Aminosäuren

Die Bestimmung der Aminosäuren beruhte auf dem Prinzip der Ionenaustauscherchromatographie. Hierfür wurden die Proben zunächst mittels eines sauren Hydrolyseaufschlusses bzw. eines Oxidationsaufschlusses (Methionin) vorbereitet. Für den Aufschluss wurde der zu untersuchenden Probe HCl bzw. Perameisensäure, Natriumdisulfit und phenolische HCl hinzu gegeben. Anschließend fand eine Trennung der Aminosäuren entsprechend ihrer Polarität durch Ionenaustauscherchromatographie im Amino Acid Analyzer LC 3000 der Firma Biotonic (Hamburg) statt. Ein bestimmtes pH-Wert- und Temperaturprogramm ermöglichte ein zeitlich getrenntes eluieren der Aminosäuren. Nach einer Anfärbung mit Ninhydrin, konnten die Aminosäuren daraufhin bei 440 und 570 nm photometrisch erfasst werden.

1.9.5 Mengenelemente

Zur Bestimmung der Mengenelemente in den Futterproben, den Futterrückwaagen und in den Kot- sowie Harnproben wurden zunächst mittels Nassveraschung Aschelösungen hergestellt.

Hierzu wurden die Futterproben, die Futterrückwaagen, der Kot und auch der Harn mittels Direkterhitzung verascht: 3 g des Probenmaterials wurde in einen 100 ml Kjeldahlkolben

eingewogen. Nach Zugabe von 15 ml eines Veraschungsgemischs - bestehend aus 1000 ml Salpetersäure (65 %-ig) und 250 ml Perchlorsäure (70 %-ig) - wurde die Probe zwecks Oxidierung organischer und Lösung anorganischer Bestandteile bis kurz vor dem Eindampfen erhitzt. Dabei wird die vollständige Entfernung organischer Anteile durch den Farbumschlag der Lösung von dunkel nach hell angezeigt. Nach dem Abkühlen wurde die Probe mit 5 ml Salzsäure kurz aufgekocht (hierdurch werden die anorganischen Verbindungen in Chloride überführt, welche sich besser messen lassen als Perchlorate, Phosphate oder Sulfate). Des Weiteren werden flüchtige Pyro-Phosphate in Ortho-Phophate überführt. Nach Überspülen in einen 50 ml- Messkolben mit heißem destillierten Wasser und Filtration durch ein aschefreies Schwarzbandfilterpapier (Schwarzband Rundfilter, Fa. Schleicher & Schuell, Dassel) wurde die Probe bis zur Eichmarke des Messkolbens mit destilliertem Wasser aufgefüllt, geschwenkt und zur Aufbewahrung in eine 50 ml Plastikflasche mit Schraubverschluss, die zuvor mit einem Teil der Probe ausgespült wurde, umgefüllt.

- Calcium, Magnesium

Vor der Messung dieser Mineralstoffkonzentrationen in den Aschelösungen wurde diesen, zum Zwecke der Verdünnung und Maskierung von Störionen eine Lanthachloridlösung (0,5 %-ig) zugefügt. Anschließend wurden mittels Atomabsorptionspektrometrie (Solar 696, Fa. Unicam, Camebridge) die Ca- und Mg-Gehalte nach SLAVIN (1968) bestimmt.

Die veraschte Probelösung wurde dabei feinzerstäubt in eine Azetylen-Luft-Flamme gesaugt, woraus die Überführung der Mengenelementionen in ihren atomaren Zustand resultierte. Die Absorption distinktiver, für diese Atome charakteristischer Wellenlängen, ermöglichte die Bestimmung der Ca- und Mg-Konzentrationen.

- Phosphor

Der Phosphorgehalt der Proben wurde nach Herstellung einer Farblösung durch Zugabe von 10 ml eines Reagenziengemischs (Salpetersäure, Ammoniumvanadat- und Ammoniummolybdatlösung; jeweils zu gleichen Teilen) zu 500 µl der Aschelösung und Abfüllen mit Wasser bis zur 50 ml Marke colorimetrisch nach GERICKE und KURMIES (1952) bestimmt. Dabei reagieren Ammoniumvanadat und Ammoniummolybdat mit der in der Aschelösung enthaltenen Orthophosphorsäure im salpetersauren Milieu zu einem gelben Farbkomplex.

Die Extinktion des Filtrats sowie einer Eichlösung wurden mit einem Spektralphotometer (Cadas 100, Fa. Lange) nach 30 min bei 365 nm gemessen.

- Natrium, Kalium

Mit Hilfe des Flammenphotometers (M & D Acetylen, Fa. Lange) wurden die Na- und K-Konzentrationen der Aschelösungen nach dem Flammenemmissionsverfahren nach SCHUHKNECHT und SCHINKEL (1963) ermittelt. Als Verdünnungslösungen dienten Caesiumchlorid und Aluminiumnitrat. Durch Rückkehr der durch Anregung (hohe Temperaturen) auf ein höheres Energieniveau gelangten Außenelektronen in ihren Ausgangszustand, gaben die Elemente Energie in Form von Lichtquanten ab. Die Intensität des freiwerdenden Lichts wurde gemessen und entsprach quantitativ den enthaltenden Mengen des jeweiligen Elements.

- Chlorid

Bei der Chloridbestimmung wurden von den festen, gemahlenen Proben 2,5 g in einen 25 ml Messkolben eingewogen. Die Hälfte des Volumens wurde mit Aqua dest. aufgefüllt und über 30 min geschüttelt. Anschließend wurden die Messkolben bis zur Eichmarke aufgefüllt und erneut sorgfältig geschüttelt. Ein Teil der Suspension wurde entnommen, 15 Minuten zentrifugiert und der klare Überstand abgenommen und dabei der Chloridgehalt ermittelt.

Im Harn wurde der Chloridgehalt in 100 µl der unverdünnten Probe direkt bestimmt. Bei der Chloridbestimmung wurde nach dem Prinzip der Fällungsreaktion mit dem Chlorid Analyser 925 (Fa. Ciba Corning, Gießen) gearbeitet. Zwei Silberelektroden gaben eine konstante Menge Silberionen in die vorgelegte Lösung ab. Die vorliegenden Chloridionen wurden durch diese Silberionen als Silberchlorid ausgefällt. Nach Fällung aller Chloridionen wurde die Titration aufgrund der in diesem Moment sprunghaft ansteigenden Leitfähigkeit der Lösung gestoppt. Die abgegebenen Menge Silberionen entsprach dem Chloridgehalt.

1.9.6 Sulfat

Die Bestimmung des Sulfatgehalts erfolgte gravimetrisch. Jeweils 3 g des getrockneten und gemahlenen Probematerials wurden in einen mit konzentrierter Salzsäure ausgekochten und mit Aqua dest. gespülten, getrockneten Porzellantiegel eingewogen und über sechs Stunden bei 500°C im Muffelofen verascht.

Anschließend wurde zu dem veraschten Material 20 ml 6-molare Salzsäure hinzugefügt und das ganze bis zum Sieden erhitzt. Nach Zugabe von 50 ml Aqua dest. wurde die Lösung durch einen Faltenfilter (Nr. 595, 18 cm, Fa Schleicher und Schuell, Dassel) filtriert und im Anschluss auf 200 ml mit Aqua dest. aufgefüllt.

Nach Erhitzen der Lösung bis zur Siedetemperatur erfolgte die Zugabe von 10 ml einer Bariumchloridlösung (10 %ig). Die Lösung wurde dann weiter für eine Stunde bei 80°C erwärmt, wobei BaSO4 ausfiel.

Der klare Überstand wurde mit Hilfe eines Blaubandfilters (Blauband Rundfilter, Fa.

Schleicher und Schuell, Dassel; mit 7,4 %-iger Salzsäure vorbehandelt) gefiltert, und das ausgefallene BaSO4 mit heißem Aqua dest. auf den Filter überführt.

Der Filter wurde danach in einem gewichtskonstanten Porzellantiegel für mindestens eine Stunde im 105°C Trockenschrank getrocknet und anschließend bei 500°C für 3 Stunden im Muffelofen verascht. Das Bariumsulfat wurde nach Abkühlung im Exsikkator ausgewogen und der Sulfatgehalt wie folgt errechnet:

SO₄^2- [mg] = BaSO4 [mg] * 0,4116

1.9.7 pH-Wert

Der pH-Wert des unverdünnten Harns wurde unmittelbar nach der Entnahme elektrometrisch mit einem pH-Meter (Multi Cal^® pH 526, Fa. WTW) bestimmt. Dasselbe Gerät wurde auch zur Bestimmung des pH-Wertes im Frischkot der Tiere verwendet. Geeicht wurde mit gebrauchsfertiger Lösung der Fa. E. Merck, Darmstadt, im Bereich pH 4 - 7 bzw. pH 7 - 9.