 Versuchstiere . . . 93 6.2 Zellkultur . . . 93 6.3 Bakterienstämme . . . 93 6.4 Plasmide . . . 93 6.5 Oligonukleotide . . . 95 6.6 Antikörper . . . 97 6.7 Enzyme . . . 98 6.8 Chemikalien . . . 98 7 Methoden 99 7.1 Molekularbiologische Methoden . . . 99
7.1.1 Mutagenese von Flag Lamin LIIIa . . . 99
7.1.2 Agarosegelelektrophorese . . . 100
7.1.3 Ligation . . . 100
7.1.4 Transformation durch Elektroporation . . . 101
7.1.5 Plasmid Mini- und Midi- Präparation . . . 101
7.1.6 Glycerinkulturen . . . 102
7.1.7 Herstellung von mRNA für die Mikroinjektion und saure Etha-nolfällung . . . 102
7.1.8 RT-PCR . . . 103
7.1.9 Polymerasekettenreaktion (PCR) . . . 103
7.2 Arbeiten mit Oozyten und Embryonen von Xenopus laevis . . . 105
7.2.10 Isolierung der Zellkerne aus Embryonen . . . 109
7.2.11 RNA-Isolierung aus Xenopus Geweben . . . 110
7.2.12 Isolierung genomischer DNA aus Erythrozyten von Xenopus laevis 111 7.2.13 Proteinisolierung aus verschiedenen Geweben von Xenopus laevis 112 7.2.14 Spermienisolierung aus Testis von Xenopus laevis . . . 112
7.3 Proteinbiochemische Methoden . . . 112
7.3.1 Herstellung von SDS-Polyacrylamidgelen . . . 112
7.3.2 SDS-Gelelektrophorese . . . 113
7.3.3 Westernblot . . . 114
7.3.4 Färben der Membran und Antikörpernachweis . . . 114
7.4 Zellbiologische Methoden . . . 115
7.4.1 Schneiden von Oozyten und Embryonen am Kryostat . . . 115
7.4.2 Indirekte Immunfluoreszenzfärbung der Kryostatschnitte . . . . 115
7.4.3 Schneiden von Oozytenkernen am Ultramikrotom . . . 116
7.4.4 Kontrastierung von Schnitten . . . 116
7.4.5 Kultivierung und Transfektion von COS-7 Zellen . . . 116
7.4.6 Indirekte Immunfluoreszenz von COS-7 Zellen . . . 117
7.4.7 Herstellung von Zelllysat aus COS-7 Zellen . . . 117
8 Zusammenfassung 118
9 Anhang 119
1.1 Der Zellkern
Der Zellkern eukaryotischer Zellen ist eine komplexe und hoch organisierte Struktur, die für essentielle Funktionen wie DNA Replikation, RNA Transkription, RNA Prozes-sierung und die Zusammensetzung der Ribosomen zuständig ist (Vlcek et al., 2001). Seine wichtigsten Strukturkomponenten sind das Chromatin, die Kernhülle mit der Lamina, die Kernmatrix sowie die Nukleoli.
1.1.1 Die Kernhülle
Die Kernhülle reguliert den Transport von Makromolekülen zwischen Nukleoplasma und Cytosol und bietet Bindungsstellen für das Cytoskelett, um den Zellkern in der Zelle zu positionieren (Hetzer et al., 2005). Sie trennt den Zellkern eukaryotischer Zel-len vom Cytoplasma und besteht aus zwei konzentrischen Membranen, der äußeren und der inneren Kernmembran, sowie aus den Kernporenkomplexen und bei höhe-ren Eukaryoten der unter der innehöhe-ren Kernmembran liegenden Lamina (Gruenbaum et al., 2005). Die Laminfilamente sind mit den inneren Ringelementen der Kernporen assoziiert (Goldberg und Allen, 1996). Die beiden Kernmembranen werden durch ein 25-45 nm breites Lumen voneinander getrennt, sind aber an Stellen, die mit Kernpo-renkomplexen besetzt sind, miteinander verbunden Abbildung 1.1 (Margalit, 2005).
Die äußere Kernmembran steht in direkter Verbindung mit dem endoplasmatischen Retikulum (ER) und ist biochemisch und funktionell den ER-Membranen ähnlich. Die innere Kernmembran enthält spezifische integrale Membranproteine, die Bindungsstel-len für Heterochromatin und die Lamina bieten (Collas und Courvalin, 2000). Beide Kernmembranen stehen durch Interaktionen der Proteine der äußeren und inneren Kernmembran miteinander in Verbindung und können so das periphere Kernskelett mit dem Cytoskelett verbinden (Hetzer et al., 2005; Lee et al., 2002; Malone et al., 2003).
Kernporenkomplexe sind große aus Proteinen, Nukleoporinen, bestehende Struk-turen, die die innere und äußere Kernmembran durchspannen (Abbildung 1.1). Diese Proteine sind in einer achtfachen Symmetrie angeordnet. Bei Vertebraten haben
Kern-Abbildung 1.1 Aufbau der Kernhülle: Die Kern-Abbildung zeigt einen schematischen Querschnitt durch die Kernhülle. Die innere (INM) und äußere Kernmembran (ONM) sind durch ein Lumen voneinander getrennt, im Bereich der Kernporen gehen beide Membranen ineinander über. Die äußere Kernmembran ist mit der ER-Membran kontinuierlich. Sie ist mit Ribosomen besetzt. Neu synthetisierte integrale Membran-proteine diffundieren von der ER Membran über die äußere Kernmembran zur inneren Kernmembran. Abbildung aus Mattaj et al., 2004.
porenkomplexe eine Masse von 60 bis 125 MDa und bilden selektive, wässrige Kanäle zwischen dem Nukleoplasma und dem Cytoplasma. Durch diese Kanäle werden Ma-kromoleküle aktiv transportiert, während Ionen und kleine Moleküle frei diffundieren können (Mattaj, 2004; Cronshaw et al., 2002; Reichelt et al., 1990).
In höheren Eukaryoten wird der Zellkern während der Mitose aufgelöst. Kernmem-branen, Lamina und Kernporenkomplexe depolymerisieren zwischen der Prophase und der Prometaphase des Zellzyklus, um die Bindung der cytoplasmatischen Mitosespin-del an die Chromosomen zu ermöglichen. Während der Anaphase und der Telophase werden die Kernhülle und ihre assoziierten Strukturen um die Oberfläche der Chro-mosomen wieder aufgebaut (Margalit et al., 2005).
1.1.2 Die Lamina
Frühe Studien beschreiben die Kernlamina in Invertebraten und Vertebraten als eine aus Proteinen bestehende fibrilläre Struktur nahe der inneren Kernmembran (Faw-cett, 1966; Pappas, 1956). Weitere Untersuchungen haben gezeigt, dass die Lamina in Säugerzellen ein dünnes Netzwerk an der nukleoplasmatischen Oberfläche, unter der inneren Kernmembran bildet (Abbildung 1.1). Sie geht komplexe Interaktionen mit spezifischen integralen Proteinen der inneren Kernmembran und des Chromatins ein
und wird für die Aufrechterhaltung der strukturellen Integrität der Kernhülle verant-wortlich gemacht (Burke und Stewart, 2002).
An Oozyten des Krallenfrosches Xenopus laevis konnte gezeigt werden, dass die Lamina aus ca. 10 nm dicken Filamenten, den Laminen, besteht, die denen der In-termediärfilamente entsprechen. Es ist erkennbar, dass diese Filamente zum Teil in einem nahezu tetragonalen Netzwerk angeordnet sind (Aebi et al., 1986). Diese 10 nm Filamente sind bisher nur in Oozyten von Amphibien gefunden worden, in denen die Lamina allerdings im Wesentlichen aus einem Laminisotyp aufgebaut ist. In den meis-ten Zellen scheint sie eine dichte Schicht ohne deutliche Strukturen zu sein, was auf eine komplexere Zusammensetzung hindeutet. Ein so einfach strukturierter Aufbau ist dann bei der Polymerisation verschiedener Laminisotypen vielleicht nicht mehr möglich (Goldman et al., 2002; Gruenbaum et al., 2003). Die Dicke der Lamina kann innerhalb einer Zelle variieren (10-200 nm). Bereiche mit hoher Laminkonzentration decken sich mit darunter liegendem Chromatin, während geringere Laminkonzentra-tionen in Bereichen der Kernporenkomplexe vorliegen, aber nicht in der Nähe des Chromatins (Belmont et al., 1993; Höger et al., 1991; Paddy et al., 1990).
Lamine gehören zu den Typ V Intermediärfilamenten und werden auf Grund ihrer biochemischen Eigenschaften und ihres Verhaltens während der Mitose in die Typen A und B unterteilt. A-Typ Lamine haben einen neutralen isoelektrischen Punkt, sie werden in differenzierten Zellen exprimiert und sind während der Mitose löslich. B-Typ Lamine haben dagegen einen niedrigen isoelektrischen Punkt, werden in allen Zellen während der Entwicklung exprimiert und liegen während der Mitose membran-gebunden vor (Gerace und Burke, 1988; Nigg, 1989; Peter et al., 1989; Gerace und Blobel, 1980; Burke und Gerace, 1986; Georgatos et al., 1994; Stuurman et al., 1998). Ein weiterer Unterschied zwischen A- und B-Typ Laminen ist die längere C-terminale Schwanz Domäne bei A-Typ Laminen, die einen Polyhistidinabschnitt enthält (Peter et al., 1989; Höger et al., 1990).
Die Anzahl und Komplexität der Lamingene stieg während der Evolution der Me-tazoa an (Goldman et al., 2002). Das Genom der meisten Vertebraten enthält vier Lamingene, lediglich die Säuger besitzen nur zwei B-Typ Lamingene, LMNB1 und LMNB2 (Höger et al., 1988, 1990; Peter et al., 1989), sowie ein A-Typ Lamingen, LMNA (Fisher et al., 1986; McKeon et al., 1986). Das vierte Gen ist spezifisch für Amphibien, Vögel und Knochenfische und ist hauptsächlich in den Oozyten, Spermi-en und frühSpermi-en EntwicklungsstadiSpermi-en der drei Spezies zu findSpermi-en. Es kodiert für das Lamin
Säugetieren kodiert für Lamin B2 sowie für das Keimbahn-spezifische Lamin B3 (Fu-rukawa und Hotta, 1993). Diese beiden Proteine unterscheiden sich auf Grund ihres N-Terminus. Die Kopf Domäne und der erste Teil der Rod Domäne sind bei Lamin B3 durch eine Sequenz von 84 Aminosäuren ersetzt.
1.1.3 Integrale Membranproteine der inneren Kernmembran
Lamine können mit Proteinen im Nukleoplasma und in der Kernhülle interagieren. Bei diesen Proteinen handelt es sich um die Lamin-assoziierten Proteine, die bei Verte-braten meistens als integrale Membranproteine vorkommen und in der inneren Kern-membran lokalisiert sind. Sie interagieren direkt oder indirekt mit den Laminen (Cohen et al., 2001; Goldman et al., 2002). Von der Vielzahl der bisher bekannten Proteine der inneren Kernmembran wird im Folgenden lediglich eine kleine Auswahl beschrieben.
Der Lamin B Rezeptor (LBR) war das erste identifizierte Protein dieser Gruppe (Worman et al., 1988). Er kommt in Vertebraten (Gajewski und Krohne, 1999; Ka-wahire et al., 1997; Schuler et al., 1994), Seeigeln (Collas et al., 1996) und Drosophila (Wagner et al., 2004) vor, nicht aber in C. elegans (Cohen et al., 2001). Der Lamin B Rezeptor hat eine N-terminale, nukleoplasmatische Domäne, die Serin und Arginin reiche Abschnitte, sowie Phosphoakzeptorstellen für die cdc2 Kinase und die Kinase A enthält. Die C-terminale Domäne ist hydrophob und beinhaltet acht mögliche Trans-membrandomänen (Ye und Worman, 1994). Bei der Interaktion mit B-Typ Laminen sind die ersten 60 Aminosäuren des LBR von besonderer Bedeutung (Holmer und Wor-man, 2001; Lin et al., 1996). Die N-terminale Domäne bindet außerdem DNA, wobei die Aminosäurereste 70-100 für diese Bindung essentiell sind (Ye und Worman, 1994).
Die Aminosäurereste 97-174 sind für die Interaktion mit HP1, einem Protein, dass mit Heterochromatin assoziiert ist, verantwortlich (Duband-Goulet und Courvalin, 2000; Ye et al., 1997). Diese Interaktionen könnten die Bindung von Heterochroma-tin an die innere Kernmembran begünstigen (Holmer und Worman, 2001). Der LBR sowie HP1 werden während der Mitose phosphoryliert, möglicherweise um dynami-sche Veränderungen der Kernstruktur und der Chromatinorganisation in der Mitose zu erlauben (Courvalin et al., 1992; Eissenberg et al., 1994). Während der Apopto-se wird das LBR-Protein erst spät durch CaspaApopto-sen gespalten (Duband-Goulet et al., 1998; Buendia et al., 1999). Weitere Bindungspartner sind das Histon H3/H4 Tetramer (Polioudaki et al., 2001) und HA95 (Martins et al., 2000). HA 95 ist ein Chromatin-assoziiertes Protein, das während der Mitose an der Kondensation der Chromosomen und der Depolymerisation der Kernhülle beteiligt ist (Martins et al., 2000, 2003).
LAP1 und LAP2 (Lamina-associated protein) wurden bisher nur in Vertebraten identifiziert (Cohen et al., 2001; Foisner und Gerace, 1993; Senior und Gerace, 1988). Bei LAP1 wird zwischen LAP1A (75 kD), LAP1B (68 kD) und LAP1C (55 kD) unterschieden, die jeweils eine Transmembrandomäne enthalten (Martin et al., 1995). Die Charakterisierung der cDNAs deuten darauf hin, dass alle drei LAP1 Proteine von einem Gen durch alternatives Spleißen gebildet werden (Martin et al., 1995). Während LAP1A und LAP1B in vitro sowohl Lamin A und C als auch Lamin B1 binden, interagiert LAP1C nur mit Lamin B1 (Foisner und Gerace, 1993).
In der Familie der LAP2 Proteine sind in der Maus sieben alternative Spleißvarianten bekannt, davon haben fünf jeweils eine Transmembrandomäne (β, β’, γ, δ, ) und zwei sind nicht membrangebunden (α, ζ) (Abbildung 1.2) (Berger et al., 1996). Im Menschen und in Xenopus laevis sind bisher nur drei Isoformen identifiziert worden (α, β, γ) (Abbildung 1.2) (Harris et al., 1994; Gant et al., 1999; Lang et al., 1999). Die Transmembrandomäne der integralen LAP Proteine liegt C-terminal, so dass der größte Teil des N-Terminus (die ersten 300-400 Aminsoäuren) im Nukleoplasma liegt. Die Isoformenβ, γ, δ, und ζ unterscheiden sich strukturell nur wenig, sie sind jeweils um einige Aminosäuren kürzer. LAP2α ist den anderen Spleißvarianten lediglich am N-Terminus ähnlich. Die drei Homologe in Xenopus laevis zeigen N- und C-terminal Gemeinsamkeiten mit dem humanen LAP2β (Dechat et al., 2000b). Zwei der Homologe sind in Oozyten, Eiern und im frühen Embryo zu finden, wohingegen die dritte Isoform nur in somatischen Zellen exprimiert wird (Lang et al., 1999).
et al., 2001). LAP2α bindet vorzugsweise A-Typ Lamine und ist, bis auf die Nukleoli, überall im Nukleoplasma verteilt. Weiterhin weist es eine Chromatinbindungsstelle auf (Dechat et al., 1998, 2000a; Vlcek et al., 1999). Im Vergleich zu anderen Isoformen scheint LAP2α während der Spermiogenese der Ratte hochreguliert zu sein (Alsheimer et al., 1998).
Emerin ist ein integrales Membranprotein mit einer Transmembrandomäne, gehört zur LEM Domänen Familie und wurde sowohl in Vertebraten, als auch in Invertebra-ten identifiziert (Cohen et al., 2001). Die LEM Domäne befindet sich wie bei anderen Vertretern dieser Familie am nukleoplasmatischen N-Terminus (Dechat et al., 2000b; Manilal et al., 1996), wohingegen sich die Transmembrandomäne am C-terminalen En-de befinEn-det (Abbildung 1.2). Emerin binEn-det in vitro sowohl A- als auch B-Typ Lamine (Clements et al., 2000; Lee et al., 2001), für die richtige Lokalisation in vivo sind al-lerdings A-Typ Lamine notwendig. In Zellen, in denen Lamin A ausgeschaltet wurde, ist Emerin im endoplasmatischen Retikulum lokalisiert (Sullivan et al., 1999; Muchir et al., 2003). Neben Lamin A interagiert Emerin über die LEM Domäne auch mit BAF (Lee et al., 2001). Weitere Bindungspartner sind G-Aktin (Fairley et al., 1999; Lattan-zi et al., 2003) sowie F-Aktin (Holaska et al., 2004) und der Transkriptionsrepressor GCL (germ cell-less) (Holaska et al., 2003).
Bei Patienten der X-chromosomal gekoppelten Form der EDMD (Emery-Dreifuss Muskeldystrophie) fehlt Emerin oder ist mutiert (Bione et al., 1994; Nagano et al., 1996). Eine weitere Variante der EDMD ist die autosomal dominante Form, bei der Mutationen im Lamin A Gen die Muskeldystrophie verursachen (Bonne et al., 1999). MAN1 ist ebenfalls ein LEM Domänen Protein und wurde wie Emerin in Vertebra-ten und InvertebraVertebra-ten identifiziert (Cohen et al., 2001; Lin et al., 2000). Die ersVertebra-ten
470 Aminosäuren des N-Terminus sind im Nukleoplasma lokalisiert, C-terminal liegen zwei Transmembrandomänen, so dass sich der C-Terminus ebenfalls im Nukleoplasma befindet (Abbildung 1.2) (Lin et al., 2000). Bindungspartner von MAN 1 sind BAF und Smad Transkriptionsfaktoren (Osada et al., 2003; Raju et al., 2003).
Weitere kürzlich entdeckte LEM Domänen Proteine sind LEM2/NET25 (Brachner et al., 2005; Schirmer et al., 2003) und drei uncharakterisierte Proteine in Säugern, LEM3, LEM4 und LEM5 (Lee und Wilson, 2004).
Nesprine sind Proteine der inneren und äußeren Kernmembran mit einer Transmem-brandomäne und mehreren Spectrin-Wiederholungen (Zhang et al., 2001), die sowohl in Vertebraten als auch in Invertebraten identifiziert worden sind (Gruenbaum et al., 2003). Im Menschen sind zwei Nespringene bekannt, nesprin-1 und nesprin-2 (auch be-kannt als Myne1, Syne1, NUANCE, Enaptin und MSP300), aus denen jeweils sieben Spleißvarianten hervorgehen können. Die Größe variiert von 1 MDa für Nesprin 1 bis 131 kDa für Nesprin 1α. Neben den Spectrin-Wiederholungen haben viele Nesprine auch eine Klarsichtdomäne am C-Terminus, die für die Lokalisation in der Kernhülle notwendig ist. Die größten Isoformen haben zusätzlich eine Calponindomäne am N-Terminus, die Aktin binden kann (Warren et al., 2005). Nesprin-1α und die kleineren Nesprin-2 Proteine α und β colokalisieren mit Emerin und der C-terminalen Region von Lamin A/C (Libotte et al., 2005; Mislow et al., 2002; Zhang et al., 2001, 2005).
Nurim kommt in Vertebraten und Invertebraten vor (Cohen et al., 2001). Es be-steht aus 262 Aminosäuren und hat fünf Transmembrandomänen, die durch kurze Schleifen voneinander getrennt sind (Rolls et al., 1999). Nähere Untersuchungen ha-ben gezeigt, dass die C-terminale Transmembrandomäne sehr lang ist und eine kurze Haarnadelstruktur aufweist, so dass das Protein eigentlich aus sechs Transmembran-domänen besteht und der C-Terminus auf der selben Seite liegt wie der N-Terminus (Hofemeister und O’Hare, 2005).
Die Funktion von UNC-84 wurde in C.elegans am detailiertesten untersucht (Gru-enbaum et al., 2005), Homologe sind aber auch in D. melanogaster und in Vertebraten identifiziert worden (Cohen et al., 2001). UNC-84 ist ein integrales Protein der inneren Kernmembran, das für die Position des Zellkerns verantwortlich ist. Dies wird über weitere Bindungspartner wie Nesprine oder UNC-83 in der äußeren Kernmembran vermittelt, die an Elemente des Cytoskeletts binden (Gruenbaum et al., 2005). Die Lokalisation von UNC-84 an der inneren Kernmembran ist von Laminen abhängig. Dabei ist nicht bekannt, ob UNC-84 direkt an Lamine bindet, oder ob die Bindung
Abbildung 1.2 Strukturelle Organisation und funktionelle Domänen von LAP2 Isoformen und verwand-ten Proteinen: Sechs alternative Spleißvarianverwand-ten wurden in Säugerzellen und drei in Xenopus laevis identifiziert. Die meisten Isoformen sind strukturell ähnlich aufgebaut, sie unterscheiden sich nur durch kurze Insertionen in der nukleoplasmatischen Domäne (dargestellt durch unterschiedlich grüne Ab-schnitte). Bis auf LAP2α und XeLAP2-clone3 enthalten alle Proteine mindestens eine Transmembran-region, die die innere Kernmembran durchspannt. Der bei allen LAP2 Proteinen ähnliche N-Terminus enthält eine LEM Domäne, die auch in Emerin und MAN1 zu finden ist. Die Xenopus-spezifischen Proteinbereiche sind durch unterschiedlich braune Abschnitte dargestellt. Abbildung aus Dechat et al., 2000b.
über weitere Proteine vermittelt wird (Lee et al., 2002). UNC-84, sowie vier mensch-liche Homologe enthalten ein C-terminales Motiv von ungefähr 120 Aminosäuren, die SUN Domäne (Sad1/UNC-84 Homologie) (Malone et al., 1999).
1.1.4 Nukleoplasmatische Proteine der Kernperipherie
BAF ist ein 10 kDa großes, hoch konserviertes Protein, das doppelsträngige DNA, Chromatin, Histone, LEM Domänen Proteine und verschiedene Transkriptionsfakto-ren bindet, wodurch es den Aufbau der Kernhülle wähTranskriptionsfakto-rend der Mitose, sowie die Genexpression und Prozesse in der Embryonalentwicklung, reguliert. Einige dieser Funktionen werden durch die Phosphorylierung des N-Terminus von BAF durch die VRK (vaccina-related kinase) kontrolliert ((Margalit et al., 2007a,b).
GCL ist ein Transkriptionsrepressor, der in Vertebraten und Invertebraten konser-viert ist (Holaska et al., 2003). GCL bindet LAP2β und die DP3 Untereinheit des E2F-DP Heterodimers, wodurch die Transkription gehemmt wird. E2F-DP abhängige Gene könne außerdem durch das Retinoblastomaprotein reguliert werden (de la Luna et al., 1999; Nili et al., 2001). In vitro konnte weiterhin gezeigt werden, dass GCL mit Lamin A, Emerin und BAF interagiert (Holaska et al., 2003).
Das Protein Btf ist ein proapoptotischer Transkriptionsrepressor, der Emerin bin-det und bei der Apoptoseinduktion vom Nukleoplasma zur Kernhülle relokalisiert. Btf könnte also Emerin benötigen, um im Zellkern den programmierten Zelltod zu signalisieren (Haraguchi et al., 2004).
Das nukleoplasmatische Protein Otefin ist bisher nur in Drosophila gefunden wor-den (Cohen et al., 2001). Es enthält eine LEM Domäne (Padan et al., 1990), wird in allen Zellen exprimiert und bindet das B-Typ Lamin Dm0 und Chromatin (Goldberg et al., 1998). Otefin wird durch ein Kernlokalisationssignal (NLS) in den Kern trans-portiert und dort durch eine hydrophobe Region im C-Terminus an die Kernperipherie transportiert (Ashery-Padan et al., 1997).
1.2 Struktur der Lamine
Lamine haben eine kurze N-terminale Kopf Domäne (ca. 30-40 Aminosäuren), eine
α-helikale Rod Domäne (ca. 354 Aminosäuren, 52 nm) und eine C-terminale Schwanz
Rod Domäne wird in vier α-helikale Segmente eingeteilt, 1A, 1B, 2A, 2B. Diese Seg-mente sind durch die Linker L1, L12 und L2 voneinander getrennt (Abbildung 1.3) (Conway und Parry, 1990; Parry und Steinert, 1995; Stuurman et al., 1998). Die Lin-kerregionen liegen in ihrer Länge und Aminosäuresequenz hoch konserviert vor. Im Gegensatz zu den Linkerregionen in cytoplasmatischen Intermediärfilamenten enthal-ten die der Lamine keine Prolinreste, die die Bildung von α-Helices stören (Conway und Parry, 1988), weshalb alle Linkerregionen in Laminen in ihrer Struktur α-helikal sein könnten. Die Heptadenstruktur (Erläuterung siehe unten) bleibt im Linker L1 erthalten, aber nicht in den anderen beiden Linkern L12 und L2 (Parry et al., 1986). Die α-Helices der Rod Domäne enthalten ein charakteristisches Heptaden Wieder-holungsmuster, gekennzeichnet durch a, b, c, d, e, f und g. Dabei befinden sich an den Positionen a und d hydrophobe Aminosäuren, an den Positionen e und g gela-dene und an den übrigen Stellen polare Aminosäuren (McLachlan, 1978; Stuurman et al., 1998). Die daraus resultierenden α-Helices haben einen hydrophoben Saum auf ihrer Oberfläche, der von geladenen Resten flankiert wird. Diese Helices sind daher in der Lage, besonders feste Bindungen mit ähnlich aufgebauten Helices einzugehen (Stuurman et al., 1998). Im Vergleich zu cytoplasmatischen Intermediärfilamenten in Vertebraten ist die Rod Domäne der Lamine 42 Aminosäuren (sechs Heptaden) länger (Abbildung 1.3). Diese Verlängerung im Coil 1B wurde auch bei cytoplasmatischen Intermediärfilamenten von Invertebraten gefunden (Weber et al., 1989b; Erber et al., 1998). Das deutet darauf hin, dass die Lamine früh in der Evolution aufgetreten, und die cytoplasmatischen Intermediärfilamente aus den Laminen entstanden sind (Döring und Stick, 1990; Dodemont et al., 1990).
Neben den Linkerregionen gibt es am N-Terminus der Rod Domäne zusätzlich ein Segment aus 16 Aminosäuren und am C-Terminus der Rod Domäne ein Segment aus 30 Aminosäuren, die sowohl in Laminen als auch in allen Intermediärfilamenten hoch konserviert sind (Abbildung 1.4). Diese beiden Abschnitte spielen eine entscheidende Rolle bei der Assoziation zu höheren Strukturen (Coulombe und Fuchs, 1990; Cou-lombe et al., 1990; Heald und McKeon, 1990; Stuurman et al., 1998). Der C-Terminus enthält ebenfalls eine konservierte Region von 105 Aminosäuren (Riemer et al., 2000), sowie ein Kernlokalisationssignal (NLS) (Loewinger und McKeon, 1988) und bei den meisten Laminen eine CaaX-Box (Nigg, 1992b,a; Firmbach-Kraft und Stick, 1995). Die konservierte Region von 105 Aminosäuren im C-Terminus ist im menschlichen La-min A Protein durch Röntgenstrukturanalyse (Dhe-Paganon et al., 2002) und NMR-Spektroskopie (Krimm et al., 2002) näher untersucht worden. Sie enthält eine dem Im-munglobulin ähnliche β-Faltblattstruktur, die in vitro DNA-bindende Eigenschaften aufweist (Dhe-Paganon et al., 2002; Stierlé et al., 2003). Weiterhin ist dieser Teil der Schwanz Domäne vermutlich an der Elongationsphase der DNA-Replikation durch di-rekte Bindung an PCNA (proliferating cell nuclear antigen) beteiligt (Shumaker et al., 2008).
Das NLS ist für den Transport der Lamine in den Zellkern verantwortlich und not-wendig. Es besteht aus vier bis fünf aufeinander folgenden basischen Aminosäureresten (Loewinger und McKeon, 1988). Die CaaX-Box (C = Cystein, a = eine aliphatische Aminosäure, X = eine terminale Aminosäure, die den Typ des Isoprenrestes bestimmt) ist für die Zielsteuerung an die innere Kernmembran notwendig (Firmbach-Kraft und Stick, 1993). Das Cystein in diesem Sequenzmotiv stellt das Ziel für die Farnesylierung und Carboxymethylierung dar (Marshall, 1993), wobei die terminale Aminosäure X wichtig für die Art der Modifikation ist. Bei Serin, Alanin oder Methionin wird das Cystein farnesyliert (C15 Isoprenylrest: Farnesylgruppe), wohingegen bei Leucin das Cystein geranylgeranyliert wird (C20 Isoprenylrest: Geranylgeranylgruppe). Alle La-mine mit einer CaaX-Box werden farnesyliert (Moir, 1995), dabei wird zunächst die Isoprenyl-Gruppe durch eine Thioetherbindung an die SH-Gruppe des Cysteins gebun-den. Die drei C-terminalen Aminosäuren (-aaX) werden durch Proteolyse abgespalten und das Cystein anschließend carboxymethyliert (Marshall, 1993). Bei A-Typ Laminen erfolgt eine weitere proteolytische Spaltung. Dadurch werden die letzten 18 Aminosäu-ren, die das C-terminale Cystein enthalten, entfernt (Weber et al., 1989a). Das Protein wird daher in der Mitose löslich. B-Typ Lamine bleiben isoprenyliert (Gerace und
Blo-Stuurman et al., 1998). Die p34cdc2/Cyclin B Kinase ist für den Abbau der Lamina in der Mitose verantwortlich, dabei ist die Phosphorylierungsstelle N-terminal der Rod Domäne im konservierten SPTR Sequenzmotiv essentiell. Durch die Phosphorylierung des Serinrestes in diesem Motiv dissoziieren die Kopf-Schwanz Polymere, nicht aber die Dimere in vitro. Das konservierte Sequenzmotiv SPSP, das sich C-terminal der Rod Domäne befindet, enthält zwei Phosphorylierungstellen, die aber in vitro durch die Phosphorylierung der p34cdc2/Cyclin B Kinase keine Depolymerisierung der La-mina induzieren. Vermutlich steht hier die Inhibition der Interaktionen mit anderen Kernproteinen oder der DNA im Vordergrund (Heald und McKeon, 1990; Peter et al., 1990a,b; Peter und Nigg, 1991). Weiterhin konnte in vitro gezeigt werden, dass der Serinrest in der Kopf Domäne als Substrat für die MAP Kinase dient. Die beiden C-terminalen Phosphoakzeptorstellen werden aber nicht durch die MAP Kinase phos-phoryliert (Peter et al., 1992). Die Lamine werden in der Interphase phosphos-phoryliert, um eine dynamische Lamina zu gewährleisten. In diesem Zusammenhang konnte ge-zeigt werden, dass die Proteinkinasen A und C bei der Phosphorylierung sowohl in
vitro als auch in vivo eine Rolle spielen. Dabei scheinen die Phosphorylierungen auch
den Transport der Lamine in den Kern zu beeinflussen, aber weniger die Dissoziation der Kopf-Schwanz Polymere (Collas et al., 1997; Haas und Jost, 1993; Hennekes et al., 1993; Peter et al., 1990a).
1.3 Polymerisation von Laminen
Lamine bilden zunächst durch die Assoziation zweier Rod Domänen parallel ange-ordnete α-helikale coiled coil Dimere (Heitlinger et al., 1992). Die Dimere sind von
Abbildung 1.4 Schematische Darstellung der chemischen Merkmale von Kernlaminen: Dieα-helikale Rod Domäne ist für die Dimerisierung und Filamentbildung verantwortlich. Die Schraffur stellt die hoch konservierten Regionen dar. In der Kopf und Schwanz Domäne ist jeweils eine Phosphorylierungsstelle vorhanden. Das NLS ist für die Zielsteuerung der Lamine in den Zellkern notwendig. Die CaaX-Box ist für die Zielsteuerung an die innere Kernmembran notwendig. Lamin A wird nach der Isoprenylierung proteolytisch gespalten. Abbildung aus Stuurman et al., 1998.
den globulären nicht α-helikalen Kopf und Schwanz Domänen flankiert. Im zweiten Schritt interagieren sie der Länge nach zu Polymeren durch eine kurze Überlappung der Kopf Domänen mit den Schwanz Domänen des nächsten Dimers (Heitlinger et al., 1991; Steinert et al., 1993b,a; Herrmann und Aebi, 2004). Die hoch konservierten Regionen am N- und C-Terminus der Rod Domäne sind dabei für eine korrekte Asso-ziation entscheidend (Fuchs und Weber, 1994; Herrmann und Aebi, 1998). In vitro bilden Lamine abschließend Parakristalle mit einem 24,5 nm breiten Hell-Dunkel-Wiederholungsmuster. Bei der Parakristallbildung assoziieren die Polymere lateral, möglicherweise antiparallel und gestaffelt (Heitlinger et al., 1991). In vivo ist dieses Verhalten nicht zu beobachten. Das deutet darauf hin, dass Lamine durch Interaktio-nen mit anderen ProteiInteraktio-nen im Kern organisiert werden und daher die Assoziation zu parakristallinen Strukturen in vivo verhindert wird (Gruenbaum et al., 2003).
1.4 Interaktionen der Lamine
Viele der bisher bekannten integralen Proteine der inneren Kernmembran interagieren direkt oder indirekt mit Laminen. Sie werden durch das endoplasmatische Retikulum zur inneren Kernmembran transportiert und durch Interaktionen mit Laminen und Chromatin dort fixiert (Gruenbaum et al., 2003).
Lamine binden in vitro viele bekannte Proteine der inneren Kernmembran wie Emerin, MAN1, LBR, LAP1 und 2β (Abbildung 1.5) und Nesprin-1α. Lamine kön-nen auch Chromatinproteine wie Histon H2A oder H2B Dimere sowie die löslichen Proteine LAP2α, Aktin, Retinoblastomaprotein, BAF, und Komponenten des
RNA-sie die Regulierung des Zellzyklus unterstützen, sowie die Replikation und die Tran-skription (Furukawa et al., 2003; Johnson et al., 2004; Vlcek et al., 2002; Gruenbaum et al., 2005). Lamine können DNA in vitro und in vivo (Rzepecki et al., 1998) di-rekt binden. In vitro binden sie MARs/SARs-Regionen (matrix attachment/scaffold-associated regions) sowie Sequenzen der Centromere und der Telomere mit hoher Affi-nität (Ludérus et al., 1992; Baricheva et al., 1996; Shoeman und Traub, 1990). Lamine können auch einzelsträngige DNA binden (Ludérus et al., 1994). Die DNA-Bindung erfolgt durch die Rod Domäne und benötigt Laminpolymere (Zhao et al., 1996). Für die Bindung an Chromatin ist allerdings die Schwanz Domäne notwendig (Goldberg et al., 1999; Taniura et al., 1995). Bei der Chromatinbindung des Xenopus Lamins B2 beispielsweise sind die Aminosäurereste 404-419 und 432-467 beteiligt (Höger et al., 1991). Die Chromatinbindungsregionen der verschiedenen Lamine befinden sich außer-halb der Ig-ähnlichen Domäne, in einer unstrukturierten Region der Schwanz Domäne (Dhe-Paganon et al., 2002; Krimm et al., 2002).
Eine Beteiligung der Lamine an der Replikation haben Versuche mit Zellextrakten von Xenopus laevis gezeigt, aus denen Lamin LIII entfernt wurde. Dabei wird zwar eine Kernhülle aufgebaut, aber der Kern ist dann weniger stabil. Er enthält keine Lamina, und es findet keine Replikation der DNA statt (Jenkins et al., 1993; Newport et al., 1990; Meier et al., 1991). Nach Zugabe von Lamin LIII zu den Extrakten wird die DNA wieder repliziert (Goldberg et al., 1995). Weiterhin assoziieren Lamine im Nukleoplasma mit dem PCNA (proliferating cell nuclear antigen) und dem RFC (replication factor complex), die am Elongationsschritt der DNA Replikation beteiligt sind (Moir et al., 2000; Spann et al., 1997).
zwischen der Lamina, DNA und Chromatin-assoziierten Proteinen an der Kernperi-pherie und im Nukleoplasma verbinden das Chromatin mit der Kernhülle, organisieren es und nehmen so möglicherweise Einfluss auf die Transkriptionsaktivität (Mattout-Drubezki und Gruenbaum, 2003). Genarme Bereiche befinden sich dann an der Kern-peripherie und genreiche Chromosomen im Zentrum des Kerns (Boyle et al., 2001; Belmont et al., 1986; Hennig, 1999).
Die direkte oder indirekte Interaktion von Transkriptionsfaktoren mit der Lami-na deutet darauf hin, dass die LamiLami-na an der Genregulation beteiligt ist (Mattout-Drubezki und Gruenbaum, 2003). Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Laminor-ganisation für die Transkription durch die RNA-Polymerase II notwendig ist (Spann et al., 2002).
Der programmierte Zelltod, Apoptose, ist ein definierter genetischer Prozess, der für die normale Entwicklung und Homöostasie von Geweben notwendig ist. Er kann darüber hinaus auch als Antwort auf Krebs, Infektionen, spezifische Chemikalien oder Stress aktiviert werden. Die zelluläre Morphologie, die mit dem apoptotischen Pro-zess verbunden ist, ist charakterisiert durch Chromatinkondensation, Blasenbildung der Membranen, Clusterbildung von Kernporenkomplexen, Bildung von apoptotischen Vesikeln sowie DNA-Fragmentierung. Während der Apoptose wird eine proteolytische Kaskade ausgelöst, in die verschiedene Cystein-Aspartat Proteasen (Caspasen) invol-viert sind (Earnshaw, 1995; Gruenbaum et al., 2000, 2003; Nicholson, 1999; Nuñez et al., 1998; Robertson et al., 2000; Thornberry, 1998). Die Substrate für diese Cas-pasen sind im Zellkern Proteine wie Lamine, integrale Proteine der inneren Kern-membran (Buendia et al., 1999; Duband-Goulet et al., 1998; Gotzmann et al., 2000), sowie Kernporenproteine (Buendia et al., 1999; Kihlmark et al., 2001). Die Lamine A/C werden durch Caspase 6 an einem konservierten Aspartatrest (D230) in der Rod Domäne gespalten. In einigen Laminisotypen gibt es noch andere Erkennungssequen-zen für Caspasen, was darauf hindeutet, dass verschiedene Caspasen möglicherweise auch verschiedene Laminisotypen spalten (Rao et al., 1996; Ruchaud et al., 2002; Slee et al., 2001; Takahashi et al., 1996, 1997). Die proteolytische Spaltung der Lamine dient der Auflösung der Lamina während der Apoptose. Dieser Prozess ist notwendig für eine vollständige und erfolgreiche Apoptose, wie Experimente mit Mutanten, die nicht durch Caspasen gespalten werden können, zeigen (Rao et al., 1996).
Abbildung 1.5 Molekulare Interaktionen zwischen Komponenten der Lamina, dem Kernskelett und Chromatin: Diese Abbildung zeigt einige bereits bekannte Interaktionen von Laminen mit Proteinen des Zellkerns. Alle Proteine, die LEM (LAP2-Emerin-MAN) Domänen besitzen, können über das Protein BAF Chromatin binden. Das integrale Membranprotein LAP2β (dunkel grün/gelb) interagiert mit Lamin B. Die lösliche LAP-Form, LAP2α (blau/gelb) interagiert hingegen mit Lamin A und kann durch ein bisher unbekanntes chromosomales Protein (gelbe Box) Chromatin binden. Emerin (rot) und LAP1 (grün) sind integrale Membranproteine, die mit Lamin A interagieren. Ein mit Lamin B assoziierendes integrales Membranprotein mit acht möglichen Transmembrandomänen ist der LBR (rot-braun), der über HP1 auch Chromatin binden kann. Abbildung aus Vlcek et al., 2001.
1.5 Die Frühentwicklung des Krallenfrosches
Xenopus laevis
Seit einer Genomduplikation vor ca. 30 Millionen Jahren ist der KrallenfroschXeno-pus laevis tetraploid (Bisbee et al., 1977). Allerdings ist er funktionell diploid, was
durch die Existenz von bivalenten Chromosomen in der Meiose bestätigt wird (Mül-ler, 1974). Durch die Genomduplikation liegen die meisten seiner Gene im haploiden Chromosomensatz in zwei Kopien vor (Jeffreys et al., 1980; Hosbach et al., 1983).
Die Oozyten im Ovar eines ausgewachsenen Weibchens befinden sich bis zur Eirei-fung im Diplotän der ersten meiotischen Prophase (Dumont, 1972). Das Hauptlamin in diesem Stadium ist das Lamin LIII (Benavente et al., 1985; Stick und Hausen, 1985). Daneben sind geringe Mengen Lamin B1 und B2 vorhanden (Lourim et al., 1996). Nach der Eireifung bleiben die Eier bis zur Befruchtung in der Metaphase II der Meiose arretiert. Während dieser Phase steigt die Menge an Lamin B1 an. Es liegt dabei überwiegend löslich vor. Auch Lamin LIII und B2 bleiben während der Meiose trotz ihrer C-terminalen Isoprenylierung überwiegend löslich (Firmbach-Kraft und Stick, 1993; Lourim und Krohne, 1993), d.h. CaaX-Box abhängige Modifikationen sind zwar nötig für die Zielsteuerung der Lamine an die innere Kernmembran, reichen aber nicht, um sie dort stabil zu assoziieren (Hofemeister et al., 2000).
Das Lamin LIII Gen kodiert für zwei Spleißvarianten, LIIIa und LIIIb. Das Intron X des LIII Gens enthält ein alternatives Exon, das für LIIIb kodiert. Die beiden Proteine unterscheiden sich nur ihren letzten 12 Aminosäureresten (Döring und Stick, 1990). LIIIbenthält neben dem CaaX-Motiv eine Gruppe von sechs basischen Aminosäureres-ten sowie einen zusätzlichen Cysteinrest, während Lamin LIIIa nur das CaaX-Motiv enthält. LIIIa ist nach der Depolymerisation der Kernhülle in der meiotischen Me-taphase löslich, während LIIIb membrangebunden bleibt. Der zusätzliche Cysteinrest des LIIIb zusammen mit der Gruppe basischer Aminosäurereste dient als sekundäres Zielsteuerungssignal und ist für eine stabile Membranassoziation von Lamin LIIIb in
Xenopus Eiern verantwortlich (Hofemeister et al., 2000).
Während der frühen Amphibienentwicklung besteht der Zellzyklus zunächst nur aus S- und M-Phase, was eine schnelle, synchrone Zellteilung bis zur zwölften Tei-lung (Stadium 8 nach Nieuwkoop und Faber, 1967) gewährleistet. Transkription findet während dieser Zeit nicht statt. Alle benötigten Proteine sind entweder ausreichend im Ei vorhanden oder können aus maternaler mRNA translatiert werden. Ab dem Stadium 8 werden die Zellteilungen zunehmend asynchron, die Beweglichkeit der
Zel-sinkt in der Neurulation. Es kann in geringen Mengen bis zum Schwanzknospenstadium nachgewiesen werden (Stick und Hausen, 1985). In Kaulquappen ist es ab dem Stadi-um 47 in einigen Zellen nachweisbar. Es wurde zudem in adulten Tieren in Muskel-und Nervenzellen nachgewiesen (Benavente et al., 1985; Benavente Muskel-und Krohne, 1985).
1.6 Deletionsproteine von Laminen und ihre Wirkung
Die ersten Experimente mit Deletionsproteinen wurden durchgeführt, um mehr über die Laminpolymerisation und die Beteiligung der einzelnen Domänen an diesem Vorgang zu erfahren. Heitlinger et al. (1992) generierten drei Huhn-Lamin B2-Deletionsproteine und untersuchten ihr Polymerisationsverhalten in vitro. Dem ersten Deletionsprotein fehlt im Vergleich zum Wildtyp die Kopf Domäne (ΔN), dem zweiten die Schwanz Domäne (ΔC), und das dritte Deletionsprotein bestand nur aus der Rod Domäne (ΔNΔC). Alle drei Deletionsproteine waren in der Lage, Dimere zu bilden und lateral zu Parakristallen zu assoziieren. Die Rod Domäne scheint für die Bildung von Parakristallen verantwortlich zu sein. Nur das ΔC-Deletionsprotein konnte Kopf-Schwanz Polymere bilden, was darauf hindeutet, dass die Kopf Domäne bei diesem Vorgang eine wichtige Rolle spielt.
Weitere Versuchsansätze sollten die Beteiligung der Lamina bzw. der Lamine an der Replikation und der Transkription bestätigen. Spann et al. (1997 und 2002) konnten mit Hilfe einer dominant-negativ wirkenden, humanen Lamin A Mutante (ΔN LA) im Xenopus Eiextrakt sowie in BHK-21 (baby hamster kidney) Zellen zeigen, dass die DNA-Replikation und die RNA-Polymerase II-abhängige Transkription durch dieses Protein inhibiert wurde. Das DeletionsproteinΔN LA stört die normale
Laminorgani-sation, wodurch sich das endogene Lamin in Aggregaten im Nukleoplasma ansammelt. Ebenso ist die Verteilung von Replikationscofaktoren wie PCNA und RFC verändert. Diese Proteine sind Cofaktoren der DNA-Polymerase δ, die für die Elongationsphase der DNA-Replikation verantwortlich ist. Bei der Inhibierung der RNA-Polymerase II-Aktivität scheint das TATA-binding Protein, eine Komponente des Transkriptions-faktors TFIID, involviert zu sein. Ähnliche Ergebnisse bezüglich der DNA-Replikation zeitgen auch Ellis et al. (1997) im Xenopus Eiextrakt bei der Verwendung eines Lamin B1-Deletionsproteins, dem die Kopf Domäne und ein Teil der Schwanz Domäne fehlte. Izumi et al. (2000) stellten Xenopus Lamin B1 und humane Lamin A-Deletionsproteine her, indem sie die Kopf Domäne, die CaaX-Box oder die Kopf Domäne mit dem ers-ten Teil der Rod Domäne entferners-ten. Das Verhalers-ten dieser Proteine wurde in Chinese Hamster Ovary (CHO) Zellen analysiert. Alle Lamin A-Deletionsproteine zeigten ei-ne dominant-ei-negative Wirkung und bildeten mit endogeei-nem Lamin A Aggregate im Nukleoplasma. Eine Veränderung der Verteilung von DNA-Replikationscofaktoren wie PCNA wurde nicht beobachtet. Bei den Xenopus Lamin B1-Deletionsproteinen wirk-ten nur diejenigen dominant-negativ, denen die Caax-Box fehlte, sie bildewirk-ten ebenfalls Aggregate mit endogenem Lamin A, nicht aber mit Lamin B.
Schirmer et al. (2001) generierten ein humanes Lamin B1-Protein, dem 4/5 der α-helikalen Rod Domäne fehlte. In COS-7 Zellen wirkte dieses Protein dominant-negativ und veränderte die Verteilung des endogenen Lamins sowie die Form der Kernhülle. Endogenes Lamin und das Deletionprotein waren in Aggregaten an der Kernhülle nach-weisbar. Die Kernporen und integralen Membranproteine bildeten Gruppen in diesen Bereichen. Die Beteiligung der Rod Domäne an heterotypischen Lamin Interaktionen scheint demnach wichtig für die Kernorganisation zu sein.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte das Lamin LIII, das in Oozyten und im frühen Embryo den Hauptbestandteil der Lamina bildet, in seiner Funktion inhi-biert werden. Daher wurden drei Lamin LIII-Deletionsproteine hergestellt und auf ihre dominant-negative Wirkung in Oozyten und Embryonen des Krallenfrosches Xenopus
laevis sowie in Kulturzellen von Säugern untersucht. Die Deletionsproteine sollten
aufgrund ihrer veränderten Struktur die Filamentbildung des endogenen Lamins LIII beeinflussen. Bei der Laminpolymerisation spielen neben der Kopf Domäne (Heitlin-ger et al., 1992) auch die konservierten Regionen am N- und C-terminalen Ende der Rod Domäne eine wichtige Rolle. Sie sind entscheidend für die korrekte Assoziati-on zu Kopf-Schwanz Polymeren (Fuchs und Weber, 1994; Herrmann und Aebi, 2004;
LIII-Sequenz eine weitere Laminvariante identifiziert. Weitere Untersuchungen haben gezeigt, dass es sich bei diesem Lamin um ein auf die männliche Keimbahn beschränk-tes Protein von Xenopus laevis handelt. Bereits 1985 war von Benavente und Kroh-ne anhand von Westernblotanalysen und Immunfluoreszenzanalysen ein Keimbahn-spezifisches Lamin, das LIV, beschrieben worden. Bei dem im Rahmen dieser Arbeit identifizierten Lamin handelt es sich vermutlich um das von Benavente und Krohne beschriebene Lamin LIV. Es konnte auf Grund der nun vorliegenden Sequenz in seiner Struktur näher charakterisiert werden. Weiterhin wurde ein LIV-spezifischer Antikör-per generiert, um das Keimbahn-spezifische Lamin zu analysieren.
2.1 Herstellung der für die Deletionsproteine kodierenden
Plasmide
Wie bereits in der Einleitung beschrieben, sollten drei Deletionsproteine erzeugt wer-den, denen entweder die N-terminal gelegene konservierte Region (Flag ΔN rod LIII), die C-terminal gelegene konservierte Region (FlagΔC rod LIII) oder beide konservier-ten Regionen (FlagΔNΔC LIII) fehlten (Abbildung 2.1). Für die Herstellung des De-letionsproteins FlagΔN rod LIII wurden aufeinanderfolgend zwei Bgl II-Schnittstellen in die cDNA-Sequenz des pCS2+ Flag LIII-Plasmids eingefügt. Dazu wurden die Posi-tionen G147A und C150T sowie die PosiPosi-tionen T199G und C200A mutiert. Die Num-merierung erfolgte anhand der im Anhang vorliegenden Sequenz des Vektors pCS2+ Flag LIII. Das Einfügen der beiden Bgl II-Schnittstellen erlaubte die Deletion der Nu-kleotidsequenz, die für die N-terminale konservierte Region kodiert. Die aus dieser Deletion resultierende Aminosäuresequenz im Übergangsbereich ist in Abbildung 2.1 B gezeigt. Die Erzeugung der zweiten Bgl II-Schnittstelle führte zu einem Aminosäu-reaustausch im resultierenden Protein (S67E) (Abbildung 2.1).
Um das Deletionsprotein Flag ΔC rod LIII herzustellen, wurden zwei Bsp119I-Schnittstellen in die cDNA-Sequenz des oben genannten Ausgangsvektors eingefügt. Dazu wurden die Positionen G1141T und T1142C sowie die Positionen T1257G und C1259A mutiert. Mit Hilfe dieser beiden Bsp119I-Schnittstellen konnte die für die C-terminale konservierte Region kodierende Nukleotidsequenz deletiert werden. Die aus dieser Deletion resultierende Aminosäuresequenz im Übergangsbereich ist in Abbil-dung 2.1 C gezeigt. Auch die Erzeugung der zweiten Bsp119I-Schnittstelle führte zu ei-nem Aminosäureaustausch im resultierenden Deletionsprotein (T480K). Der Vollstän-digkeit halber sei angemerkt, dass auch das Einfügen der ersten Bsp119I-Schnittstelle einen Aminosäureaustausch (V381S) erzeugte, der allerdings keine Auswirkungen auf das Deletionsprotein hat, da die betreffende Region in diesem nicht mehr vorhanden ist.
Für die Herstellung des dritten Deletionsproteins, FlagΔNΔC rod LIII, wurden auf-einanderfolgend alle vier oben beschriebenen Restriktionsschnittstellen in die
cDNA-wurden Kern und Cytoplasma manuell voneinander getrennt, für die Gelelektropho-rese aufgearbeitet und die Proteine anschließend in einem 10 %igen Polyacrylamidgel aufgetrennt. Nach der Gelelektrophorese wurden die Proteine durch einen Western-blot auf eine PVDF-Membran übertragen. Mit Hilfe des Flag-Epitops, das sich am N-Terminus der Deletionsproteine befindet, konnten diese durch den primären Anti-körper M2 aus der Maus nachgewiesen werden. Als SekundärantiAnti-körper wurde ein mit Meerettich-Peroxidase konjugierter anti-Maus Antikörper verwendet. Der Westernblot in Abbildung 2.2 zeigt, dass die Deletionsproteine überwiegend im Kern nachgewie-sen wurden (Abbildung 2.2, Bahn 3, 5 und 7), wie es auf Grund des in der Schwanz Domäne vorhandenen NLS zu erwarten war. Im Cytoplasma war lediglich ein gerin-ger Anteil der Deletionsproteine nachweisbar (Bahn 2, 4 und 6). Als Negativkontrolle dienten Kerne und Cytoplasmen von nicht injizierten Oozyten.
Für den Nachweis des endogenen Lamins LIII stand der Antikörper L046F7 zur Ver-fügung, der aber auch mit den drei zu analysierenden Lamin LIII-Deletionsproteinen reagiert. Es wurde erwartet, dass die vier Proteine durch ihre unterschiedlichen Mole-kulargewichte (LIII: 69 kD; Flag ΔN rod LIII: 67 kD; FlagΔC rod LIII: 65 kD; Flag ΔNΔC rod LIII: 63 kD) unterscheidbar wären, was im Westernblot zu Doppelbanden
in den Kernfraktionen (Abbildung 2.3, Bahn 2, 4 und 6) führen sollte. Der in Abbil-dung 2.3 gezeigte Westernblot weist allerdings nur eine Bande in den Bahnen 2, 4 und 6 auf, so dass eine Unterscheidung des endogenen LIII von den Deletionsproteinen nicht möglich ist.
Durch die fehlenden konservierten Regionen in den Deletionsproteinen sollten diese, wie in der Einleitung beschrieben, das endogene Lamin LIII dominant-negativ
beein-Abbildung 2.1 Proteinstrukturen des LIII-Proteins und der von ihm abgeleiteten Deletionsproteine: In A ist die Domänenstruktur von Lamin LIII mit einem N-terminalen Flag-tag dargestellt. Die konservierten Regionen am N- bzw. C-Terminus der Rod Domäne sind durch gestrichelte Linien mar-kiert. Die Aminosäuresequenz unterhalb des Schemas zeigt Änderungen, die durch das Einfügen der Schnittstellen erzeugt wurden (rot: S67E; blau: V361S; grün: T480K). Die unterstrichenen Aminosäu-ren befinden sich nach der Deletion der jeweiligen konservierten Region noch im Protein. B, C und D zeigen die Domänenstrukturen FlagΔN rod LIII, FlagΔC rod LIII und FlagΔNΔC rod LIII. Jeweils unterhalb der Schemata in B, C und D sind die Aminosäuresequenzen der Übergangsbereiche aufgeführt.
Abbildung 2.2 Westernblotanalyse von LIII-Deletionsproteinen nach Expression inXenopus Oozyten: Die Lamin LIII-Deletionsproteine wurden durch Injektion von mRNA in Oozyten exprimiert. 24 Stunden nach der Injektion wurden Kern und Cytoplasma getrennt und die Proteine für die Analyse aufbereitet. Proteine von jeweils drei Cytoplasmen und den dazugehörigen Kernen wurden in einem 10 %igen Gel aufgetrennt, im Westernblot auf eine PVDF-Membran übertragen und durch Chemilu-mineszenzreaktion mit Hilfe des monoklonalen Antikörpers M2 als primären Antikörper nachgewiesen. Die Expositionszeit betrug zehn Minuten. In den Bahnen 7 und 8 wurden die entsprechenden Frak-tionen dreier nicht injizierter Kontrolloozyten aufgetragen. Die Position der Markerproteine ist links in kD angegeben.
Abbildung 2.3 Westernblotanalyse von LIII-Deletionsproteinen nach Expression inXenopus Oozyten: Die Deletionsproteine wurden, wie in der Legende von 2.2 beschrieben, exprimiert und nachgewiesen. In diesem Fall wurde der monoklonale Antikörper L046F7 als primärer Antikörper verwendet.
flussen. Die bisherige Analyse von Kernen und Cytoplasmen im Westernblot hat aber lediglich gezeigt, dass sich keine detektierbare Menge an endogenem Lamin LIII im Cytoplasma befindet (Abbildung 2.3, Bahn 1, 3 und 5). Lediglich die Deletionsprote-ine konnten durch den Antikörper M2 in Abbildung 2.2 im Cytoplasma nachgewiesen werden. Für eine weitere Analyse wurde zunächst die Verteilung der Deletionsproteine im Kern bestimmt, indem Kernhülle und Kerninhalt manuell voneinander getrennt wurden. Pro injiziertem Deletionsprotein wurden zehn Kerninhalte und die dazuge-hörigen Kernhüllen gelelektrophoretisch aufgetrennt und auf eine PVDF-Membran übertragen. Die Detektion der Deletionsproteine erfolgte mit dem Antikörper M2. Abbildung 2.4 zeigt, dass die Deletionsproteine überwiegend im Nukleoplasma nach-weisbar sind (Bahn 1, 3 und 5), während in der Kernhüllenfraktion nur ein geringer Anteil der Deletionsproteine vorhanden ist (Bahn 2, 4 und 6). Da die CaaX-Box, die eine Assoziation des Proteins mit der Membran ermöglicht, bei allen drei Deletions-proteinen vorhanden ist, war zu erwarten, dass sich die Deletionsproteine größtenteils in der Kernhüllenfraktion und nicht in der Nukleoplasmafraktion nachweisen ließen. Da das endogene Lamin LIII, das bis auf die Deletionen mit den Deletionsproteinen identisch ist, nur in der Kernhüllenfraktion detektierbar war (Abbildung 2.5, Bahn 9), bedeutet die veränderte Verteilung der drei Deletionsproteine entweder, dass die de-letierten Regionen das Bindungsverhalten der Deletionsproteine bzw. ihre Interaktion mit endogenem Lamin LIII negativ beeinflussen, oder aber dass die veränderte Ver-teilung auf ein Überexpressionsartefakt zurückzuführen ist. Allerdings konnten Ralle et al. (2004) zeigen, dass die Überexpression von Flag LIII keinen Einfluss auf die Verteilung des überexprimierten Proteins im Kern hat. Daher ist es wahrscheinlich, dass die veränderte Verteilung der Deletionsproteine auf die deletierten konservierten Regionen zurückzuführen ist.
Zudem sollte der Einfluss, den die Deletionsproteine im Kern auf die Verteilung des endogenen Lamin LIII haben könnten, durch gelelektrophoretische Auftrennung von Proteinen der Kernhülle und des Nukleoplasmas in einem 7,5 %igen Acrylamid-gel kontrolliert werden. Ein 7,5 %iges Gel wurde gewählt, um gegebenenfalls einen Größenunterschied zwischen LIII und den Deletionsproteinen nachweisen zu können. Dieser Nachweis im Westernblot erfolgte mit dem monoklonalen Antikörper L047F7. Wie in Abbildung 2.5 zu ersehen ist, beeinflusste auch ein 7,5 %iges Acrylamidgel das Laufverhalten der Deletionsproteine nicht ausreichend, um zwischen endogenem
La-Abbildung 2.4 Westernblotanalyse der Verteilung der LIII-Deletionsproteine im Oozytenkern: Die LIII -Deletionsproteine wurden durch Injektion von mRNA in Oozyten exprimiert. 24 Stunden nach der Injektion wurden die Kerne isoliert. Kernhüllen und Kerninhalte wurden voneinander getrennt und die Proteine für die Analyse aufbereitet. Proteine von jeweils 10 Kernhüllen und den dazugehörigen Kerninhalten wurden in einem 10 %igen Gel aufgetrennt, im Westernblot auf eine PVDF-Membran übertragen und durch Chemilumineszenzreaktion mit Hilfe des monoklonalen Antikörpers M2 als primären Antikörper nachgewiesen. Die Expositionszeit betrug zehn Minuten. In den Bahnen 7 und 8 wurden die entsprechenden Fraktionen nicht injizierter Kontrolloozyten aufgetragen. Die Position der Markerproteine ist links in kD angegeben.
min LIII und den Deletionsproteinen unterscheiden zu können, so dass die Verteilung des LIII auf diese Weise nicht bestimmt werden konnte.
Im Vergleich mit der Abbildung 2.4 sind in Abbildung 2.5 die Signale in den Kern-hüllenfraktionen deutlich stärker als die in den Nukleoplasmafraktionen. Da mit dem Antikörper L046F7 neben den Deletionsproteinen auch das endogene Lamin LIII de-tektiert wird, konnte aus den Veränderungen der Signalstärken geschlossen werden, dass sich das endogene Lamin LIII noch in der Kernhüllenfraktion befindet.
Die Verteilung der Deletionsproteine wurde zudem immunhistologisch untersucht, da die Expression der Deletionsproteine zu morphologischen Veränderungen des Zell-kerns führen könnte. Dazu wurden 10μm dicke Kryostatschnitte von Oozyten, die die Deletionsproteine exprimieren, hergestellt. Die Detektion der Deletionsproteine erfolg-te durch indirekerfolg-te Immunfluoreszenz mit dem Antikörper M2 bzw. für den Nachweis des endogenen Lamins LIII bei nicht injizierten Oozyten mit dem Antiköper L046F7. Die Kryostatschnitte von Deletionsprotein-exprimierenden Oozyten zeigten eine deutliche Färbung der Kernhülle (Abbildung 2.6 A; C, E), sowie eine schwache aber gleichmäßige Färbung des Nukleoplasmas, die bei Expression des FlagΔNΔC rod LIII
Abbildung 2.5 Westernblotanalyse der Verteilung der LIII-Deletionsproteine in Oozytenkernen: Die Deletionsproteine wurden, wie in der Legende von 2.4 beschrieben, exprimiert und für die Analyse aufbereitet. Die Proteine wurden in einem 7,5 %igen Gel aufgetrennt, im Westernblot auf eine PVDF-Membran übertragen und durch Chemilumineszenzreaktion mit Hilfe des monoklonalen Antikörpers L046F7 als primären Antikörper nachgewiesen. Die Expositionszeit betrug eine Minute. In den Bahnen 7 und 8 wurden die entsprechenden Fraktionen nicht injizierter Kontrolloozyten aufgetragen. Die Position der Markerproteine ist links in kD angegeben.
Proteins am stärksten war. Die Morphologie des Zellkerns blieb erhalten. Die leichte Verformung des Kerns, die in Abbildung 2.6 A (FlagΔN rod LIII-exprimierende Oozy-te) beobachtet wurde, ist durch die mechanische Einwirkung während des Schneidens erklärbar und weist nicht auf einen dominant-negativen Effekt des Deletionsproteins hin.
Wie aus der Literatur bereits bekannt ist, führt die Expression von Laminen häufig zur Bildung intranukleärer Membranen, die sich elektronenmikroskopisch charakte-risieren lassen (Goldberg et al., 2008a; Prüfert et al., 2004; Ralle et al., 2004). Ralle et al. (2004) konnten zeigten, dass die Induktion der intranukleären Membranen CaaX-Box abhängig ist, da eine N-Ras Mutante mit NLS und CaaX-CaaX-Box ebenfalls intranu-kleäre Membranen ausbilden konnte, während eine Lamin-Variante ohne CaaX-Box (B2-SaaX) keine Membranbildung induzierte. Lamin LIII-Überexpression in Oozyten führte zunächst zur Lokalisierung des Proteins an der inneren Kernmembran (Ralle et al., 2004). Bei massiver Überexpression von Lamin LIII bildeten sich aber auch intranukleäre Membranen (Goldberg et al., 2008a).
Immunfluoreszenzfärbungen von Lamin B1- bzw. B2-exprimierenden Oozyten zeig-ten eine inhomogen gefärbte Kernhülle, die auf die Ausbildung von intranukleären Membranen hinwies (Ralle et al., 2004). Im Gegensatz dazu weisen die in Abbildung
Ralle et al. (2004) beschriebenen Membranstapel wiesen eine Größe von 3-7 μm auf, während die Strukturen in Abbildung 2.7 lediglich 0,6-1,4 μm groß sind, weshalb sie wahrscheinlich in der Immunfluoreszenz nicht erkannt werden konnten. Die induzier-ten Membranen liegen zwar in der Nähe der Kernhülle, sind aber nicht direkt mit ihr verbunden. Lediglich in Abbildung 2.7 B könnte eine Verbindung zwischen der Membranstruktur und der Kernmembran vorhanden sein. Ein solches Bild wurde nur ein einziges Mal erhalten. Werden die von den verschiedenen Deletionsproteinen indu-zierten Membranstrukturen verglichen, so zeigen sich zwei verschiedene Muster. Die Expression von Flag ΔN rod LIII führte zur Ausbildung von Vesikeln (Abbildung 2.7 A, B, C). Nur sehr selten bildeten sich lockere Membranstapel (Abbildung 2.7 C). Die Expression von Flag ΔC rod LIII und Flag ΔNΔC rod LIII in Oozyten führte zur Ausbildung von sehr flachen und kurzen Zisternen. Zudem waren die durch Flag ΔC rod LIII- und Flag ΔNΔC rod LIII-Expression gebildeten Membranstapel pro
Schicht ca. 25 nm hoch, während die durch Flag ΔNrod LIII-Expression gebildeten Membranstapel eine Höhe von ca. 75 nm aufwiesen.
Die Expression der Deletionsproteine in Oozyten führte nicht zu phänotypischen Veränderungen der Oozyte. Oozyten sind in der ersten meiotischen Prophase arretiert und wachsen nicht mehr. Ihre Kernhülle weist daher nur eine geringe oder keine Dyna-mik auf, so dass dominant-negativ wirkende Laminproteine nur einen geringen Einfluss haben. Daher wurden alle drei Deletionsproteine zusätzlich in Embryonen exprimiert, da sich die Kernhülle während der schnellen Furchungsteilungen im raschen Auf- und Abbau befindet, die Deletionsproteine damit in die Kernhülle eingebaut werden und so möglicherweise dominant-negativ wirken können.
Abbildung 2.6 Lokalisation der Deletionsproteine in Oozyten durch indirekte Immunfluoreszenzfär-bung von Gefrierschnitten: Lamin LIII-Deletionsproteine wurden durch Injektion von mRNA in Oozyten exprimiert. 24 Stunden nach der Injektion wurden die Oozyten fixiert und nach Kry-oprotektion tiefgefroren. Von diesen Proben wurden 10μm dicke Kryostatschnitte hergestellt. Die LIII-Deletionsproteine wurden durch eine indirekte Immunfluoreszenzfärbung mit dem monoklonalen Antikörper M2 als primären und Cy3-gekoppelten Ziege-α-Maus-Antikörper als sekundären Antikör-per nachgewiesen (A-F). Das endogene Lamin LIIIwurde in Kontrolloozyten durch den monoklonalen Antikörper L046F7 als primären und Cy3-gekoppelten Ziege-α-Maus-Antikörper als sekundären An-tikörper nachgewiesen (G). A und B zeigen Schnitte einer FlagΔN rod LIII-exprimierenden Oozyte, C und D einer FlagΔC rod LIII-exprimierenden Oozyte, E und F einer Flag ΔNΔC rod LIII
-Abbildung 2.7 Die Expression von Lamin LIII-Deletionsproteinen in Oozyten führt zur Bildung intra-nukleärer Membranen: Die Deletionsproteine wurden durch Injektion der entsprechenden Plasmid-DNA in den Zellkern exprimiert. 24 Stunden nach der Injektion wurden die Oozytenkerne isoliert und für die elektronenmikroskopische Analyse fixiert, kontrastiert und eingebettet. Die Abbildung zeigt Ultradünnschnitte von Oozytenkernen nach Expression von FlagΔN rod LIII (A-C), FlagΔC rod LIII(D-F) und FlagΔNΔC rod LIII (G) sowie von Kernen nicht injizierter Oozyten (H und I).
2.3 Analyse der Deletionsproteine in Embryonen von
Xenopus
laevis
Um die Auswirkungen der Deletionsproteine auf die Entwicklung von Embryonen zu analysieren, wurden diese in Embryonen exprimiert. Als Kontrollen dienten Flag LIII -exprimierende sowie nicht injizierte Embryonen.
Für Untersuchungen im Westernblot wurden Embryonen verschiedener Stadien in flüssigem Stickstoff schockgefroren oder für die Immunhistologie fixiert. Die Eintei-lung der EntwickEintei-lungsstadien erfolgte nach Nieuwkop und Faber (1967). Die Entwick-lung von Deletionsprotein-exprimierenden Embryonen unterschied sich bis zur Ga-strula (Stadium 10 12 bis 11) nicht von der der Kontrollembryonen. Kurz nach Beginn der Gastrulation entstanden auf der Oberfläche von FlagΔN rod LIII-exprimierenden Embryonen Pigmentstörungen. Am Ende der Gastrulation (Stadium 12) (Abbildung 2.8 A und B) befanden sich Schichten von abgestorbenen Zellen auf den Embryonen. Die Embryonen entwickelten sich allerdings weiter (Abbildung 2.8 C und D), obwohl ihre Entwicklungsgeschwindigkeit im Vergleich zu der von Kontrollembryonen verlang-samt war. Die Penetranz des beschriebenen Phänotyps war abhängig von der Qualität des Geleges. Während 60-80 % der FlagΔN rod LIII-exprimierenden Embryonen den oben beschriebenen Phänotyp zeigten, entwickelten sich die übrigen 20-40 % normal. 5-10 % der Embryonen, die den Flag ΔN rod LIII-Phänotyp zeigten, konnten die Gastrulationsbewegungen nicht abschließen. Sie zogen den Dotterpfropf nicht ein und bildeten eine Exogastrula (Abbildung 2.8 D).
Embryonen, die die Deletionsproteine Flag ΔC rod LIII (Abbildung 2.8 E-G) und Flag ΔNΔC rod LIII (Abbildung 2.8 H-J) exprimierten, entwickelten sich ähnlich. Auch ihre Entwicklung verlief bis zum Ende der Gastrulation in Stadium 12 nor-mal, jedoch konnten sie die Gastrulationsbewegungen nicht abschließen. Der Dot-terpfropf wurde nicht vollständig eingezogen und eine Exogastrula entstand. Auch dieser Phänotyp zeigte keine 100 %ige Penetranz. Nur 40-50 % der Flag ΔC rod LIII -exprimierenden Embryonen zeigten diesen Phänotyp, während seine Penetranz bei Flag ΔNΔC rod LIII-exprimierenden Embryonen mit 20-40 % noch geringer war.
Im Gegensatz zu den Deletionsproteinen hatte die Expression von Flag Lamin LIII keine Auswirkungen auf die Embryonalentwicklung von Xenopus laevis (vgl. Abbil-dung 2.8 K,L mit M,N). Insgesamt schien die Expression von Flag ΔN rod LIII den
Abbildung 2.8 Äußerer Phänotyp von Lamin LIII-Deletionsprotein-exprimierenden Embryonen: LIII -Deletionsproteine wurden durch Injektion von mRNA in die Zygote exprimiert. Die Embryonen wur-den im Stadium 12 und 19 fotografiert. A-D zeigen FlagΔN rod LIII-exprimierende Embryonen, E-G Flag ΔC rod LIII-exprimierende Embryonen, H-J Flag ΔNΔC rod LIII-exprimierende Em-bryonen, K und L Flag LIII-exprimierende Embryonen, M und N Wildtypembryonen. Die Lamin LIII-Deletionsprotein-exprimierenden Embryonen zeigen entweder Schichten von abgestorbenen Zel-len auf ihrer Oberfläche (Pfeil) oder haben die Gastrulationsbewegung nicht vollständig abschließen
stärksten Effekt auf die Entwicklung der Embryonen zu haben. Die Expression der Deletionsproteine wurde durch eine Westernblotanalyse kontrolliert.
Dafür wurden Deletionsprotein-exprimierende Embryonen in verschiedenen Ent-wicklungsstadien in flüssigem Stickstoff schockgefroren, ihre Proteine isoliert, gelelek-trophoretisch aufgetrennt und auf PVDF Membranen übertragen. Die Immundetekti-on erfolgte mit dem mImmundetekti-onoklImmundetekti-onalen Antikörper M2, der gegen das Flag-Epitop gerichtet ist.
Für die Expressionskontrolle der Deletionsproteine wurden Embryonen der Stadien 7, 9, 10 und 19 aufgetragen und für die Expressionskontrolle von Flag LIII Wildtyp die Stadien 7, 9, 10, 12 und 21. Pro Deletionsprotein und Stadium wurden die Proteine eines Embryos aufgetrennt (Abbildungen 2.9, 2.10 und 2.11). Da die Embryonen sich auch über die Gastrula hinaus weiterentwickelten, könnte angenommen werden, dass die Deletionsproteine nicht ausreichend translatiert wurden oder in späteren Stadien bereits Protein abgebaut wurde. In diesem Fall müsste die detektierte Deletionsprote-inmenge sinken. Bei allen drei Deletionsproteinen ist allerdings ein Anstieg der Pro-teinmenge zu beobachten (Abbildung 2.9, Bahn 1-4 für Flag ΔN rod LIII, und, Bahn 6-9 für Flag ΔC rod LIII, sowie Abbildung 2.10, Bahn 1-4 für Flag ΔNΔC rod LIII). Im Vergleich zum Stadium 10 war das Signal im Stadium 19 deutlich stärker, d.h. die Proteinmenge stieg zwischen Stadium 10 und 19 deutlich an.
Um zu sehen, wann die Embryonen detektierbare Mengen der Deletionsproteine translatiert hatten, wurden frühe Stadien aufgetragen (Abbildungen 2.12 und 2.13). Flag ΔN rod LIII zeigte erst ab dem Stadium 6 (Abbildung 2.12, Bahn 3) ein sehr schwaches Signal, während Flag ΔC rod LIII bereits im Stadium 4 detektierbar war (Abbildung 2.12, Bahn 8). Die Doppelmutante zeigte schon ab Stadium 2 ein schwaches Signal (Abbildung 2.13, Bahn 4), im Stadium 4 konnte sie nicht detektiert werden (Bahn 5). Hier war entweder ein Embryo aufgetragen worden, der Flag ΔNΔC rod LIII nicht exprimiert hat oder bei dem die Proteine nicht vollständig isoliert worden waren. Im Stadium 6 (Bahn 6) war wieder ein schwaches Signal zu sehen.
Die unterschiedlich stark ausgeprägten Phänotypen innerhalb einer mit Flag ΔN rod LIII injizierten Injektionsserie lassen vermuten, dass die Embryonen die Möglich-keit haben, den Effekt des Deletionsproteins zu kompensieren, eventuell auf Grund von unterschiedlichen Konzentrationen von Flag ΔN rod LIII in den Embryonen. Da-her wurden neben Embryonen verschiedener Stadien auch welche mit verschiedenen Phänotypen aufgetragen (Abbildung 2.14). Die Detektion der Deletionsproteine
er-Abbildung 2.9 Westernblotanalyse von LIII-Deletionsproteinen nach Expression inXenopus Embryo-nen: Die beiden Lamin LIII-Deletionsproteine FlagΔN rod LIII und Flag ΔC rod LIII wurden durch Injektion von mRNA in die Zygote exprimiert. Embryonen wurden in den Entwicklungsstadien 7, 9, 10 und 19 fixiert und die Proteine für die Analyse aufbereitet. Proteine von jeweils einem Embryo wurden in einem 10 %igen Gel aufgetrennt, im Westernblot auf eine PVDF-Membran übertragen und durch Chemilumineszenzreaktion mit Hilfe des monoklonalen Antikörpers M2 als primären Antikör-per nachgewiesen. Die Expositionszeit betrug eine Minute. Die Position der Markerproteine ist links in kD angegeben.
Abbildung 2.10 Westernblotanalyse von LIII-Deletionsproteinen nach Expression inXenopus Embryo-nen: Das Lamin LIII-Deletionsprotein FlagΔNΔC rod LIII wurde durch Injektion von mRNA in die Zygote exprimiert. Embryonen wurden in den Entwicklungsstadien 7, 9, 10 und 19 fixiert und die Proteine für die Analyse aufbereitet. Proteine von jeweils einem Embryo wurden in einem 10 %igen Gel aufgetrennt, im Westernblot auf eine PVDF-Membran übertragen und durch Chemilumines-zenzreaktion mit Hilfe des monoklonalen Antikörpers M2 als primären Antikörper nachgewiesen. Die Expositionszeit betrug eine Minute. Die Position der Markerproteine ist links in kD angegeben.
Abbildung 2.11 Westernblotanalyse von Flag LIII Wildtyp nach Expression in Xenopus Embryonen: Flag LIIIWildtyp wurde durch Injektion von mRNA in Embryonen exprimiert. Während der Ent-wicklung wurden Embryonen jeweils in den Stadien 7, 9, 10, 12 und 21 fixiert und die Proteine für die Analyse aufbereitet. Proteine von jeweils einem Embryo wurden in einem 10 %igen Gel aufge-trennt, im Westernblot auf eine PVDF-Membran übertragen und durch Chemilumineszenzreaktion mit Hilfe des monoklonalen Antikörpers M2 als primären Antikörper nachgewiesen. In den Bahnen 6-8 wurden die Proteine von nicht injizierten Embryonen der Stadien 10, 12 und 21 aufgetragen. Die Expositionszeit betrug eine Minute. Die Position der Markerproteine ist links in kD angegeben.
Abbildung 2.12 Westernblotanalyse von LIII-Deletionsproteinen nach Expression inXenopus Embryo-nen: Die beiden Lamin LIII-Deletionsproteine FlagΔN rod LIII und FlagΔC rod LIII wurden durch Injektion von mRNA in die Zygote exprimiert. Embryonen wurden in den Entwicklungs-stadien 2, 4, 6, 8 und 10 fixiert und die Proteine für die Analyse aufbereitet. Proteine von jeweils einem Embryo wurden in einem 10 %igen Gel aufgetrennt, im Westernblot auf eine PVDF-Membran übertragen und durch Chemilumineszenzreaktion mit Hilfe des monoklonalen Antikörpers M2 als primären Antikörper nachgewiesen. Die Stadien 8 und 10 von Flag ΔC rod LIII-exprimierenden Embryonen sind in Abbildung 2.13 zu finden. Die Expositionszeit betrug eine Minute. Die Position der Markerproteine ist links in kD angegeben.
