Geschlechts- und altersabhängige Veränderungen des Leptinsystems und der Gewichtsentwicklung in einem für Chorea Huntington transgenen Rattenmodell

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Aus dem Institut für

Funktionelle und Angewandte Anatomie (Leitung: Prof. Dr. med. Reinhard Pabst) der Medizinischen Hochschule Hannover

Geschlechts- und altersabhängige Veränderungen

des Leptinsystems und der Gewichtsentwicklung in einem für Chorea Huntington transgenen Rattenmodell

Dissertation

zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover

vorgelegt von Thomas Gerding

aus Hannover

Düsseldorf im März 2010

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Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 02.03.2010

Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover Präsident: Prof. Dr. Dieter Bitter-Suermann

Betreuer: Prof. Dr. med. Heike Nave

Referent: Prof. Dr. med. Dr. rer. nat. Andreas Schmiedel Korreferent: PD Dr. med. Dirk Breitmeier

Tag der mündlichen Prüfung: 02.03.2010 Promotionsausschussmitglieder:

Prof. Dr. Ernst Ungewickell Prof. Dr. Johannes Gessner Prof. Dr. Roland Jacobs

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Inhaltsverzeichnis 1

1 Einleitung ... 3

1.1 Chorea Huntington ... 3

1.1.1 Historischer Überblick ... 3

1.1.2 Epidemiologie, Genetik und Todesursachen ... 3

1.1.3 Klinische Symptomatik ... 5

1.1.4 Neuropathologie ... 5

1.1.5 Diagnostische Methoden ... 6

1.1.6 Therapie ... 6

1.2 Leptin ... 7

1.2.1 Wirkung auf die Energiehomöostase des Körpers ... 7

1.3 Chorea Huntington und Energiehomöostase ... 10

1.3.1 Gestörte Gewichtsregulation ... 10

1.3.2 Ursachen für Gewichtsverlust ... 10

1.4 Zielsetzung ... 12

2 Material und Methoden ... 13

2.1 Versuchstiere und Haltung ... 13

2.2 Gewichtskontrolle ... 14

2.3 Organgewinnung ... 14

2.4 Immunhistologie ... 15

2.5 Histologische Auswertung ... 15

2.6 Statistische Auswertung ... 16

2.7 MRT Fettquantifizierung ... 17

2.8 MRT Auswertung ... 17

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Inhaltsverzeichnis 2

3 Ergebnisse ... 18

3.1 Futteraufnahme ... 18

3.2 Gewichtsentwicklung ... 20

3.3 MRT Fettquantifizierung ... 22

3.4 Quantitative Auswertung der mittleren Dichte der Leptinexpression ... 24

im Leberschnitt 3.4.1 Wildtyp-Ratten jung vs. alt ... 24

3.4.2 HDtg-Ratten jung vs. alt ... 25

3.4.3 Wildtyp-Ratten männlich vs. weiblich ... 26

3.4.4 HDtg-Ratten männlich vs. weilblich ... 27

3.4.5 Jungtiere Wildtyp vs. HDtg-Ratten ... 28

3.4.6 Alttiere Wildtyp vs. HDtg-Ratten ... 29

3.4.7 Immunhistologische Fotografien der Leptinexpression in der Leber ... 30

3.5 Quantitative Auswertung der Ob-Rezeptor exprimierenden Zellen ... 31

in der Leber 3.5.1 Wildtyp-Ratten jung vs. alt ... 31

3.5.2 HDtg-Ratten jung vs. alt ... 32

3.5.3 Wildtyp-Ratten männlich vs. weiblich ... 33

3.5.4 HDtg-Ratten männlich vs. weiblich ... 34

3.5.5 Jungtiere Wildtyp vs. HDtg-Ratten ... 35

3.5.6 Alttiere Wildtyp vs. HDtg-Ratten ... 36

3.5.7 Immunhistologische Fotografie der Ob-Rezeptor ... 37

exprimierenden Zellen in der Leber 4 Diskussion ... 38

5 Zusammenfassung ... 46

6 Abkürzungsverzeichnis ... 48

7 Literaturverzeichnis ... 49

8 Lebenslauf ... 61

9 Erklärung ... 62

10 Danksagung ... 63

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Einleitung 3

1 Einleitung

1.1 Chorea Huntington

1.1.1 Historischer Überblick

Bereits im 16. Jahrhundert benutzte der Alchimist Paracelsus (1493-1541) den Begriff „Cho- rea“ (griech. „choreia“, Tanz), um die für Chorea Huntington (Huntington Disease; HD) symptomatischen tanzartigen und unkoordinierten Bewegungen zu beschreiben. Ein Jahrhun- dert später beschrieb der englische Arzt Thomas Sydenham die von ihm benannte „Chorea Minor“. Hierbei handelt es sich allerdings um eine Komplikation des rheumatischen Fiebers und nicht um eine angeborene, vererbte Krankheit wie bei der HD. Die in der folgenden Ar- beit im Zentrum stehende erbliche Form der HD wurde erst 1872 durch George Huntingtons Veröffentlichung „On Chorea“ im „Medical and Surgical Reporter“ bekannt (Hunting- ton, 1872). Er vermutete als Erster, die HD sei eine eigene Krankheitsentität. Als Haupt- merkmale beschrieb er die Vererbung, die Neigung zu Geisteskrankheit und zum Suizid sowie die Manifestation im Erwachsenenalter. Der Gendefekt, der zur HD führt, wurde 1983 auf dem kurzen Arm des Chromosoms 4 beim Menschen lokalisiert. Erst 1993 konnte das bei der HD veränderte Huntingtin-Gen isoliert werden (Huntington’s Disease Collaborative Research Group, 1993).

1.1.2 Epidemiologie, Genetik und Todesursachen

HD ist eine mit vollständiger Penetranz autosomal dominant vererbte, chronisch neurodegenerative Erkrankung. Neumutationen sind äußerst selten. Bei maximal 3 % der Patienten mit einer gesicherten HD liegt eine Neumutation vor. HD betrifft Männer wie auch Frauen glei- chermaßen und bricht meistens im mittleren Alter zwischen 35 und 40 Jahren aus (Ridley et al., 1991). Nur 4,5 % der HD-Patienten erkranken vor ihrem 20. Lebensjahr. Nach dem 60. Lebensjahr erkranken 8 % (Walker et al., 1981). Die Prävalenz der HD liegt bei Mitteleu- ropäern bei 40-80 Betroffenen pro 1 Mio. Einwohner. Ausnahmen mit einer niedrigeren Inzi- denz stellen Japaner (4:1 Mio.), Finnen (5:1 Mio.) und Afrikaner (6:1 Mio.) dar (Har- per, 1992).

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Einleitung 4

Pathogenetisch ist eine Mutation des IT-15-Gens mit einer verlängerten Cytosin-Adenosin- Guanin (CAG)-Trinukleotid-Sequenz identifiziert worden. Das Gen befindet sich auf dem kurzen Arm von Chromosom 4 (4p16.3) und kodiert für ein Protein-Produkt namens Hunting- tin. Exprimiert wird es sowohl im Zentralnervensystem (ZNS) als auch im restlichen Körper (Sharp et al., 1995; Luthi-Carter et al., 2002). Das (CAG)_n-Repeat des Huntingtin-Gens kodiert für die Aminosäure „Glutamin“, so dass man bei der HD auch von einer Polyglutami- nerkrankung spricht. Das Protein Huntingtin findet man in intranukleären Aggregaten zu- sammen mit z.B. Hitzeschockproteinen und Ubiquitin in striatalen Neuronen von HD- Patienten. Entscheidend für die Manifestation eines HD-Phänotyps ist das Vorhandensein von n > 37 CAG-Repeats, was eine höhere Repeatzahl bei HD-Patienten im Vergleich zur Nor- malbevölkerung darstellt (Harper et al., 1996). Nachgewiesen ist, dass steigende Repeatzahlen mit einem früheren Erkrankungsbeginn korrelieren. Telenius et al. (1993) stellten in ihrer Un- tersuchung bei Patienten mit juveniler HD (Erkrankungsbeginn < 20 Jahre) CAG-Repeat- Zahlen von bis zu 120 fest. Zur Frage, ob eine höhere Anzahl an CAG-Repeat-Sequenzen einen schwereren Krankheitsverlauf zur Folge hat, gibt es widersprüchliche Ergebnisse. Eini- ge Studien stellen einen Zusammenhang fest (Currier et al., 1982; van Dijk et al., 1986;

Myers et al., 1991; Illarioshkin et al., 1994; Brandt et al., 1996; Jason et al., 1997; Penney et al., 1997; Foroud et al., 1999), andere nicht (Kieburtz et al., 1994; Feigin et al., 1995; Siesling et al., 1998; Marder et al., 2000). Ebenfalls keine eindeutige Korrelation in Bezug auf die Re- peatanzahl fand man bei anderen Merkmalen der HD, wie neurologischen bzw. psychiatri- schen Symptomen oder auch neuropathologischen Befunden (zur Übersicht siehe Harper et al., 1996).

Häufigste Todesursachen bei HD-Patienten stellen Pneumonien (42 %), kardiovaskuläre Ereignisse (33 %) und Suizid (6 %) dar (Haines und Conneally, 1986). Die HD scheint von selbst nicht tödlich zu sein, jedoch führt die von der Krankheit verursachte Kombination von Immobilität, Auszehrung und Aspirationsneigung zu einer höheren Anfälligkeit für Infektio- nen und damit zum Tod (Harper, 1996). Die Überlebenszeit, gemessen vom Krankheitsbe- ginn, beträgt etwa 10-17 Jahre. Das Todesalter liegt zwischen 51 und 57 Jahren (Har- per, 1996). Zurzeit ist keine kurative Therapie der stets letal verlaufenden Krankheit bekannt.

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Einleitung 5

1.1.3 Klinische Symptomatik

Die Hauptsymptome der HD lassen sich mit der „klassischen“ Trias aus Bewegungsstörung (choreatische, unfreiwillige, hyperkinetische Bewegungen), organischer Wesensänderung (psychiatrische Auffälligkeiten wie Depressionen und Schizophrenie) und kognitiven Leis- tungseinbußen (Demenz) beschreiben (Garron, 1973; Antal et al., 2003). Auffälligstes und häufigstes Merkmal der HD ist sicherlich die choreatiforme Bewegungsstörung, die der Krankheit ihren Namen gab. Die World Federation of Neurology beschreibt die Chorea als exzessive, spontane, völlig zufällig einsetzende und stoppende Bewegung, deren Ausmaß von verstärktem Gestikulieren bis hin zu schleudernden Bewegungen reichen kann (Barbeau et al., 1981). Dabei sind die Bewegungen immer subjektiv ungewollt. Im frühen Stadium der Krankheit sind die choreatiformen Bewegungen oft noch willkürlich zu unterdrücken und imponieren häufig nur als betonte Gesten bzw. werden durch willkürliche Bewegungen als Gesten kaschiert (Parakinese). Üblicherweise betreffen die choreatischen Bewegungen den ganzen Körper, was an Armen und Händen zu Feinmotorikstörungen und Ungeschicklichkeit führt. An der unteren Extremität ist der tänzelnde, unsichere Gang die Folge. Die Bewegungs- störung kann jedoch auch völlig fehlen und muss nicht schon zu Beginn der Krankheit vor- handen sein (Harper, 1996). Meistens gehen emotionale Störungen und psychiatrische We- sensänderungen diesen Krankheitszeichen um Jahre voraus (Weindl et al., 1996). Ferner ist der diagnostische Wert der choreatiformen Bewegungen durch das Vorkommen bei diversen anderen Erkrankungen gemindert.

Während die choreatischen Bewegungen gegen Mitte der Krankheit ein Plateau erreichen (Folstein et al., 1983), nimmt die Einschränkung der willkürlichen Bewegungen mit der Zeit zu (Penney et al., 1990). Im späteren Krankheitsverlauf gehen die choreatiformen Bewegun- gen zurück und weichen sogar einer Hypokinese oder einem Rigor.

1.1.4 Neuropathologie

Bei Patienten mit HD findet sich neuropathologisch eine Degeneration von Nervenzellen im ZNS, ganz überwiegend in den Basalganglien Corpus caudatum, Nucleus subthalamicus und Putamen. Im fortgeschrittenen Stadium der Krankheit zeigt sich meist eine frontal betonte kortikale Atrophie (Martin und Gusella, 1986). Makroskopisch imponiert dies durch eine Verbreiterung der Sulci, einer Verkleinerung der Gyri und einer Reduktion der Gesamtge-

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Einleitung 6

hirnmasse. Welcher Mechanismus die selektive und progressive Zelldestruktion verursacht und aufrechterhält ist bisher unklar und Gegenstand momentaner Forschungsprojekte.

1.1.5 Diagnostische Methoden

Traditionell wurde die Diagnose einer HD klinisch durch eine positive Familienanamnese, progrediente Störungen der willkürlichen und unwillkürlichen Motorik und/oder durch psychiatrische Auffälligkeiten gestellt. Mit Hilfe der Computertomographie (CT) lassen sich heute jedoch zusätzlich die Basalganglienatrophien darstellen. Des Weiteren kann durch Positro- nen-Emissions-Tomographie ein reduzierter Glukose-Stoffwechsel im Nukleus caudatus sich- tbar gemacht werden, bevor ein Zellverlust im CT oder in der Magnetresonanztomographie (MRT) nachzuweisen ist (Kuwert et al., 1989). Trotz dieser Kriterien belaufen sich sowohl falsch-positive als auch falsch-negative Fehldiagnosen auf etwa 10 %. Einen definitiven Aus- schluss oder Nachweis der HD bietet selbst im Frühstadium die DNA-Analyse. Eine CAG- Repeat-Anzahl von mehr als 38 Einheiten im Huntingtin-Gen ist beweisend für die Erkran- kung (von Hörsten et al., 2003).

1.1.6 Therapie

Bis heute steht weder eine ursächliche Therapie zur Verfügung, noch lässt sich der Krank- heitsverlauf beeinflussen. Um die Lebensqualität der HD-Patienten zu verbessern, wird ver- sucht, durch verschiedene Therapieansätze die Symptome der Krankheit zu mildern. Zur Mo- bilitätserhaltung kommen schon in frühen Krankheitsstadien nichtmedikamentöse Maßnah- men wie Krankengymnastik oder Ergotherapie zum Einsatz. Auch die psychosoziale Betreu- ung der Patienten ist ein wichtiger Teil der Therapie. Der Tendenz zu Kachexie, deren Ursa- che bisher nicht bekannt ist, sollte mit einer hochkalorischen Ernährung begegnet werden. Ist der Patient durch die Symptomatik jedoch stark behindert, sollte mit der pharmakologischen Therapie begonnen werden. Je nach Beschwerden werden Medikamente, die sich gegen Cho- rea, Rigor, Depression oder Psychose richten, eingesetzt (Tyler et al., 1998).

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Einleitung 7

1.2 Leptin

Seit 1994 das Hormon Leptin entdeckt wurde (Zhang et al., 1994), ist ein sehr viel detaillier- teres Verständnis der Regulation der Energiehomöostase möglich. Leptin (griech. Λεπτοσ,

„leptos“, dünn) ist ein 167-Aminosäurepeptid, welches vom obese-Gen (ob-Gen) kodiert wird. Produziert wird es hauptsächlich von Adipozyten des weißen Fettgewebes (MacDou- gald et al., 1995). Es gibt eine positive Korrelation zwischen der Leptin mRNS und dem Pro- teinanteil in Adipozyten sowie dem im Organismus zirkulierenden Leptin (Frederich et al., 1995; Maffei et al., 1995; Considine et al., 1996). Leptin beeinflusst im Gehirn die Ener- giebalance des Körpers. Dabei interagiert das Hormon mit speziellen Leptin-Rezeptoren von denen 6 Isoformen (Ob-Ra-f) bekannt sind (Tartaglia et al., 1995; Lee et al., 1996; Wang et al., 1998). Neben der langen Ob-Rb-Form gibt es kurze Formen, die sich in dem intrazellulä- ren Carboxy-Terminus (Ob-Ra, c, d, f) unterscheiden. Bei Ob-Re fehlt die transmembranäre Domäne und der intrazelluläre Terminus. Daher zirkuliert diese Rezeptorform frei im Blut (Brabant et al., 2005). Sezerniert in das Blut wirkt Leptin über die Interaktion mit der langen Form des Leptin-Rezeptors (Ob-Rb) in den Nuclei arcuati, ventromedialis, dorsomedialis und lateralis des Hypothalamus über einen negativen Feedback-Mechanismus regulierend auf das Körpergewicht und die Nahrungsaufnahme (Campfield et al., 1995; Considine et al., 1996).

Außerdem ist ein aktivierender Effekt auf Neuronenschaltkreise, die für das Essverhalten und den Energiehaushalt zuständig sind, festzustellen (Elmquist et al., 1997; Elmquist et al., 1998). Leptin-Rezeptoren finden sich jedoch nicht nur im Gehirn. Auch in peripheren Geweben wie Leber, Lunge, Niere und Gonaden werden die Rezeptoren Ob-Ra und Ob-Rb exprimiert (Bjorbaek et al., 1998; Elmquist et al., 1998, Brabant et al., 2004).

1.2.1 Wirkung auf die Energiehomöostase des Körpers

Mutationen im ob-Gen von homozygoten ob/ob-Mäusen haben ein früheres Auftreten von Adipositas zur Folge als es bei gesunden Wildtypen, die ebenfalls mit einer hochkalorischen Diät gefüttert werden, vorkommt (Zhang et al., 1994; Campfield et al., 1995; Halaas et al., 1995; Pelleymounter et al., 1995). Durch diese Punktmutation im ob-Gen unterbleibt die Bildung von Leptin in den Adipozyten (Zhang et al., 1994). Folglich weisen adipöse ob/ob- Mäuse ein Leptin-Defizit auf, haben eine gesteigerte Nahrungsaufnahme, sind hypothermisch und durch verschiedene metabolische und neuroendokrine Störungen gekennzeichnet. Sowohl ihre körperliche Arbeit als auch ihr Grundumsatz sind herabgesetzt (Friedmann und Lei-

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Einleitung 8

bel, 1992; Pelleymounter et al., 1995). Versuche zeigen zusätzlich, dass die intraperitoneale (Halaas et al., 1995; Pelleymounter et al., 1995; Weigle et al., 1995) und in stärkerem Aus- maß die direkte intrazerebroventrikuläre (Campfield et al., 1995) Applikation von rekombi- nanten Leptin zu einer verminderten Nahrungsaufnahme, einer Gewichtsabnahme und zur Zunahme des Grundumsatzes, der Körpertemperatur und der Aktivität führen. Auffällig ist, dass der resultierende Gewichtsverlust nur auf das Fettgewebe beschränkt ist, wohingegen beim Hungern, wenn der Leptinspiegel niedrig ist (Frederich et al., 1995; Ahima et al., 1996), ebenfalls Muskelmasse abgebaut wird (Halaas et al., 1998). Zusätzlich stimuliert Leptin in Ratten die Apoptose von Fettzellen (Quian et al., 1997).

Interessanterweise ist festzustellen, dass Adipositas häufig mit hohen Leptinspiegeln einher- geht (Ahima und Flier, 2000). Diese Hyperleptinämie stellt einen Hinweis für eine Leptinre- sistenz dar und könnte als Kompensationseffekt bei der Entstehung von Adipositas eine Rolle spielen (Spiegelmann und Flier, 1996; Friedmann und Halaas, 1998). Mehrere Arbeitsgrup- pen forschten an db/db-Mäusen, die einen defekten Leptin-Rezeptor mit einer verkürzten zy- toplasmatischen Region aufweisen. Durch diesen Defekt ist eine Signaltransduktion unmög- lich (Chen et al., 1996; Chua et al., 1996; Lee et al., 1996). Die ausbleibende Gewichtsreduk- tion nach Leptininjektion wurde bei diesen Mäusen als die Folge des Leptinrezeptordefekts festgestellt (Campfield et al., 1995; Halaas et al., 1995; Pelleymounter et al., 1995). Des Wei- teren wurde entdeckt, dass mutierte Leptin-Rezeptoren in Nagern eine frühe Adipositas zur Folge haben (Chua et al., 1996; Takaya et al., 1996; White et al., 1997). Neben der Leptinu- nempfindlichkeit wurden als Ursache Hyperphagie, ein gestörter Stoffwechsel, gestörte neuroendokrine Funktionen wie eine Überproduktion von Kortison und ein hypothalamischer Hypogonadismus diagnostiziert (Bray und York, 1979; Campfield et al., 1995; Pelleymounter et al., 1995). Bislang ist nicht geklärt, ob die Leptinresistenz beim Menschen auch durch Stö- rungen der dem Leptin-Rezeptor nachgeschalteten intrazellulären Signaltransduktion oder möglicherweise durch Leptinantagonisten bedingt ist.

Nach der Entdeckung von Leptin sprach man zuerst von einem Anti-Adipositas-Hormon, jedoch wurde diese einseitige Sichtweise in den folgenden Jahren durch ein komplexeres Bild ersetzt. Leptin spielt nicht nur eine Rolle bei der Regulation des Stoffwechsels, sondern auch bei neuroendokrinen Funktionen und Immunfunktionen (Lord et al., 1998; Matarese et al., 2002). In dieser Arbeit soll der Schwerpunkt auf der Untersuchung der gewichtsregulierenden Funktion von Leptin liegen.

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Einleitung 9

Leptin zirkuliert frei, aber auch an Proteine gebunden im Blut. Der lösliche Leptin-Rezeptor Ob-Re besitzt eine ähnliche Affinität zu Leptin wie die membrangebundenen Rezeptoren (Liu et al., 1997) und ist für die Leptinbindung im Blut verantwortlich (Lammert et al., 2001). Die Leber übernimmt eine zentrale Rolle bei der Generierung von Ob-Rezeptoren (Brabant et al., 2004, 2005). Eine Studie zeigt, dass in schlanken Personen mehr gebundenes Leptin (~45 %) als bei adipösen Personen (~20 %) zu finden ist (Sinha et al., 1996). Während des Hungerzustandes wird bei gesunden Menschen ein Anstieg der Ob-Re-Konzentration beobachtet, um den Anteil des frei zirkulierenden Leptins mit seiner hemmenden Funktion der Nahrungsaufnahme zu reduzieren (Ahima et al., 1997; Chan et al., 2002). Bei adipösen Pa- tienten ist zwar die Konzentration des freien Leptins höher, jedoch tritt trotzdem keine Ge- wichtsabnahme ein, was auf eine Leptinresistenz bzw. eine Störung des Leptin- Signaltransduktionswegs oder auf ein Absinken des Leptintransports durch die Blut-Hirn- Schranke hinweist (Mantzoros, 1999).

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Einleitung 10

1.3 Chorea Huntington und Energiehomöostase

1.3.1 Gestörte Gewichtsregulation

An HD erkrankte Patienten weisen neben den oben genannten Charakteristika ebenfalls eine Störung der Gewichtsregulation auf. Sie nehmen im Verlauf der Krankheit, besonders im Endstadium, stark an Gewicht ab und werden kachektisch (Bruyn und Went, 1986; Greena- myre und Shoulson, 1994; Sanberg et al., 1981; Farrer und Meaney, 1985; Pratley et al., 2000; Robbins et al., 2006). Der Grund dafür ist bis heute unbekannt (Quarrel und Har- per, 1996). Ein höherer Body-Mass-Index (BMI) hätte ein langsameres Fortschreiten der Krankheit zur Folge, was bei transgenen Mäusen gezeigt werden konnte und auch beim Men- schen der Fall ist (Fain et al., 2001; Popovic et al., 2004). Auch bei HD-Patienten wirkte sich eine kalorienreiche Diät kurzfristig stabilisierend auf ihr Gewicht aus, konnte jedoch die lang- fristige Abnahme nicht verhindern (Trejo et al., 2005). Da der Gewichtsverlust die Patienten anfällig für Infektionen macht und als lebenslimitierender Faktor anzusehen ist, ist Ursachen- forschung der gewichtsregulativen Mechanismen bei HD von besonderer Bedeutung.

1.3.2 Ursachen für Gewichtsverlust

Eine Ursache für den Verlust an Körpergewicht könnte der durch die choreatischen Bewe- gungen resultierende höhere Energieverbrauch sein (Mahant et al., 2003). Doch schon Patien- ten mit neu diagnostizierter HD und wenigen choreatischen Bewegungsstörungen weisen einen niedrigeren BMI als gesunde Menschen auf (Djoussé et al., 2002; Robbins et al., 2006).

Hinzu kommt, dass Patienten einen gesteigerten Appetit und einen höheren Nahrungskonsum angeben und trotz der Steigerung der Kalorienzufuhr an Gewicht verlieren (Farrer und Mea- ney, 1985; Morales et al., 1989). Eine potentielle Malabsorption der zugeführten Nahrung konnte bei ihnen bisher jedoch nicht gefunden werden (Morales et al., 1989).

Nicht geklärt ist auch, ob durch die Gen-Mutation bei HD-Patienten parallel zu den neurode- generativen Prozessen im Hypothalamus und den Basalganglien auch physiologische Regel- mechanismen der Nahrungsaufnahme gestört werden und daraus ein Gewichtsverlust resul- tiert (Kremer und Roos, 1992).

Subjektiv geben die HD-Patienten erst im mittleren bis späten Krankheitsstadium einen Ge- wichtsverlust an (Kirkwood et al., 2001), jedoch wurde festgestellt, dass sie schon zu Beginn

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Einleitung 11

der Erkrankung untergewichtig sind (Myers et al., 1991; Djoussé et al., 2002). Das Gewicht liegt im Vergleich mit Gesunden im Mittel 10 kg niedriger (NHANES III, 1996). Ebenso ver- hält es sich mit der mittleren Gewichtszunahme pro Jahr. Dort liegen die HD-Patienten mit 0,1 kg/Jahr deutlich unter der Zunahme von Gesunden mit 0,2-0,9 kg/Jahr (US-Bevölkerung 1990er) (Williamson, 1993; Lewis et al., 2000). Zwar wurden vereinzelt auch deutliche Ge- wichtszunahmen beschrieben, allerdings waren viele dieser Patienten von Depressionen be- troffen, bei denen sowohl die medikamentöse Behandlung mit Antidepressiva (gewichtsstei- gernde Wirkung), als auch die Bewegungsunlust einen Einfluss auf ihr Gewicht hatten (Ha- milton et al., 2004).

Möglicherweise ist der Gewichtsverlust bei HD-Patienten multifaktoriell bedingt. Sowohl die motorischen Dysfunktionen als auch metabolische Faktoren und zusätzlich Probleme bei der Nahrungsaufnahme können Einfluss auf die gestörte Regulation des Körpergewichts haben.

Das Leptinsystem könnte mit seiner gewichtsregulierenden Funktion bei HD-Patienten ebenso verändert sein.

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Einleitung 12

1.4 Zielsetzung

HD stellt bis heute eine unheilbare und zum Tode führende Krankheit dar, bei der oberstes Ziel eine symptomatische und lebensverlängernde Therapie sein muss. An HD erkrankte Pa- tienten leiden gerade im Endstadium ihrer Krankheit an substanziellem Gewichtsverlust, der die Anfälligkeit für Infektionen erhöht und als ein zusätzlich lebenslimitierender Faktor anzusehen ist. Das Leptinsystem könnte mit seiner zentralen Stellung im Energiehaushalt des Kör- pers bei diesen Patienten pathologisch verändert sein und ursächlich deren Gewichtsabnahme erklären. In dieser Arbeit soll untersucht werden, ob das Leptinsystem in seiner gewichtsregulierenden Funktion bei homozygoten HD-Ratten im Vergleich mit gesunden Wildtyp-Tieren verändert ist.

Im Einzelnen sollen folgende Fragestellungen untersucht werden:

- gibt es Unterschiede der Nahrungsaufnahme von HD-Ratten zu Wildtyp-Ratten?

- sind die Gewichtsunterschiede abhängig vom Alter oder Geschlecht der Ratten?

- gibt es einen quantitativen Unterschied der Fettmasse bzw. eine Differenz zwischen dem Anteil an mesenterialem und subkutanem Fettgewebe?

- gibt es Unterschiede in der Leptin-Expression in der Leber?

- gibt es Unterschiede in der Leptin-Rezeptor-Expression in der Leber?

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Material und Methoden 13

2 Material und Methoden

2.1 Versuchstiere und Haltung

Für die Versuchsreihe wurden 20 gesunde Wildtyp-(Wt) Ratten und 20 kranke Huntington transgene (HDtg) Ratten verwendet. Sowohl bei den Wildtyp-, als auch bei den HDtg-Ratten waren 50% männlichen und 50% weiblichen Geschlechts. Das Alter bei Tötung betrug bei jeweils der Hälfte der Tiere 14 Monate (alt) bzw. 3 Monate (jung).

Tabelle 1 zeigt die verschiedenen Tiergruppen und den in der vorliegenden Arbeit benutzten Tier-Identifikations-Code:

Tabelle 1: Tiergruppen und Identifikations-Code

Anzahl Merkmale Code

5 Wildtyp; gesund; männlich; alt Wt_m_14 5 Wildtyp; gesund; weiblich; alt Wt_w_14 5 Wildtyp: gesund; männlich; jung Wt_m_3 5 Wildtyp; gesund; weiblich; jung Wt_w_3 5 HDtg; krank; männlich; alt HDtg_m_14 5 HDtg; krank; weiblich; alt HDtg_w_14 5 HDtg; krank; männlich; jung HDtg_m_3 5 HDtg; krank; weiblich; jung HDtg_w_3

Bei den HDtg-Ratten handelt es sich um ein transgenes Rattenmodell für die Huntington’s Disease (von Hörsten et al., 2003). Generiert wurde das HDtg-Rattenmodell durch Mikroin- jektion eines aus menschlicher HD-Patienten-DNA und eines modifizierten Ratten- Huntingtin-Promotor bestehenden RHD/Prom51A-Konstrukts in den männlichen Vorkern von Oozyten von Sprague-Dawley Rattenspendern (Mullins et al., 1990; Schinke et al., 1999).

Ähnlich wie HD-Patienten tragen diese HDtg-Ratten eine humane cDNA mit 51 CAG- Repeats und zeichnen sich im Gegensatz zu den sonst verwendeten R6/2-Mäusen statt eines fulminanten, rasch progredienten Verlaufs durch einen langsam progredienten neurologischen

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Phänotyp aus. Auch tritt keine Komorbidität mit Diabetes mellitus mehr auf. HDtg-Ratten können besser für neuroradiologische Verlaufsstudien und Langzeittherapiestudien sowie für mikrochirurgische Eingriffe genutzt werden.

Die HDtg-Ratten sind im Alter von 6 Monaten 5% leichter und wiegen im Alter von 24 Mo- naten 20% weniger als die Kontrolltiere. HDtg-Ratten stellen das weltweit erste Rattenmodell für eine humane neurodegenerative Erkrankung des ZNS dar und zeigen eine ganze Reihe von Parallelen zur humanen HD (von Hörsten et al., 2003)

Alle Tiere wurden unter standardisierten Bedingungen spezifisch pathogenfrei im zentralen Tierlaboratorium der Medizinischen Hochschule Hannover gehalten. In dem schallgeschütz- ten Raum herrschte ein Hell-Dunkel-Zyklus von jeweils 12 Stunden (Tagzyklus von 7 Uhr bis 19 Uhr) und eine Raumtemperatur von 21 ± 1 °C. Der Käfigboden war mit Streu ausgelegt.

Das Standard-Trockenfutter (Altromin 1234, Altromin GmbH, Lage) und das Trinkwasser standen allen Ratten ad libitum zur Verfügung. Die Tiere wurden in einem Käfig (40 x 26 x 15 cm) aus Polykarbonat mit Gitterdeckel gehalten, in dem sie sich frei bewegen konnten.

Alle in dieser Dissertation durchgeführten Versuche waren von der Bezirksregierung Hanno- ver genehmigt (05/1024).

2.2 Gewichtskontrolle

Das Gewicht der Versuchstiere wurde regelmäßig im Abstand von einem Monat von dem Doktoranden Felix Bode aus der Arbeitsgruppe Stephan von Hörsten (Franz-Penzoldt- Zentrum, Experimentelle Biomedizin, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg) zur selben Uhrzeit mit einer geeichten Waage gemessen und protokolliert. Die tägliche Fut- teraufnahme wurde ebenfalls monatlich von Felix Bode ermittelt.

2.3 Organgewinnung

Die Versuchstiere wurden per Inhalationsnarkose mit einem 5%-Isofluran-Sauerstoff- Gemisch narkotisiert. Anschließend wurde während der Erhaltungsnarkose mit 3 Volumen- prozent per Bauchschnitt die Aorta abdominalis freigelegt und punktiert. Es wurden ca. 5 ml Blut entnommen und für weitere Analysen verwendet. Dann wurde der intermediäre Leber-

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lappen entfernt und definierte Stücke (0,5 cm x 0,5 cm) in flüssigem Stickstoff eingefroren und anschließend bei -70 °C konserviert.

2.4 Immunhistologie

Die ca. 6 µm dünnen Leberschnitte wurden mit dem APAAP (Alkalische Phosphatase- Anti-Alkalische Phosphatase)- System gefärbt. Die beiden Primärantikörper richten sich gegen den Carboxy-Terminus des Gesamt-Leptins [Ob (A-20); sc-842, polyclonal, Santa Cruz Biotechnology, Inc.] und den Carboxy-Terminus von Ob-R [Ob-R (B3); sc-1834, monoclo- nal, Santa Cruz Biotechnology, Inc.].

Nach Fixierung und Trocknung der Schnitte wurde der Primär-Antikörper auf die Schnitte aufgetragen (PBS/BSA als Kontrolle) und bei 4 °C über Nacht in einer feuchten Kammer inkubiert. Im nächsten Schritt wurden die Präparate zweimal mit TBS (Tris–Buffered-Saline) Tweengewaschen. In einem Zwischenschritt erfolgte für die Leptin–Färbung die 30-minütige Inkubation mit dem Brücken-Antikörper M737 (mouse anti rabbit Immunglobuline; Dako, Hamburg). Nach zwei weiteren Waschvorgängen wurden die Präparate mit dem jeweiligen Sekundär-Antikörper (Z259 für Leptin und Z0228 für Ob-R; Dako, Hamburg) für 30 Minuten inkubiert. Nach erneutem Waschen folgte für weitere 30 Minuten der Tertiär-Antikörper (D651 für Leptin und B0157 für Ob-R; Dako, Hamburg). Diese letzten beiden Schritte wurden wiederholt, bevor die Farbsubstrate (Fast Red für Leptin und Fast Blue für Ob-R; SIG- MA, München) aufgetragen wurden. Nach der Gegenfärbung mit Hämalaun (Merck, Dar- mstadt) folgte die Eindeckung der Schnitte mit Glycergel (Dako, Hamburg).

2.5 Histologische Auswertung

Die histologischen Schnitte wurden am Axiophot-Mikroskop (Zeiss, Jena) blind ausgewertet.

Verwendet wurde ein Objektiv mit 5 und 20facher Vergrößerung. Die Präparate wurden zu- nächst in der Übersichtsvergrößerung betrachtet, um die Qualität von Färbung und Schnitt zu beurteilen. Auf jedem Objektträger befanden sich 6-8 Schnitte eines Versuchstieres, von denen jeweils vier zufällig zur Auszählung herangezogen wurden. Bei der Leptin-Färbung wurden pro Schnitt zwei zufällige Fotos gemacht, so dass pro Tier insgesamt 8 Fotos erstellt wurden. Diese wurden dann in schwarz-weiß transformiert und mit dem Programm ImageJ aus-

(18)

gewertet. Die Leptin-Rezeptoren exprimierenden Zellen wurden auf 2 Quadratmillimeter pro Organschnitt ausgezählt und der Mittelwert für jedes Tier errechnet.

2.6 Statistische Auswertung

Die Daten sind dargestellt als Mittelwerte ± SEM (Standard error of the mean). Zur Analyse der Zusammenhänge von Leptin und Leptin-Rezeptoren in gesunden und an HD erkrankten Ratten wurde eine ANOVA-Analyse mit „Gruppe“ als Faktor und „Dichte-Wert“ als abhän- gige Variable durchgeführt. Anschließend wurde ein Fisher-PLSD Post-Hoc-Test durchge- führt.

Die durchgeführten Signifikanz-Vergleiche zwischen den einzelnen Gruppen sind in Abbil- dung 1 dargestellt.

Signifikante Effekte von Leptin oder Leptin-Rezeptoren von jungen HD-Tieren (HDtg_m_3;

HDtg_w_3) gegenüber alten homozygoten HD-Tieren (HDtg_m_14; HDtg_w_14) sowie jungen Wildtyp-Tieren (Wt_m_3; Wt_w_3) gegenüber alten Wildtyp-Tieren (Wt_m_14;

Wt_w_14) wurden in den dargestellten Abbildungen durch Sternchen markiert: * p<0,001.

Signifikante Effekte von Leptin oder Leptin-Rezeptoren von männlichen Tieren (HDtg_m_3;

HDtg_m_14; Wt_m_3; Wt_m_14) gegenüber den korrespondierenden weiblichen Tieren (HDtg_w_3; HDtg_w_14; Wt_w_3; Wt_w_14) wurden in den dargestellten Abbildungen durch Rauten markiert: # p<0,001.

Signifikante Effekte von Leptin oder Leptin-Rezeptoren von homozygoten HD-Tieren (HDtg_m_3; HDtg_w_3; HDtg_m_14; HDtg_w_14) gegenüber den korrespondierenden Wildtyp-Tieren (Wt_m_3; Wt_w_3; Wt_m_14; Wt_w_14) wurden in den dargestellten Ab- bildungen durch Paragraphen markiert: § p<0,001.

HDtg

jung alt

m w m w Wt

jung alt

m w m w #

* _§

Abbildung 1: Schematische Darstellung der angestellten Vergleiche zwischen den einzelnen Gruppen

(19)

Die statistische Auswertung der vorliegenden Daten wurde mit Hilfe der Software Stat- View 5.0 für Windows durchgeführt. Die anschließende grafische Aufarbeitung der Daten erfolgte mit GraphPad Prism 4.0 und Microsoft Excel 2007.

2.7 MRT Fettquantifizierung

In Kooperation mit der Klinik für Diagnostische Radiologie der Medizinischen Hochschule Hannover wurde mit einem neuen MRT-Untersuchungsverfahren der Fettgehalt einer gesunden weiblichen Ratte und einer kranken weiblichen Ratte ermittelt. Die Wildtyp-Ratte hatte ein Gewicht von 282 g, die HDtg-Ratte wog 264 g. Beide waren ca. 8 Monate alt.

Beide Ratten wurden vor der Untersuchung per Isofluran-Narkose anästhesiert und durch eine intramuskuläre Ketamin-Hydrochlorid (10 %, 0,35 ml; Dr. E. Gräub AG, Bern) und Medeto- midin-Hydrochlorid (0,001 %, 0,05 ml; Pfizer GmbH, Karlsruhe) Injektion getötet. Die Un- tersuchung wurde mit einem 1.5 T „whole body scanner“ (General Electric Health Care Sys- tems, Milwaukee, USA; CV/i V. 9.1) durchgeführt. Hierzu wurde die Ratte in ein

„4 channel Receive wrist coil“ (Invivo Cooperation, Pewaukee, USA) gelegt. Danach wurde ein Ganzkörperscan durchgeführt.

2.8 MRT Auswertung

Bei der Analyse der Daten wurde eine 512 x 512 Matrix mit einer SE T1-Wichtung und einer Schnittdicke von 4 mm verwendet. Das „field of view“ betrug 8 cm, die „spatial resolution“

0,16 x 0,16 x 4 mm. Die Quantifizierung wurde von Kopf bis Schwanz vorgenommen, die Füße wurden ausgespart. Es wurden das Gesamtvolumen und das Gesamtfett ermittelt. Wei- terhin wurde zwischen subkutanem und mesenterialem Fett differenziert.

(20)

Ergebnisse 18

3 Ergebnisse

3.1 Futteraufnahme

Die Futteraufnahme war in beiden Versuchsgruppen nahezu identisch (Abbildung 2). Im Mit- tel nahmen die Wildtyp-Ratten über den gesamten Zeitraum 27 g pro Tag zu sich. Bei den HDtg-Ratten betrug die Futteraufnahme durchschnittlich 28 g pro Tag.

0 2 4 6 8 10 12 14

22 24 26 28 30 32 34

Wildtyp HDtg

Alter [Monaten]

Futteraufnahme [g/d]

Abbildung 2: Tägliche Futteraufnahme von alten Wildtyp- und HDtg-Ratten: n=10 pro Gruppe.

(21)

Ergebnisse 19

Beurteilt man die einzelnen Geschlechtsgruppen bezüglich der Futteraufnahme getrennt von- einander, ist festzustellen, dass die weiblichen HDtg-Ratten im Mittel signifikant (p<0,05) mehr Futter pro Tag zu sich nahmen als die Kontrolltiere (Abbildung 3 und 4). Um durchschnittlich 12,9 % höher lag die Futtermenge bei den HDtg-Ratten im Vergleich mit den Wildtyp-Tieren. Bei den männlichen Ratten konnte diese Entwicklung nicht beobachtet werden. Hier waren keine signifikanten Unterschiede festzustellen (Abbildung 4).

0 2 4 6 8 10 12 14

10 20 30

40 Wildtyp M

Wildtyp W HDtg M HDtg W

Alter [Monate]

Abbildung 3: Tägliche Futteraufnahme von alten gesunden und kranken Ratten, getrennt nach Geschlecht:

n=5 pro Gruppe

0 10 20 30 40

W t_m_14 W t_w _14 HDtg_m_14 HDtg_w _14

§

gesund krank

Abbildung 4: Mittlere Futteraufnahme bei alten Wildtyp- und HDtg-Ratten; § markiert den signifikanten Unterschied (p<0,05) zwischen alten gesunden und kranken Ratten mit gleichem Geschlecht.

Zur Errechnung der Mittelwerte und des SEM wurden pro Gruppe n=65 Einzelmesswerte verwendet.

(22)

Ergebnisse 20

3.2 Gewichtsentwicklung

Das mittlere Gewicht der Alttiere betrug im zweiten Lebensmonat bei den Wildtyp-Tieren 244,4 g. Die HDtg-Ratten wogen zum selben Zeitpunkt 227,2 % und damit 7 % weniger. Die weitere Gewichtskontrolle ergab, dass mit fortschreitendem Alter der Gewichtsunterschied von Wildtyp-Tieren zu HDtg-Tieren immer größer wurde (Abbildung 5). Im 14. Lebensmonat waren die HDtg-Tiere im Schnitt 8,8 % leichter, als die Kontrollgruppe.

0 2 4 6 8 10 12 14

100 200 300 400

500 Wildtyp

HDtg

Alter [Monate]

Gewicht [g]

Abbildung 5: Gewichtsentwicklung von alten Wildtyp- und HDtg-Ratten: n=10 pro Gruppe.

Bei den Jungtieren zeigte sich ebenfalls ein niedrigeres Gewicht bei den HDtg-Ratten im Vergleich zu den Wildtyp-Tieren (Abbildung 6). Nach 28 Tagen wogen die Wildtyp-Ratten im Mittel 84,2 g, die HDtg-Ratten 73 g (minus 13,3 %). Bei der letzten Messung nach 56 Tagen betrug der Gewichtsunterschied 7,3 %.

20 30 40 50 60

0 50 100 150 200 250

Wildtyp HDtg

Alter [Tagen]

Gewicht [g]

Abbildung 6: Gewichtsentwicklung von jungen Wildtyp- und HDtg-Ratten: n=10 pro Gruppe.

(23)

Ergebnisse 21

Bei der Betrachtung der Alttier-Gruppen im Einzelnen ist festzustellen, dass die männlichen HDtg-Ratten anfänglich 14,9 % weniger wogen als die männlichen Wildtyp-Ratten. Auch im 14. Lebensmonat lag das Gewicht der HDtg-Ratten immer noch niedriger (15,4 % Unter- schied) als bei den Kontrolltieren (p<0,01) (Abbildung 7 und 8). Bei den weiblichen Ratten konnte diese Entwicklung nicht beobachtet werden. Hier waren die weiblichen HDtg-Ratten tendenziell, jedoch nicht signifikant, etwas schwerer als die Kontrollgruppe (Abbildung 7 und 8).

0 2 4 6 8 10 12 14

100 200 300 400 500

600 Wt_m_14

Wt_w_14 HDtg_m_14 HDtg_w_14

Alter [Monate]

Gewicht [g]

Abbildung 7: Gewichtsentwicklung von alten gesunden und kranken Ratten, geteilt nach Geschlecht:

n= 5 pro Gruppe

0 100 200 300 400 500

W t_m_14 W t_w _14 HDtg_m_14 HDtg_w _14

§

Gewicht [g]

Abbildung 8: Mittleres Gewicht bei alten Wildtyp- und HDtg-Ratten; § markiert den signifikanten Unter- schied (p<0,01) zwischen alten gesunden und kranken Ratten mit gleichem Geschlecht. Zur Er- rechnung der Mittelwerte und des SEM wurden pro Gruppe n=65 Einzelmesswerte verwendet.

(24)

Ergebnisse 22

3.3 MRT Fettquantifizierung

Die Fettquantifizierung ergab ein um 8 % vermindertes Gesamtvolumen der HDtg-Ratte im Vergleich mit der gleichaltrigen Wildtyp-Ratte (s. Tabelle 2). Der Gesamtfettgehalt war bei der HDtg-Ratte um 40 % vermindert und lag daher deutlich niedriger als bei der Kontroll- Ratte. Einen niedrigeren subkutanen Fettgehalt bei der HDtg-Ratte um 30 %, sowie eine geringere mesenteriale Fettmenge von 58 % konnte festgestellt werden. Das Verhältnis des me- senterialen zum subkutanen Fettgehalt lag bei den kranken Ratten um 21 % niedriger.

Tabelle 2: Fettverteilung gemessen im MRT

Wildtyp-Ratte HDtg-Ratte Unterschied in % bezogen auf Wt-Ratte

Gesamtvolumen [ml] 261 239 8

Gesamtfett [ml] 35 21 40

Subkutan [ml] 23 16 30

Mesenterial [ml] 12 5 58

Mesenterial Fett zu

Subkutan [%] 52 31 21

Abbildung 9: MRT-Aufnahme Wildtyp- Ratte; infrarenaler Schnitt

Abbildung 10: MRT-Aufnahme HDtg- Ratte; infrarenaler Schnitt

(25)

Ergebnisse 23

Abbildung 11:

Makroskopische intraabdominelle Aufnahme einer Wildtyp-Ratte mit deutlicher Fettansammlung.

Abbildung 12:

Makroskopische intraabdominelle Aufnahme einer HDtg-Ratte mit stark reduzierter Fettansammlung.

(26)

Ergebnisse 24

3.4 Quantitative Auswertung der mittleren Dichte der Leptinexpression im Leberschnitt

Zur besseren Beurteilbarkeit der signifikanten Werte werden nur jeweils vier Gruppen pro Diagramm und damit zwei Vergleiche grafisch dargestellt. Die Balken der verschiedenen Gruppen kommen somit in mehreren Abbildungen vor.

3.4.1 Wildtyp-Ratten jung vs. alt

Die histologische Auswertung ergab eine signifikante (p<0,0001) Erhöhung der mittleren Dichte der Leptinexpression bei den alten Wildtyp-Ratten im Vergleich mit den jungen Wild- typ-Ratten (Abbildung 13). Bei den Wt_m_14-Ratten betrug die mittlere Zunahme im Ver- gleich zu den jüngeren Wt_m_3-Ratten 9,0 %. Der gleiche Effekt zeigte sich bei der Gegenü- berstellung der weiblichen Tiere. Dort lag der signifikante (p<0,0001) Unterschied von Wt_w_14 zu Wt_w_3 bei 16,4 %.

0 25 50 75 100

125 *

W t_m_14

Wt_m_3 W t_w _3 Wt_w _14

*

jung alt

Leptinexpression (mittlere Dichte)

Abbildung 13: Mittlere Dichte der Leptinexpression im Leberschnitt bei Wildtyp-Ratten; * markiert den signifikanten Unterschied (p<0,0001) in einer Geschlechtsgruppe zwischen jungen und alten Ratten.

Zur Errechnung der Mittelwerte und des SEM wurden pro Gruppe (5 Tiere) n=40 Einzelmess- werte verwendet. Pro Tier wurden von vier Schnitten jeweils zwei Fotos (Fläche pro Foto:

0,27 mm²) benutzt. Die Messfläche für jeden Einzelmesswert betrug 0,54 mm². Bei fünf Tieren pro Gruppe ergab dies eine Gesamtmessfläche von 10,8 mm².

(27)

Ergebnisse 25

3.4.2 HDtg-Ratten jung vs. alt

Bei den Huntington transgenen Ratten waren signifikante Effekte (p=0,0001) bei dem Ver- gleich der männlichen Jungtiere mit den männlichen Alttieren zu erkennen (Abbildung 14). Bei den HDtg_m_14-Ratten war die mittlere Dichte der Leptinexpression im Vergleich zu den HDtg_m_3-Ratten um 7,6 % höher. Bei den korrespondierenden weiblichen Versuchstie- ren gab es keine signifikanten Effekte.

0 25 50 75 100

125 *

HDtg_m_14

HDtg_m_3 HDtg_w _3 HDtg_w _14

jung alt

Abbildung 14: Mittlere Dichte der Leptinexpression im Leberschnitt bei HDtg-Ratten; * markiert den signifikanten Unterschied (p<0,0001) in einer Geschlechtsgruppe zwischen jungen und alten Ratten.

Zur Errechnung der Mittelwerte und des SEM wurden pro Gruppe n=40 Einzelmesswerte verwendet. Pro Tier wurden von vier Schnitten jeweils zwei Fotos (Fläche pro Foto: 0,27 mm²) benutzt. Die Messfläche für jeden Einzelmesswert betrug 0,54 mm². Bei fünf Tieren pro Grup- pe ergab dies eine Gesamtmessfläche von 10,8 mm².

(28)

Ergebnisse 26

3.4.3 Wildtyp-Ratten männlich vs. weiblich

Nach histologischer Auswertung waren signifikante Effekte (p<0,01) bei dem Vergleich der gesunden, männlichen Jungtiere mit den gesunden, weiblichen Jungtieren zu erkennen (Ab- bildung 15). Hier wiesen die weiblichen Ratten eine niedrigere mittlere Dichte der Leptinexp- ression auf als die männlichen Tiere. Die Abnahme bei den Wt_w_3-Ratten im Vergleich zu den Wt_m_3-Ratten betrug 5,6 %. Keine Signifikanz konnte jedoch bei dem Vergleich der alten Wildtyp-Tiere gefunden werden.

0 25 50 75 100 125

#

W t_m_14 Wt_w _14

W t_m_3 W t_w _3

männlich weiblich

Abbildung 15: Mittlere Dichte der Leptinexpression im Leberschnitt bei Wildtyp-Ratten; # markiert den signifikanten Unterschied (p<0,01) zwischen männlichen und weiblichen Ratten mit gleichem Le- bensalter. Zur Errechnung der Mittelwerte und des SEM wurden pro Gruppe n=40 Einzel- messwerte verwendet. Pro Tier wurden von vier Schnitten jeweils zwei Fotos (Fläche pro Foto:

(29)

Ergebnisse 27

3.4.4 HDtg-Ratten männlich vs. weilblich

Im Gegensatz zu der Vergleichsgruppe der Wildtyp-Ratten wurden signifikante Effekte (p<0,0001) bei dem Vergleich der kranken männlichen Alttiere mit den kranken weiblichen Alttieren festgestellt (Abbildung 16). Bei den HDtg_w_14-Ratten wurden durchschnittlich um 7,9 % niedrigere Werte gemessen als bei den HDtg_m_14-Ratten. Bei den jungen HDtg-Ratten konnte bei dem Geschlechtervergleich kein signifikanter Effekt festgestellt werden.

0 25 50 75 100 125

#

HDtg_m_14

Abbildung 16: Mittlere Dichte der Leptinexpression im Leberschnitt bei HDtg-Ratten; # markiert den signifikanten Unterschied (p<0,0001) zwischen männlichen und weiblichen Ratten mit gleichem Le- bensalter. Zur Errechnung der Mittelwerte und des SEM wurden pro Gruppe n=40 Einzel- messwerte verwendet. Pro Tier wurden von vier Schnitten jeweils zwei Fotos (Fläche pro Foto:

(30)

Ergebnisse 28

3.4.5 Jungtiere Wildtyp vs. HDtg-Ratten

Signifikante Effekte waren bei dem Vergleich der kranken Jungtiere mit den gesunden Jung- tieren zu erkennen. Sowohl bei den männlichen, als auch bei den weiblichen Jungtieren zeigte sich bei den HDtg-Tieren eine Erhöhung der Leptinexpression im Vergleich mit den korrespondierenden Wildtyp-Tieren (Abbildung 17). Im Vergleich zu den Wt_m_3-Tieren wiesen die HDtg_m_3-Ratten durchschnittlich um 4,2 % höhere Werte auf (p<0,05). Bei den HDtg_w_3-Ratten waren gegenüber den Wt_w_3-Ratten die Werte um 11,4 % höher (p<0,0001).

0 25 50 75 100 125

Wt_m_3 W t_w _3 HDtg_m_3 HDtg_w _3

§ §

Abbildung 17: Mittlere Dichte der Leptinexpression im Leberschnitt bei Wildtyp- und HDtg-Ratten; § markiert den signifikanten Unterschied (männlich: p<0,05; weiblich: p<0,0001) zwischen jungen gesunden und kranken Ratten mit gleichem Geschlecht. Zur Errechnung der Mittelwerte und des SEM wurden pro Gruppe n=40 Einzelmesswerte verwendet. Pro Tier wurden von vier Schnitten jeweils zwei Fotos (Fläche pro Foto: 0,27 mm²) benutzt. Die Messfläche für jeden Einzelmesswert betrug 0,54 mm². Bei fünf Tieren pro Gruppe ergab dies eine Gesamtmessflä- che von 10,8 mm².

(31)

Ergebnisse 29

3.4.6 Alttiere Wildtyp vs. HDtg-Ratten

Bei den Alttieren konnten nur signifikante Effekte bei den weiblichen Tieren, nicht jedoch bei den männlichen Ratten, festgestellt werden (Abbildung 18). Allerdings verminderten sich im Gegensatz zu den Jungtieren bei den Weibchen die Werte der mittleren Dichte der Leptinexp- ression bei den kranken HDtg-Tieren. Im Vergleich mit den Wt_w_14-Ratten wurde bei den HDtg_w_14-Ratten eine Reduktion um 6,0 % festgestellt (p<0,01).

0 25 50 75 100 125

Wt_m_14 Wt_w _14 HDtg_m_14 HDtg_w _14

§

Abbildung 18: Mittlere Dichte der Leptinexpression im Leberschnitt bei Wildtyp- und HDtg-Ratten; § markiert den signifikanten Unterschied (p<0,01) zwischen alten gesunden und kranken Ratten mit gleichem Geschlecht. Zur Errechnung der Mittelwerte und des SEM wurden pro Gruppe n=40 Einzelmesswerte verwendet. Pro Tier wurden von vier Schnitten jeweils zwei Fotos (Fläche pro Foto: 0,27 mm²) benutzt. Die Messfläche für jeden Einzelmesswert betrug 0,54 mm². Bei fünf Tieren pro Gruppe ergab dies eine Gesamtmessfläche von 10,8 mm².

(32)

Ergebnisse 30

3.4.7 Immunhistologische Fotografien der Leptinexpression in der Leber

Abbildung 19:

Lebergewebe mit einer hohen Leptinsynthese;

Leptin rot angefärbt.

Abbildung 20:

Lebergewebe mit einer geringen Leptinsynthese;

Leptin rot angefärbt.

100 μm

(33)

Ergebnisse 31

3.5 Quantitative Auswertung der Ob-Rezeptor exprimierenden Zellen in der Leber

3.5.1 Wildtyp-Ratten jung vs. alt

Die histologische Auswertung ergab eine signifikante (p<0,0001) Erhöhung der Anzahl der Ob-Rezeptor exprimierenden Zellen (Hepatozyten) bei den alten Wildtyp-Ratten im Ver- gleich mit den jungen Wildtyp-Ratten (Abbildung 21). Bei den Wt_m_14-Ratten stiegen die gemessenen Werte im Vergleich zu den jüngeren Wt_m_3-Ratten durchschnittlich um 1500 %. Der gleiche Effekt zeigte sich bei der Gegenüberstellung der weiblichen Tiere. Dort lag die signifikante Erhöhung der Wt_w_14-Ratten zu den Wt_w_3-Ratten bei 530 %.

0 1 2 3 4

5 *

*

Wt_m_14

Wt_m_3 Wt_w _3 W t_w _14

jung alt

Anzahl Ob-Rezeptor exprimierender Zellen

Abbildung 21: Mittlere Anzahl der Ob-Rezeptor exprimierenden Zellen (Hepatozyten) im Leberschnitt bei Wildtyp-Ratten; * markiert den signifikanten Unterschied (p<0,0001) in einer Geschlechts- gruppe zwischen jungen und alten Ratten. Zur Errechnung der Mittelwerte und des SEM wurden pro Gruppe (5 Tiere) n=20 Einzelmesswerte verwendet. Pro Tier wurden vier Schnitte auf jeweils 2 mm² begutachtet. Die Anzahl der auf insgesamt 2 mm² ausgezählten positiv angefärb- ten Zellen ergab den Einzelmesswert.

(34)

Ergebnisse 32

3.5.2 HDtg-Ratten jung vs. alt

Bei den Huntington transgenen Ratten waren ebenfalls signifikante Effekte (p=0,0001) bei dem Vergleich der männlichen Jungtiere mit den männlichen Alttieren zu erkennen. Die An- zahl Ob-Rezeptor exprimierender Zellen lag bei den HDtg_m_14-Ratten in Vergleich zu den HDtg_m_3-Ratten um 1475 % höher (Abbildung 22). Bei den korrespondierenden weiblichen Versuchstieren zeigte sich diese Erhöhung auch. Bei den HDtg_w_14-Tieren lagen die signifikanten (p<0,05) Werte um 300 % höher als bei den HDtg_w_3-Ratten (Abbildung 22).

0 1 2 3 4 5

*

HDtg_m_14

jung alt

*

Abbildung 22: Mittlere Anzahl der Ob-Rezeptor exprimierenden Zellen (Hepatozyten) im Leberschnitt bei HDtg-Ratten; * markiert den signifikanten Unterschied (männlich: p=0,0001; weiblich:

p<0,05) in einer Geschlechtsgruppe zwischen jungen und alten Ratten. Zur Errechnung der Mittelwerte und des SEM wurden pro Gruppe (5 Tiere) n=20 Einzelmesswerte verwendet. Pro Tier wurden vier Schnitte auf jeweils 2 mm² begutachtet. Die Anzahl der auf insgesamt 2 mm² ausgezählten positiv angefärbten Zellen ergab den Einzelmesswert.

(35)

Ergebnisse 33

3.5.3 Wildtyp-Ratten männlich vs. weiblich

Bei dem Vergleich der gesunden männlichen Alttiere mit den gesunden weiblichen Alttieren wurden signifikante Effekte (p<0,0001) festgestellt. Hier wiesen die weiblichen Ratten signifikant weniger Ob-Rezeptoren exprimierende Zellen auf als die Männchen (Abbildung 23).

Die Reduktion der Messwerte von den Wt_m_14-Ratten zu den Wt_w_14-Ratten betrug 43,8 %. Keine Signifikanz konnte jedoch bei dem Vergleich der jungen Wildtyp-Tiere gefunden werden.

0 1 2 3 4 5

#

W t_m_14 W t_w _14

W t_m_3 W t_w _3

Abbildung 23: Mittlere Anzahl der Ob-Rezeptor exprimierenden Zellen (Hepatozyten) im Leberschnitt bei Wildtyp-Ratten; # markiert den signifikanten Unterschied (p<0,0001) zwischen männlichen und weiblichen Ratten mit gleichem Lebensalter. Zur Errechnung der Mittelwerte und des SEM wurden pro Gruppe (5 Tiere) n=20 Einzelmesswerte verwendet. Pro Tier wurden vier Schnitte auf jeweils 2 mm² begutachtet. Die Anzahl der auf insgesamt 2 mm² ausgezählten positiv angefärbten Zellen ergab den Einzelmesswert.

(36)

Ergebnisse 34

3.5.4 HDtg-Ratten männlich vs. weiblich

Nach histologischer Auswertung waren signifikante Effekte (p<0,0001) bei dem Vergleich der kranken männlichen Alttiere mit den kranken weiblichen Alttieren zu erkennen (Abbil- dung 24). Bei den HDtg_w_14-Ratten wurden durchschnittlich um 59,3 % geringere Werte gemessen als bei den HDtg_m_14 Ratten. Bei den jungen HDtg-Ratten konnte bei dem Ge- schlechtervergleich kein signifikanter Effekt festgestellt werden.

0 1 2 3 4 5

#

HDtg_m_14

Abbildung 24: Mittlere Anzahl der Ob-Rezeptor exprimierenden Zellen (Hepatozyten) im Leberschnitt bei HDtg-Ratten; # markiert den signifikanten Unterschied (p<0,0001) zwischen männlichen und weiblichen Ratten mit gleichem Lebensalter. Zur Errechnung der Mittelwerte und des SEM wurden pro Gruppe (5 Tiere) n=20 Einzelmesswerte verwendet. Pro Tier wurden vier Schnitte auf jeweils 2 mm² begutachtet. Die Anzahl der auf insgesamt 2 mm² ausgezählten positiv ange- färbten Zellen ergab den Einzelmesswert.

(37)

Ergebnisse 35

3.5.5 Jungtiere Wildtyp vs. HDtg-Ratten

Keine signifikante Differenz zwischen der Anzahl an Ob-Rezeptoren exprimierenden Zellen bei HDtg-Ratten im Vergleich mit den korrespondierenden Wildtyp-Ratten wurde bei den Jungtieren festgestellt (Abbildung 25).

0 1 2 3 4 5

Wt_m_3 Wt_w _3 HDtg_m_3 HDtg_w _3

Abbildung 25: Mittlere Anzahl der Ob-Rezeptor exprimierenden Zellen (Hepatozyten) im Leberschnitt bei jungen Wildtyp- und HDtg-Ratten; Es konnten keine signifikanten Effekte festgestellt werden.

Zur Errechnung der Mittelwerte und des SEM wurden pro Gruppe (5 Tiere) n=20 Einzel- messwerte verwendet. Pro Tier wurden vier Schnitte auf jeweils 2 mm² begutachtet. Die An- zahl der auf insgesamt 2 mm² ausgezählten positiv angefärbten Zellen ergab den Einzelmess- wert.

(38)

Ergebnisse 36

3.5.6 Alttiere Wildtyp vs. HDtg-Ratten

Signifikante Effekte waren bei dem Vergleich der kranken Alttiere mit den gesunden Alttie- ren zu erkennen. Sowohl bei den männlichen, als auch bei den weiblichen Alttieren zeigte sich bei den HDtg-Tieren eine Abnahme der Anzahl an Ob-Rezeptoren exprimierenden Zel- len im Vergleich mit den korrespondierenden Wildtyp-Tieren (Abbildung 26). Im Vergleich zu den Wt_m_14-Tieren wiesen die HDtg_m_14-Ratten durchschnittlich um 26,3 % niedrigere Werte auf (p<0,01). Bei den HDtg_w_3-Ratten waren gegenüber den Wt_w_3-Ratten die Werte um 45,5 % niedrigerer (p<0,01).

0 1 2 3 4 5

W t_m_14 Wt_w _14 HDtg_m_14 HDtg_w _14

§

Abbildung 26: Mittlere Anzahl der Ob-Rezeptor exprimierenden Zellen (Hepatozyten) im Leberschnitt bei alten Wildtyp- und HDtg-Ratten; § markiert den signifikanten Unterschied (p<0,01) zwischen alten gesunden und kranken Ratten mit gleichem Geschlecht. Zur Errechnung der Mittelwerte und des SEM wurden pro Gruppe (5 Tiere) n=20 Einzelmesswerte verwendet. Pro Tier wurden vier Schnitte auf jeweils 2 mm² begutachtet. Die Anzahl der auf insgesamt 2 mm² ausgezählten positiv angefärbten Zellen ergab den Einzelmesswert.

(39)

3.5.7 I L

Abbi Lebe Ob-R

Immunhist Leber

ildung 27:

ergewebe mit O Rezeptor-Expr

tologische

Ob-Rezeptor e ression blau an

Fotografie

exprimierende ngefärbt

der Ob-R

100

en Hepatozyte

Rezeptor ex

0 μm

en;

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Ergebnis

nden Zellen

sse 37

n in der