Leitung: Prof. Dr. Hans-Rudolf Glatt
䊏1 Chemisch synthetisierte Desoxyguanosin-Adduktstandards. Sterne kennzeichnen mit stabilen Isotopen markierte Positionen. Damit konnten wir zeigen, dass diese DNA-Addukte in Zellen in Kultur, in Tiermodellen und/oder in Humangeweben durch Metabolite von Lebens mittelinhaltsstoffen gebildet werden: durch beim Erhitzen entstehende Substanzen (I, Furfuryl -alkohol; II, 5-Hydroxymethylfurfural; VII, PhIP), sekundäre Pflanzenmetabolite (III, Methyl euge nol;
IV, Glucobrassicin; V, Neoglucobrassicin) und eine Umweltkontaminante (VI, 1-Methyl pyren).
Summary Humans take in via food and air substantial levels of non-nutri-tive compounds. Those of low molecu-lar weight are calledxenobiotics (foreign compounds) even when from natural sources. Since xenobiotics can interfere with physiological processes, they have to be eliminated from the body. This is often possible only after biotransfor-mation by the body’s own enzymes.
Biotransformation sometimes leads to formation of chemically reactive inter-mediates that no longer underlie meta-bolic control and may bind covalently to cellular constituents. The reaction products (adducts) provide information on the structure of the causing agent.
Their distribution can indicate potential target tissues, and the modified cellu-lar structures allow an estimate of any adverse effects. In this way, nearly all DNA adducts induce mutations unless these are repaired rapidly. Mutations play a key role in chemical carcinogen-esis. Protein adducts may cause allergies or autoimmune reactions or be cyto-toxic. Even a few adducts per cell may cause serious damage to the organism.
Since tissues contain very low levels of adducts, their detection is an analytical challenge. Adducts in blood proteins can be used as biomarkers to assess exposure to specific reactive intermedi-ates because these proteins are present in relatively high concentrations.
During the reporting period, one of our focal points was the development of sensitive and specific methods for detection of DNA and protein adducts caused by food constituents. We analyzed the frequency, structure, and persistence of chemically induced adducts in cell cultures. In animal mod-els and occasionally in humans, we also investigated their tissue distribution.
We correlated adducts with specific components of the biotransformation system and with biological effects, such as mutagenesis and carcinogenesis.
Department of Nutritional Toxicology Head: Prof. Dr. Hans-Rudolf Glatt
䊏1 Chemically synthesized deoxyguanosine adduct standards labeled with stable isotopes (positions marked by asterisk).
We showed that these DNA adducts are formed in cells in culture, animal models and/or human tissues by metabolites of foodborne xenobiotics: heatinduced com pounds (I, furfuryl alcohol; II, 5hydroxy -methy furfural; VII, PhIP), secondary plant metabolites (III, methyleugenol; IV, gluco -bras sicin; V, neogluco-brassicin) and an environmental contaminant (VI, 1methyl -pyrene).
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Analytik makromolekularer Addukte Gitte Barknowitz, Wolfram Engst, Kristin Herrmann, Bernhard Monien, Fabian Schumacher
Wir verwenden das 32 P-Postlabelling-Verfahren, um DNA-Addukte zu erfassen.
Der Vorteil dieser Methode liegt darin, dass viele verschiedene Addukte nachge-wiesen werden können – auch solche, deren Struktur noch unbekannt ist. Mit diesem Verfahren konnten wir zeigen, dass der Verzehr von Brokkoli und anderen Brassica-Arten in vielen Geweben von Ratten und Mäusen zu charakteristischen DNA-Schäden führt. Auch beim Men -schen konnten wir diese Addukte in der Mundschleimhaut und im Blut nachwei-sen.
Zusätzlich etablierten wir massenspek-trometrische Nachweisverfahren für DNAAddukte. Dabei wird die zu Nukleo -siden verdaute DNA durch eine hochauf-lösende Flüssigchromatografie (UPLC) getrennt. In vitroließen sich manchmal so hohe Adduktniveaus erzeugen, dass wir direkt Massenspektren aufnehmen und
damit Informationen zur Struktur der Addukte gewinnen konnten. Die Nach -weis sensitivität konnten wir jedoch durch eine gezielte Analyse von Massen über gängen (MS/MS) um viele Größen -ord nungen steigern. Für eine absolute Quantifizierung wurden Standards der vermuteten Addukte chemisch dargestellt und ihre Struktur durch Kern spin -resonanzspektroskopie (NMR)-Analysen verifiziert. Wir synthetisierten auch Addukte, die mit stabilen Isotopen mar-kiert waren und setzten sie als interne Standards bei der massenspektrometri-schen Analyse von Proben ein. Damit gelang es, auch sehr niedrige Addukt -niveaus (10 Addukte pro Zelle) mit hoher Spezifität und Genauigkeit zu erfassen.
Abbildung䊏1 zeigt einige synthetisierte Ad dukt standards.
Unseres Wissens sind wir die einzige Arbeitsgruppe, die das Postlabelling und die Massenspektrometrie kombiniert einsetzt. Es gelang uns, 32P-markierte Addukte aus den Dünnschichtplatten zu eluieren, zu dephosphorylieren und mas-senspektrometrisch zu identifizieren. So 䊏2 Beziehung zwischen der Bildung von DNA-Addukten und der Induktion von Mutationen in V79-Zellen durch 18 aromatische Verbindungen (1-17, Metaboliten von PAK; Neoglucobrassicin, Sekundärmetabolit aus BrassicaPflanzen). Die Zellen wurden für 2 h mit verschiedenen Kon zentrationen der Substanzen behandelt. Nach weiteren 24 h wurden Zellen für die Addukt -analyse geerntet. Mutationen im HPRT-Gen wurden durch Selektion mit 6-Thioguanin erfasst.
Abszisse und Ordinate stellen die Steigung der KonzentrationsWirkungskurve dar. Die Abbil -dung zeigt, dass sich aus der Häufigkeit der Addukte die mutagene Wirkung weitgehend vorhersagen lässt. Die Struktur hat nur einen geringen Einfluss innerhalb der untersuchten Substanzgruppe (eher große aromatische Verbindungen).
Analysis of macromolecular adducts We continued using 32P-postlabeling for the detection of DNA adducts, which allows detection of many differ-ent adducts, including those of unknown structure. This method enabled us to show that the consump-tion of Brassicavegetables by rats and mice leads to the formation of charac-teristic DNA damage. We detected the same adducts in humans in accessible tissues (buccal mucosa and blood). In addition, we established mass-spectro-metric methods for the analysis of DNA adducts. DNA was digested to nucleo-sides, which were separated by ultra-per formance liquid chromatography.
Occasionally the adduct levels gener-ated in vitrowere sufficient to obtain full mass spectra, providing information on the adduct structure. Otherwise the analytical sensitivity could be drastically enhanced by recording specific mass transitions (MS/MS). Furthermore, we chemically prepared putative adducts (examples in Fig.䊏1) and verified their structure by nuclear magnetic reso-nance (NMR). These standards were also synthesized with stable-isotope labels to be used as internal standards.
Hence, we succeeded in detecting even very low adduct levels (10 adducts per cell) with high specificity and accuracy.
To the best of our knowledge, we are the only research group to combine postlabeling and mass spectrometry for DNA adduct analysis. We eluted
32P-labeled adducts from thin-layer plates, then dephosphorylated and identified them by using mass spec-trometry. Thus, we unambiguously demonstrated that the adducts detected in rodents fed with broccoli are caused by neoglucobrassicin (nGBS), a secondary metabolite of Brassica 䊏2 Relationship between the formation of DNA adducts and the induction of muta tions in V79 cells by 18 aromatic com -pounds (1-17, metabolites of PAHs; nGBS, secondary metabolite of Brassicaplants).
Cells were exposed to the compounds for 2 h at several different concentrations.
After additional 24 h, cell samples were harvested for adduct analyses. Mutations in the HPRTgene were detected by selection with 6-thioguanine. Abscissa and ordinate represent the slopes of the concentration–
response curves. The figure demonstrates that the mutagenic effect can be predicted from the level of the adducts, whereas their structure (all generated by relatively large aromatic molecules) has only a minor influence.
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plants. nGBS also formed adducts with albumin, which were detected after digestion to amino acids. Again, we syn-thesized stable-isotope labeled amino acid adducts as internal standards for the analysis.
Relationships of adduct formation with specific components of the biotransformation system
As a carcinogen, the mycotoxin afla-toxin B1is 1000 times more potent in rats than in mice. Such species-depen-dent differences in carcinogenicity are not uncommon and are primarily due to differences in biotransformation.
Therefore, we investigated the activa-tion of nGBS. The first activaactiva-tion step involves hydrolysis. With the consump-tion of raw or briefly heated vegetables, nGBS is catalyzed by plant myrosinase in the upper gastrointestinal tract, fol-lowed by adduct formation in many tis-sues, with particularly high levels occurring in the small intestine, liver, and kidney but few adducts in the large intestine. When animals are fed veg-etables cooked for a relatively long time or given purified nGBS, activation is by glycosidases synthesized by intestinal bacteria. In this case, DNA adduct for-mation is essentially restricted to the large bowel, in which activation takes place. As demonstrated in cooperation with the Department of Gastro -intestinal Microbiology, nGBS did not form any adducts in germ-free animals.
Moreover, we found that total micro-biota from human fecal samples strongly differ in their ability to toxify nGBS. The situation is further compli-cated because one of the first active metabolites, an isothiocyanate, is directly formed by myrosinase or bac-terial glycosidases. It is spontaneously hydrolyzed to an inactive carbinol, which subsequently is converted to a more potent inducer of adducts by sul-fotransferases (SULTs) of the host. The resulting sulfate induces the same adducts as the isothiocyanate. Human SULT1A1,expressed in many epithelial cells, and SULT1C2,expressed in fetal tis-sues, mediated this activation with particular efficiency. Indeed, nGBS and its carbinol induced strongly elevated levels of adducts in various tissues of mice transgenic for human SULT1A1/
1A2, constructed in our laboratory.
1-Methylpyrene is a polycyclic aro-matic hydrocarbon (PAH) that occurs in
konnten wir eindeutig belegen, dass die Addukte, die nach Füttern von Brokkoli in Mäusen und Ratten mit der Postlabelling-Methode entdeckt wurden, durch einen natürlichen Inhaltsstoff von Brassica-Pflanzen, das Neoglucobrassicin, indu-ziert werden. Diese Substanz bildet auch Addukte mit Serumalbumin, die wir nach dem Verdau des Proteins zu Aminosäuren massenspektrometrisch erfassen konn-ten. Auch hierzu haben wir mit stabilen Isotopen markierte interne Standards synthetisiert.
Adduktbildung in Abhängigkeit von spezifischen Komponenten des Biotransformationssystems
Chimgee Baasanjav-Gerber, Nadiya Bakhiya, Carolin Bendadani, Ronny Kollock, Kathleen Lehmann, Walter Meinl, Korinna Wend
Aflatoxin B1, ein Gift aus Schimmelpilzen, ist in Ratten 1000-mal stärker kanzerogen als in Mäusen. Große Spezies-abhängige Unterschiede in der Wirkung von chemi-schen Kanzerogenen sind eher die Regel als die Ausnahme. Wichtigste Ursache sind Unterschiede in der Bildung und Inaktivierung der aktiven Metaboliten.
Deswegen untersuchten wir die Aktivie -rung von Neoglucobrassicin. Der erste Aktivierungsschritt ist eine Hydrolyse.
Diese erfolgt durch eine pflanzliche Myrosinase, wenn Neoglucobrassicin aus rohen oder nur kurz erhitzten Brassica-Gemüsen aufgenommen wird, oder durch von Darmbakterien synthetisierte Glykosidasen, wenn lange gekochtes Gemüse konsumiert oder gereinigtes Neoglucobrassicin an Tiere verabreicht wird. Im ersten Fall wird Neoglucobras sicin bereits im oberen Gastrointestinaltrakt aktiviert und es treten DNA-Schäden in vielen Geweben auf – besonders viele in Dünndarm, Leber und Niere, nur wenige im Dickdarm. Im zweiten Fall erfolgt die Aktivierung erst im Dickdarm, auf den dann die DNA-Schädigung weitgehend begrenzt ist. In keimfreien Tieren blieben die DNA-Schäden aus, wie wir in Ko -operation mit der Abteilung Gastro -intestinale Mikrobiologie zeigen konnten.
Zudem fanden wir, dass Mikrobiota aus verschiedenen humanen Fäzesproben sich sehr stark in ihrer Fähigkeit unter-scheiden, Neoglucobrassicin zu toxifizie-ren. Die Situation wird noch dadurch ver-kompliziert, dass ein erster aktiver Metabolit, ein Isothiocyanat, direkt durch die Myrosinase oder bakterielle Glyko -sidasen gebildet wird. Dieser hydrolysiert spontan zum inaktiven Carbinol, welches
aber durch Sulfotransferasen des Wirtes erneut aktiviert werden kann. Das resul-tierende Sulfat bildet die gleichen DNA-Addukte wie das Isothiocyanat, jedoch in viel stärkerem Ausmaße. Eine beson-ders effiziente Toxifizierung fanden wir mit zwei humanen Sulfotransferasen:
SULT1A1, die in vielen epithelialen Zellen stark exprimiert wird, und SULT1C2, die vor allem im Fötus vorkommt. In einem von uns entwickelten transgenen Maus -modell mit humaner SULT1A1 bildeten Neoglucobrassicin und sein Carbinol besonders viele DNA-Addukte.
1-Methylpyren ist ein polyzyklischer aromatischer Kohlenwasserstoff (PAK), der im Zigarettenrauch in größerer Menge vorkommt als die Referenzverbin -dung Benzo[a]pyren. Es wurde auch in vielen Lebensmitteln (z. B. in nativem Olivenöl, Muscheln und geräuchertem Fleisch) gefunden. Es ist kanzerogen, obwohl es aus strukturellen Gründen nicht zu Diol-Epoxiden, den klassischen aktiven Metaboliten von PAK, aktiviert werden kann. Wir konnten DNA-Addukte des 1-Methylpyrens im Blut von Rauchern nachweisen und damit zum ersten Mal einen Aktivierungsweg für einen PAK im Menschen belegen, der eine benzylische Hydroxylierung und Sulfatierung bein-haltet. Diese Aktivierung untersuchten wir in Tiermodellen genauer. In Mäusen, in denen wir das SULT1A1-Gen gentech-nisch ausgeschaltet hatten, war die Adduktbildung klar vermindert; in trans-genen Mäusen mit humaner SULT1A1 war sie erhöht, in der Niere bis zu 100-fach. Wir zeigten, dass der aktive Metabolit die Niere über die Blutzirkulation erreicht. Da er geladen ist, kann er die Membranen der Zellen, in denen er gebildet wird (u. a. in Hepatozyten) und durch die er ausge-schieden wird (vor allem in der Niere) nur mit Hilfe von Membrantransportern pas-sieren. Dies konnten wir nachweisen, indem wir Ratten gleichzeitig Probenecid – ein Medikament, das Anionen-Trans -porter hemmt und zur Behandlung von Gicht verwendet wird – und 1Hydroxy -methylpyren verabreichten. In Folge des blockierten Membrantransports kam es zu einer drastischen Verschiebung der Addukt bildung. In der Leber nahm sie um den Faktor 23 zu, in der Niere nahm sie ab.
In Zellkulturexperimenten konnten wir zudem zeigen, dass Membrantransporter auch andere gentoxische Stoffe transpor-tieren und dadurch ihre Wirkung beein-flussen können.
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Verknüpfung der Adduktbildung mit Mutagenese und Kanzerogenese Simone Florian, Walter Meinl, Anke Schnapper, Sophie Schumann
Wie bereits erwähnt kann Neogluco -brassicin zu verschiedenen reaktiven Metaboliten aktiviert werden. Im HPRT (HypoxanthinPhosphoribosylTrans -ferase)-Genmutationstest in V79-Zellen (Hamsterzellen) zeigte es keine bis sehr starke mutagene Wirkungen in Abhän gig keit von den vorhandenen Enzym syste -men. Völlig parallel dazu verhielt sich die Adduktbildung, was nahe legt, dass die erfassten Addukte tatsächlich die Mutationen verursachten. Wir fanden überdies, dass die von Neoglucobrassicin induzierten DNA-Addukte in diesem Modell ein ähnliches mutagenes Poten tial aufweisen wie Addukte von polyzykli-schen aromatipolyzykli-schen Kohlenwasser stof -fen (PAK) (Abb.䊏2). Wesentlich war aber, dass nur die persistenten Addukte be rück-sichtigt wurden, also jene, die nach zwei Zellreplikationen noch vorhanden waren.
PhIP ist ein Kanzerogen, das beim Braten von Fleisch und Fisch entsteht.
In der Ratte induziert es Dickdarm-, Mamma- und Prostatatumoren, in der Maus Lymphome und Tumoren des Dünndarms. Wir hatten früher mit trans-genen Mäusen gezeigt, dass die humane
SULT1A1 die DNA-Adduktbildung durch PhIP verstärkt, besonders ausgeprägt in Leber und Lunge. Wir fanden nun, dass PhIP in diesen Mäusen sehr schnell Lungentumoren induziert (Abb.䊏3). In Wildtyp-Mäusen wurden solche Tumoren nicht induziert. Der Befund veranschau-licht direkt, dass das fremdstoffmetaboli-sierende System nicht nur die Stärke der kanzerogenen Wirkung einer Substanz, sondern auch die Zielorgane beeinflusst.
p53ist ein Tumorsuppressorgen, das in vielen Tumoren des Menschen mutiert ist.
Verschiedene Mutagene unterscheiden sich in den Sequenzänderungen, die sie bevorzugt induzieren. Monica Hollstein vom Deutschen Krebsforschungszen -trum stellte uns Fibroblasten von Mäusen zur Verfügung, in denen wesentliche Teile des eigenen p53-Gens durch humane Sequenzen ersetzt wurden. Diese Zellen sind nur begrenzt teilungsfähig, können aber durch Mutagene immortalisiert werden. Häufig ist in immortalen Klonen das p53-Gen mutiert. Wir erweiterten die Nutzbarkeit dieses Modells durch tran-siente Expression spezifischer Mutagen-aktivierender Enzyme. So gelang es uns, Zellen mit Neoglucobrassicin, 1Methyl -pyren oder PhIP (oder ihren proximalen Mutagenen) zu immortalisieren und durch Sequenzieren p53-Mutationen zu erfassen. Abbildung䊏4 zeigt ein Zwi -䊏3 Gewebeschnitt durch einen nach Gabe von PhIP entstandenen Lungentumor in einer trans -genen Maus, welche die humane SULT1A1/1A2exprimiert. Von 33 transgenen Tieren, die für 18 Wochen PhIP im Futter erhalten hatten, wiesen 22 einen oder mehrere Lungentumoren auf.
Diese Tumoren traten weder in Wildtyp-Mäusen mit PhIP-haltigem Futter noch in transgenen Mäusen mit Kontrollfutter auf.
cigarette smoke at higher levels than the reference PAH benzo[a]pyrene. It has also been detected in many foods (e.g., native olive oil, mussels, and smoked ham). It is carcinogenic, although it cannot be metabolized to a diol-epoxide, the classical carcinogenic metabolites of PAHs. We demonstrated the presence of 1-methylpyrene DNA adducts in lymphocytes of smokers.
This is the first documentation of an activation of a PAH involving benzylic hydroxylation and sulfation in humans.
We studied this activation in more detail in rodent models. Adduct forma-tion was clearly reduced in knockout mice for the murine SULT1A1, but increased in transgenic mice for human SULT1A1(up to 100-fold in kidney). We demonstrated that the active meta -bolite reaches the kidney via the blood-stream. Since it is charged, it only can penetrate membranes with the help of transporter proteins. Concurrent administration of probenecid, an unspecific inhibitor of organic anion transporters used to treat gout, with 1-hydroxymethylpyrene drastically altered the distribution of the adducts.
The level increased 23-fold in liver, but decreased in kidney. We showed in cell cultures that membrane transporters import and/or export various other genotoxicants and may thereby influ-ence their effects.
Relationships between adduct formation, mutagenesis and carcinogenesis
The nGBS can be activated to different reactive metabolites. Its activity in the HPRTgene mutation assay in V79 cells ranged from none to very high, depending on the enzyme systems present. The mutagenicity correlated with the level of adducts detected, so the mutations were caused by these adducts. We demonstrated that the mutagenic potential of the nGBS adducts in this model was similar to that of reactive metabolites of PAHs (Fig.䊏2), when only persistent adducts 䊏3 Lung tumor in a PhIP-treated mouse transgenic for human SULT1A1/1A2.
Twenty-two out of 33 transgenic mice developed one or multiple lung tumors after receiving PhIP in feed for 18 weeks.
These tumors were completely absent in wild-type mice receiving PhIP-containing feed as well as in transgenic mice receiving control feed.
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were taken into account (still present after two cell divisions).
PhIP is a carcinogen formed by frying meat and fish. It induces colon, mam-mary, and prostate tumors in rats, and lymphomas and small intestinal tumors in mice. Using transgenic mice, we had demonstrated that human SULT1A1 strongly enhances DNA adduct formation, with the strongest effect in liver and lung. PhIP rapidly induces pulmonary tumors in trans-genic (Fig.䊏3) but not wild-type mice.
This shows that the xenobiotics-metabolizing system may not only affect the potency of a chemical car-cinogen, but also the range of target organs.
The tumor suppressor gene p53 is mutated in nearly 30 % of all human tumors. Mutagens vary in the muta-tions they induce. Monica Hollstein (German Cancer Research Center) pro-vided embryonic fibroblasts from mice with humanized p53genes. These cells have a limited proliferation capacity, but can be immortalized by mutagens, p53 being mutated in many immortal clones. We expanded this model by transient expression of specific muta-gen-activating enzymes, immortalizing cells with nGBS, 1-methylpyrene, and PhIP (or their proximate mutagens).
Pre liminary results for PhIP are seen in Figure䊏4: a GC→CG transversion was detected in codon 135 in four inde-pendent immortalized clones. This mutation accounts for nearly 0.1 % of the p53mutations recorded in human tumors (e.g., in liver, lung, breast, colon). Its relatively low incidence may reflect the low exposure to PhIP. Other
Pre liminary results for PhIP are seen in Figure䊏4: a GC→CG transversion was detected in codon 135 in four inde-pendent immortalized clones. This mutation accounts for nearly 0.1 % of the p53mutations recorded in human tumors (e.g., in liver, lung, breast, colon). Its relatively low incidence may reflect the low exposure to PhIP. Other