Einfluss des Wachstumsfaktors VEGF auf die initiale Kapillarisierung beim Einbringen von PLGA-Scaffolds in Defekte kritischer Größe der Schädelkalotte
der Maus –
Intravitale fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen in einem neuartigen Schädelkammermodell
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Meike Gudrun Winkler
Berlin
Hannover 2009
Univ. Prof. Dr. Dr. Martin Rücker
Klinik für Mund-, Kiefer-, Gesichtschirurgie Medizinische Hochschule Hannover
1. Gutachter: Univ. Prof. Dr. A. Meyer-Lindenberg 2. Gutachter: PD Dr. A. Schnapper
Tag der mündlichen Prüfung: 12.05.2009
Meiner Familie
“Intravital assessment of osseous angiogenesis with the calvaria bone chamber”
Journal of Biomedical Materials Research Part A
Branko Sinikovic, Paul Schumann, Meike Winkler, Julian Küstermeyer, Frank Tavassol, Constantin Stühmer, Carlos Carvalho, Rolf Mülhaupt, Kai-Hendrik Bormann, Horst Kokemueller , Andrea Meyer-Lindenberg, Matthias W. Laschke, Michael D. Menger, Nils-Claudius Gellrich, Martin Rücker
INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG 1
2. LITERATURÜBERSICHT 5
2.1. Osteogenese 5
2.1.1. Chondrale Ossifikation 5
2.1.2. Desmale Ossifikation 5
2.2. Aufbau des Schädels 6
2.2.1. Knöcherne Schädeldecke 6
2.2.2. Das Periost 7
2.2.3. Die Dura mater encephali 7
2.3. Knochendefekte 8
2.3.1. Defekt kritischer Größe (critical size defect, CSD) 8
2.3.2. Knochenheilung 8
2.3.2.1. Allgemeine Vorgänge bei der Knochenheilung 8 2.3.2.2. Die Rolle der osteogenen Strukturen bei der
Knochenheilung 10
2.3.3. Juvenile und adulte Knochenheilung 11
2.4. Neovaskularisation, Vaskulogenese und Angiogenese 12
2.4.1. Das Gefäßsystem 12
2.4.2. Neovaskularisation 12
2.4.2.1. Vaskulogenese 13
2.4.2.2. Angiogenese 13
2.4.2.2.1. Der Prozess des Sprossens 14
2.4.2.2.2. Der Prozess des intussuszeptiven mikro-
vaskulären Wachstums 15
2.4.2.2.3. Angiogenese-Faktoren 16
2.4.2.2.3.1. Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) 17 2.4.2.2.3.1.1. VEGF-Rezeptoren (VEGFR) 17
2.5.2. Allogene Knochentransplantate 22
2.5.3. Xenogene Knochentransplantate 23
2.6. Knochenersatzmaterialien 24
2.6.1. Synthetische (alloplastische) Knochenersatzmaterialien 24 2.6.1.1. Osteokonduktive Knochenersatzmaterialien 25 2.6.1.2. Osteoinduktive Knochenersatzmaterialien 25
2.7. Tissue Engineering 26
2.7.1. Das Scaffold 27
2.7.1.1. Anforderungen an das Scaffold 28
2.7.1.1.1. Biokompatibilität 28
2.7.1.1.2. Porosität 28
2.7.1.1.3. Porengröße 29
2.7.1.1.4. Oberflächeneigenschaften 29
2.7.1.1.5. Mechanische Eigenschaften 30
2.7.1.1.6. Biodegradierbarkeit 30
2.7.1.1.7. Eigenschaften für die Anwendbarkeit 31 2.7.1.2. Einsetzbare Scaffoldmaterialien 31
2.7.1.2.1. Natürliche Polymere 31
2.7.1.2.1.1. Kollagen 32
2.7.1.2.2. Synthetische Polymere 33
2.7.1.2.3. Zusätze 34
2.7.1.2.3.1. Wachstumsfaktoren 34
2.7.1.3. Herstellung der Scaffolds 35
2.8. Intravitale Fluoreszenzmikroskopie 36
2.8.1. Fluoreszenzfarbstoffe 37
2.8.1.1. FITC-Dextran 37
2.8.1.2. Rhodamin 6G (Rh6G) 38
2.8.1.3. Phototoxische Reaktionen der Fluoreszenzfarbstoffe 38
3.1. Tiere und Tierhaltung 41
3.2. Material und Methoden 42
3.2.1. Kalottenkammer 42
3.2.2. Implantat 45
3.2.2.1. Scaffold 45
3.2.2.2. Beschichtung des Scaffolds 47
3.2.2.2.1. Beschichtung mit Kollagen Typ I 47
3.2.2.2.2. Beschichtung mit VEGF 48
3.2.2.3. Membran 49
3.2.3. Versuchstiergruppen 49
3.2.4. Experimentelle Durchführung 50
3.2.4.1. Operation 50
3.2.4.1.1. Voraussetzungen 50
3.2.4.1.2. Anästhesie 51
3.2.4.1.3. Operationsvorbereitung 51
3.2.4.1.4. Operation 53
3.2.4.1.5. Postoperative Versorgung der Tiere 59 3.2.4.2. Intravitale Fluoreszenzmikroskopie (IVM) 60
3.2.4.2.1. Aufbau der IVM-Einheit 60
3.2.4.2.2. Vorbereitung der intravitalen
Fluoreszenzmikroskopie 62
3.2.4.2.3. Untersuchungszeitpunkte 62
3.2.4.2.4. Ablauf der intravitalen Fluoreszenzmikroskopie 63 3.2.4.2.5. Mikrozirkulatorische Parameter 64
3.2.4.3. Auswertung der IVM-Aufnahmen 66
3.2.4.3.1. Gefäßdurchmesser 66
3.2.4.3.2. Gefäßpermeabilität (Makromolekulare Leakage) 66
3.2.4.3.6. Fließverhalten der Leukozyten 68
3.2.4.3.6.1. Rollende Leukozyten 68 3.2.4.3.6.2. Adhärente Leukozyten 69 3.2.4.3.7. Angiogenese 69 3.2.4.3.8. Kapillardichte 69 3.2.4.4. Versuchsende 70 3.2.5. Statistik 70 3.3. Ergebnisse 71 3.3.1. Kammerimplantation 71 3.3.2. Postoperativer Beobachtungszeitraum 71
3.3.3. VEGF-Freisetzungskinetik vom PLGA-Scaffold 71 3.3.4. Ergebnisse der intravitalen Fluoreszenzmikroskopie 72
3.3.4.1. Entzündungsreaktion 72 3.3.4.1.1. Fließverhalten der Leukozyten 72 3.3.4.1.2. Gefäßpermeabilität 78 3.3.4.2. Mikrohämodynamik 80 3.3.4.3. Angiogenese 83 3.3.4.3.1. Angiogenese-positive Felder 83 3.3.4.3.2. Kapillardichte 96 4. DISKUSSION 100
4.1. Diskussion der Ergebnisse 100
4.2. Diskussion der Methoden 105
4.2.1. Auswahl des Tiermodells 105
4.2.2. OP-Technik 108
4.2.3. Auswahl des Implantat- und Beschichtungsmaterials 109
4.2.4. Die Fluoreszenzmikroskopie 112
6. SUMMARY 118
7. LITERATURVERZEICHNIS 120
8. ANHANG 152
BMP = bone morphogenetic proteine BSA = buffered aqueous solution CAD = computer-aided design
CAM = computer-aided manufacturing CD = cluster of differentiation
CNC = computer numerical control FDM = fused deposition modeling
ELISA = enzyme-linked immunosorbent assay
FELASA = Federation of European Laboratory Animal Science Assoziation FGF = fibroblast growth factor
FITC = Fluoreszein-Iso-Thio-Cyanat flk = fetal liver kinase
flt = fms-like tyrosine kinase IGF = insulin like growth factor
IVM = intravitale Fluoreszenzmikroskopie KDR = kinase domain region
NRP1 = Neuropilin-1-Rezeptor
PBS-Puffer = phosphate buffered saline PDGF = platelet-derived growth factor PEI = Polyetherimid
PGF = placenta growth factor PGA = polyglycolic acid PLA = polylactic acid
PLGA = polylactic-co-glycolic-acid PLLA = poly-L-lactic acid
Rh6G = Rhodamin 6G ROI = region of interest
SPF = specified pathogen-free TGF = transforming growth factor
1 1 EINLEITUNG
Knochengewebe besitzt unter der Voraussetzung der Immobilisation, einer ausreichenden Durchblutung und der Abwesenheit von Infektionen die Fähigkeit zur spontanen Regeneration. Darüber hinaus darf die so genannte kritische Defektgröße (critical size Defekt) nicht überschritten werden (SCHMITZ u. HOLLINGER, 1986;
GEIGER et al., 2003). Defekte kritischer Größe können durch kongenitale Knochenanomalien, Knochentumoren und Traumata entstehen (KENLEY et al., 1993; BIDIC et al., 2003; GEIGER et al., 2003). Sie machen den Ersatz von Knochengewebe in der Medizin zur Notwendigkeit, da eine unvollständige knöcherne Heilung zu einem Funktionsverlust bis hin zu einem Verlust einer Gliedmaße führen kann (KENLEY et al., 1993).
Traditionell werden Knochentransplantate häufig osteosynthetisch fixiert und in den Defekt transplantiert, um die Knochenheilung zu fördern und strukturelle Unterstützung zu bieten (HSIONG u. MOONEY, 2006), und so die Funktion und Form wieder her zu stellen (KENLEY et al., 1993). Knochen ist nach Blut das am häufigsten transplantierte Gewebe (WAHL u. CZERNUSZKA, 2006). So werden in den USA jährlich geschätzte 500 000 bis 600 000 Knochentransplantationen durchgeführt (BUCHOLZ, 2002). Autogene Knochentransplantate, bei denen der Spender gleichzeitig auch der Empfänger ist, gelten hierbei immer noch als Goldstandard (GOLDBERG u. STEVENSON, 1987; SAILER u. WEBER, 2000;
BIDIC et al., 2003; GEIGER et al., 2003). Jedoch entsteht dabei ein zusätzlicher Entnahmedefekt mit weiteren Risiken und Schmerzen für den Patienten (Donormorbidität) (URIST et al., 1967; KENLEY et al., 1993; LANGER, 2000;
GEIGER et al., 2003; KNESER et al., 2006;). Aus diesem Grund gewinnen synthetische Knochenersatzmaterialien (URABE et al., 2007) und das Tissue Engineering zunehmend an Bedeutung.
Das interdisziplinäre medizinische Forschungsfeld des Tissue Engineerings, das Ingenieurs-, Natur- und Biowissenschaften miteinander vereint, etablierte sich in den neunziger Jahren des vergangenen Jahrhunderts (LANGER u. VACANTI, 1993;
LANGER, 2000). Ziel dieses Forschungsbereiches ist die Herstellung von funktionell
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lebenden Ersatzgeweben und Organen in vitro, um die Funktion von erkranktem oder zerstörtem Gewebe zu regenerieren, aufrecht zu erhalten oder zu verbessern (LANGER u. VACANTI, 1993; LANGER, 2000; EWERS et al., 2003; HSIONG u.
MOONEY, 2006). Damit bietet das Tissue Engineering eine alternative Methode zur autogenen Knochentransplantation, die über das Bereitstellen von „Ersatzteilen“
hinaus geht (KNESER et al., 2000).
Die beim Tissue Engineering entwickelten Knochenersatzkonstrukte bestehen aus synthetischen oder natürlichen, porösen und biodegradierbaren Gerüstsubstanzen, den so genannten Scaffolds, die in ihrem Aufbau der körpereigenen knöchernen extrazellulären Matrix entsprechen und vor der Implantation in vitro mit Zellen besiedelt werden (LANGER, 2000; EWERS et al., 2003; AHSAN u. NEREM, 2005).
Durch diese dreidimensionalen Trägergerüste bleiben den Zellen während der Proliferation bei der Kultivierung im Brutschrank wichtige Differenzierungseigenschaften erhalten (EWERS et al., 2003). Die Scaffolds können während der ersten Wochen nach der Implantation in das Defektgebiet mechanische Stabilität bieten (LANGER u. VACANTI, 1993; HOLLISTER, 2005) und können schrittweise abgebaut werden, so dass nach vollständiger Resorption das mittels Tissue Engineering hergestellte Gewebe zurück bleibt, das in seiner Größe und seiner Konfiguration den Gegebenheiten des Defektes entspricht (EWERS et al., 2003).
Knochen ist ein hoch vaskularisiertes Gewebe, das durch die Blutgefäße mit Sauerstoff, aber auch mit den benötigten Nährstoffen, zirkulierenden osteogenetischen Faktoren und Stammzellen versorgt wird (HSIONG u. MOONEY, 2006). Für das Überleben und die Integration der mittels Tissue Engineering hergestellten Knochenkonstrukte ist die mikrovaskulare Versorgung demnach entscheidend (WINET, 1996; LANGER, 2000). Der Sauerstofftransport von den Blutgefäßen in das umgebende Gewebe kann allerdings nur über eine Diffusionsstrecke von 150 bis 200 µm erfolgen, so dass nur die Zellen auf der Oberfläche des Konstruktes versorgt werden können (FOLKMAN u. HOCHBERG, 1973; CARMELIET u. JAIN, 2000; MACARTHUR et al., 2004). Für die Zellen im Zentrum des Scaffolds ist eine rasche Gefäßeinsprossung von großer Bedeutung,
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um ihr Überleben und ihren Funktionserhalt zu sichern (LASCHKE et al., 2008). Das initiale ischämische Zeitfenster sollte demnach so klein wie möglich gehalten werden (DRUECKE et al., 2004).
Eine vollständige Vaskularisation selbst von porösen Scaffolds von wenigen Millimetern Größe erfolgt jedoch frühestens ein bis zwei Wochen nach der Implantation (DRUECKE et al., 2004; RÜCKER et al., 2006).
Um dieses Problem zu bewältigen und den Prozess der Vaskularisation zu beschleunigen wurden bereits angiogen aktive Wachstumsfaktoren in das Scaffoldmaterial integriert (LASCHKE et al., 2006) bzw. Scaffolds mit vascular endothelial growth factor (VEGF) enthaltendem Matrigel bestückt (LASCHKE et al., 2008). Die Untersuchen ergaben, dass die Wachstumsfaktoren das Einwachsen von neuen Gefäßen in das Scaffoldmaterial beschleunigen und sich daraufhin ein Gefäßnetzwerk mit einer, im Vergleich zu der Kontrollgruppe, erhöhten Kapillardichte bildete (LASCHKE et al., 2008).
Um die Angiogenese und Vaskularisation der Konstrukte in vivo zu untersuchen ist ein passendes Modell erforderlich. Hier bietet sich die Intravitalmikroskopie an, die es ermöglicht, mikrozirkulatorische Parameter in vivo zu untersuchen (SUMEN et al., 2004; HALIN et al., 2005). Bisher findet sie hauptsächlich Anwendung bei der Untersuchung von Weichgeweben wie Haut und Muskel (LASCHKE et al., 2008).
Um die Eignung von Knochenersatzmaterialien abschätzen zu können, muss deren initiale Integration und Vaskularisation in einer knöchernen Umgebung untersucht werden. Kürzlich wurde ein Modell beschrieben, das die Beobachtung knöcherner Angiogenese am Femur, einem chondral ossifizierenden Knochen, erlaubt (HANSEN-ALGENSTAEDT et al., 2005). Für chondralen und desmalen Knochen werden jedoch verschiedene Abläufe der Osteogenese und Frakturheilung beschrieben (SCHMITZ u. HOLLINGER, 1986) und für die Rekonstruktion von craniomaxillofacialen Defekten sind detaillierte Informationen über die Inkorporation und knöcherne Integration in desmalen Knochen erforderlich.
Ein Modell für die in vivo Untersuchung der Integration und Vaskularisation von desmalem Knochen existiert bislang nicht. Daher ist es das Ziel dieser Arbeit, ein Modell für die intravitale fluoreszenzmikroskopische Untersuchung von Defekten der
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Schädelkalotte zu entwickeln und zu etablieren, das die Untersuchung der Vaskularisation von implantierten Tissue Engineering-Konstrukten erlaubt. Folgende Aspekte des Tissue Engineerings im Schädelkalottenbereich sollten dabei untersucht werden:
1. Die Reaktion desmalen Knochens auf die Implantation von Ersatzmaterialien hinsichtlich mikrohämodynamischer Eigenschaften (Gefäßdurchmesser, Fließgeschwindigkeit der Erythrozyten), entzündlichen Parametern (rollende und adhärente Leukozyten, Gefäßpermeabilität) sowie einer reaktiven Angiogenese (Angiogenese, funktionelle Kapillardichte).
2. Die Verbesserung der Vaskularisation der Ersatzmaterialien durch eine Beschichtung mit VEGF.
5 2 LITERATURÜBERSICHT
2.1 Osteogenese
Bei der Knochenentwicklung unterscheidet man zwischen der chondralen (indirekten) Verknöcherung und der desmalen (direkten) Ossifikation.
2.1.1 Chondrale Ossifikation
Bei der chondralen Ossifikation wird das knorpelige Vorläuferskelett zum großen Teil umgewandelt und ausgehend von den sogenannten Ossifikationszentren durch ein knöchernes Skelett ersetzt, so dass ein unreifer Geflechtknochen entsteht.
Während der weiteren Knochenentwicklung und funktionellen Belastung wird der Geflechtknochen im Rahmen des Remodellings wiederum durch einen reifen Lamellenknochen ersetzt. Der größte Teil des adulten Skelettes entsteht durch diese Form der Ossifikation (z.B. Wirbel, lange Röhrenknochen, Becken) (KÖNIG u.
LIEBICH, 2009).
2.1.2 Desmale Ossifikation
Bei der desmalen Ossifikation entsteht der Knochen direkt aus dem mesenchymalen Bindegewebe ohne die knorpeligen Zwischenstufen. Zu diesen so genannten Bindegewebsknochen zählen zum Beispiel die einzelnen Deckknochen des Schädels (KÖNIG u. LIEBICH, 2009).
Aus den undifferenzierten Mesenchymzellen entwickeln sich über Präosteoblasten die maturen Osteoblasten, die eine unverkalkte Knochenmatrix, das Osteoid, synthetisieren (KÖNIG u. LIEBICH, 2009; HSIONG u. MOONEY, 2006). Die Osteoblasten selbst sind in das Osteoid gebettet. Die Mineralisierung des Osteoids erfolgt über Blutgefäße, es werden anorganische Bestandteile wie Calciumphosphat (85 – 90 %), Calciumcarbonat (8 – 10 %), Magnesiumphosphat (1,5 %) und
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Calciumfluorid (0,3%) eingelagert (KÖNIG u. LIEBICH, 2009) die letztendlich 60 – 70
% der Gesamtmatrix ausmachen (SOMMERFELDT u. RUBIN, 2001).
Organische Knochengrundsubstanzen wie Kollagen Typ I (90%), Glykosaminoglykane und Proteoglykane (z. B.: Chondroitin-4-sulfat) werden zusätzlich in die Knochenmatrix eingeschlossen und machen insgesamt 25 – 30 % der Gesamtmatrix aus (SOMMERFELDT u. RUBIN, 2001). Diese dienen bei der Mineralisierung des Knochens als Kristallisationskern für die Anlagerung der anorganischen Bestandteile (KÖNIG u. LIEBICH, 2009).
Nach der Mineralisierung der Knochengrundsubstanz wandeln sich die Osteoblasten in Osteozyten um und verbleiben im Knochengewebe (KÖNIG u. LIEBICH, 2009).
2.2 Aufbau des Schädels
2.2.1 Knöcherne Schädeldecke
Die platten Knochen der Schädeldecke werden aus zwei kompakten Knochentafeln gebildet (Tabula externa und Tabula interna), die einen mit Spongiosa gefüllten Hohlraum umschließen (KÖNIG u. LIEBICH, 2009).
Eine der Aufgaben des Knochens besteht in der strukturellen Unterstützung, d.h. der Schutz-, Stütz- und Haltefunktion, des Körpers (SALGADO et al., 2004). Die Knochen des Schädels übernehmen eine Schutzfunktion für das Innenohr, für das Gehirn im Bereich des Neurocraniums sowie für die Gesichtseingeweide wie die Augen, die Nase und den Mundraum durch das so genannte Viscerocranium. Wie alle anderen Körperknochen beteiligen sie sich an der Hämatopoese und am Mineralstoffhaushalt des Körpers (KÖNIG u. LIEBICH, 2009).
Knochen ist ein dynamisches, hoch vaskularisiertes Gewebe, das zeitlebens einem belastungsabhängigen adaptiven Umbau unterliegt, ohne dass dabei oder bei Heilungsvorgängen Narben entstehen (KÖNIG u. LIEBICH, 2009; SOMMERFELDT u. RUBIN, 2001).
Die flachen Knochen der Schädeldecke sind nur zu 10 % porös (SIKAVITSAS et al., 2001).
7 2.2.2 Das Periost
Das Periost ist eine bindegewebige Hülle, die die äußere Oberfläche des Knochens fast vollständig umgibt, davon ausgenommen sind lediglich Gelenkknorpel und viele Muskelansätze. Das Periost setzt sich aus einer äußeren Faserhaut (Stratum fibrosum) und einer inneren zellreichen Kambiumschicht (Stratum osteogenisum) zusammen. In letztere sind zahlreiche sensible Nervenfasern und ein dichtes Netz an Blut- und Lymphgefäßen eingeschlossen, so dass die metabolische und sensible Versorgung des Knochens gewährleistet wird. Außerdem ist diese Schicht des Periosts in der Lage während des Knochenwachstums, beim physiologischen Knochenumbau und bei der Frakturheilung neues Knochengewebe zu bilden (KÖNIG u. LIEBICH, 2009).
2.2.3 Die Dura mater encephali
Die Dura mater ist eine von drei übereinanderliegenden bindegewebigen Hüllen, die das gesamte Zentralnervensystem umgeben. Nach außen verschmilzt die Dura mater encephali mit dem Periost auf der Innenseite der Schädelknochen. Nach innen bildet die Dura mater kräftige Falten, in denen große, venöse Blutleiter (Sinus durae matris) verlaufen. Die Großhirnsichel (Falx cerebri) ragt zwischen die beiden Hälften des Großhirns und führt den Sinus sagittalis dorsalis, der das Blut aus den dorsalen Abschnitten der Großhirnhemisphären und aus den Knochen der Schädeldecke sammelt. Kaudal geht die Falx cerebri quer in das Kleinhirnzelt (Tentorium cerebelli membranaceum) über, das die Sinus transversi, die sich aus dem Sinus sagittalis dorsalis bilden, aufnimmt und das Blut aus den Kleinhirnvenen sammelt (KÖNIG u.
LIEBICH, 2009).
Die Vaskularisation der Dura mater encephali selbst erfolgt über Meningealarterien (KÖNIG u. LIEBICH, 2009).
Die Dura mater ist – wie auch die anderen bindegewebigen Hüllen des zentralen Nervensystems – sehr gut innerviert und aus diesem Grund hochgradig
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schmerzempfindlich, im Gegensatz zu dem darunter liegenden Gehirn (KÖNIG u.
LIEBICH, 2009).
2.3 Knochendefekte
2.3.1 Defekt kritischer Größe (critical size defect, CSD)
Ein Defekt kritischer Größe liegt vor, wenn der kleinste Defekt in einem Knochen bis zum Ende der Lebenszeit des Tieres nicht spontan heilen wird (SCHMITZ u.
HOLLINGER, 1986). Anstatt Knochen bildet sich bei der versuchten Heilung eines critical size Defektes fibröses Gewebe (TAKAGI u. URIST, 1982), der betroffene Knochen verliert an Form und Funktion (KENLEY et al., 1993).
AALAMI et al. (2004) zeigten, dass Knochendefekte mit einer Größe von drei bis fünf Millimeter bei adulten Mäusen (> 60 Tage) als critical size Defekt gelten, da diese Defekte nach acht Wochen eine Heilungsrate von unter fünf Prozent aufwiesen.
2.3.2 Knochenheilung
2.3.2.1 Allgemeine Vorgänge bei der Knochenheilung
Während der Knochenheilung muss der traumatisierte Knochen verschiedene Stadien durchlaufen. Eine Unterbrechung der Mikrozirkulation bei einer beeinträchtigten Knochenintegrität führt zur Hypoxie und damit zu Zelltod und Nekrosen in dem Gewebe, das den Knochen umgibt (WINET, 1996; GLOWACKI, 1998). Die Rekonstruktion der Blutzirkulation durch das Einsprossen von Gefäßen aus dem umgebenden lokalen Knochen- und Weichgewebe in das Defektgebiet ist eines der ersten Ereignisse während der Frakturheilung (WINET, 1996; GLOWACKI, 1998) und für die ungestörte Osteogenese entscheidend (TRUETA, 1963). Die Angiogenese im Knochen beginnt innerhalb der ersten zwei Tage nach dem stimulativen Trauma (FOLKMAN u. SHING, 1992; RISAU, 1997).
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Die während der Angiogenese entstehenden Blutgefäße sind für die erfolgreiche Versorgung des Defektgebietes mit Nährstoffen notwendig. Sie dienen außerdem als Transportweg für Makromoleküle und migrierende Zellen und sie regulieren die metabolische Mikroumgebung (HANSEN-ALGENSTAEDT et al., 2006). Eine inadäquate Knochendurchblutung führt zu einer ungenügenden Knochenbildung und Knochenmasse (CARANO u. FILVAROFF, 2003).
Bei der Extravasation der Zellen und Substrate in die interstitielle Matrix spielen mechanische und funktionelle Eigenschaften der Blutgefäße (Scherkräfte, Gefäßpermeabilität, Leukozyten-Endothel-Interaktion) eine entscheidende Rolle (FUKUMURA et al., 1997; ALGENSTAEDT et al., 2003). Die erhöhten metabolischen Anforderungen während der Knochenheilung erfordern eine erhöhte Blutflussrate und eine erhöhte funktionelle Kapillardichte (RHEE et al., 1996).
Bei der Reparatur ischämischer Gewebe bzw. bei der Wundheilung kommen demnach Endothelzellen, ihren Vorläuferzellen, aber auch Wachstumsfaktoren wie dem vascular endothelial growth factor (VEGF) eine entscheidende Bedeutung zu (HSIONG u. MOONEY, 2006). Wachstumsfaktoren, die die Aniogenese stimulieren, fördern gleichzeitig auch die Knochenheilung und -regeneration (HSIONG u.
MOONEY, 2006).
Bei der sich anschließenden inflammatorischen Phase migrieren Makrophagen und neutrophile Granulozyten zur Defektstelle (KENLEY et al., 1993; LI et al., 2003). Sie beseitigen Mikroorganismen und Abfallmoleküle und exprimieren biochemische Mediatoren, die eine fibroblastische und angiogene Antwort auslösen. Nach ungefähr zwei Wochen kommt es zur Bildung des so genannten weichen Kallus, einem hoch zellulären und aktiven, kollagenen Material, das den Frakturspalt durchspannt und sich durch Knorpelbildung und Revaskularisation auszeichnet. In dem Material sind Chondrozyten und Osteoprogenitorzellen zu finden. Nach knapp zwei Monaten ist die Bildung des weichen Kallus abgeschlossen und die Kollagen-I-Matrix kalzifiziert (KENLEY et al., 1993; LI et al., 2003). In dieser Phase des harten Kallus differenzieren die Osteoblasten und produzieren Osteoid. Der kalzifizierte Knorpel wird langsam resorbiert und es bildet sich Knochengewebe. In der sich
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anschließenden Phase des Umbaus erlangt der Frakturbereich seine normale Kontur und Stärke wieder (KENLEY et al., 1993).
2.3.2.2 Die Rolle der osteogenen Strukturen bei der Knochenheilung
An den Heilungsvorgängen von Knochendefekten im Schädelbereich sind Periost, der umgebende gesunde Knochen sowie die Dura mater beteiligt (AALAMI et al., 2004). Der Dura mater kommt dabei eine entscheidende Rolle zu (GREENWALD et al., 2000 a). Es konnte jedoch nicht gezeigt werden, dass das Periost oder die knöchernen Defektränder allein in der Lage sind, einen Defekt der Schädeldecke vollständig zu regenerieren (UDDSTRÖMER, 1978; HOBAR et al., 1993; WANG u.
GLIMCHER, 1999).
ÖZERDEM et al. (2003) isolierten bei Defekten kritischer Größe der Schädeldecke von Ratten die osteogenen Gewebe durch eine Polytetrafluoroethylenmembran voneinander. Die histologischen und radiologischen Untersuchungen ergaben, dass die periostale Reaktion offensichtlicher war und die zelluläre Wiederbevölkerung augenscheinlicher, wenn die Dura mater nicht isoliert wurde und somit beide Strukturen am Heilungsprozess beteiligt waren. Ohne die Unterstützung der Dura mater und des Periosts war der angrenzende gesunde Knochen nur in der Lage eine begrenzte Neovaskularisation und Knochenentwicklung hervorzurufen. Das lässt darauf schließen, dass die Dura den angrenzenden gesunden Knochen und das Periost stimuliert und Dura und Periost gegenseitig interagieren (ÖZERDEM et al., 2003).
Die Arbeitsgruppe um HOPPER et al. (2001) zeigte, dass die Vaskularisation und Kalzifizierung von Defekten in der Schädeldecke von adulten Kaninchen abnahm, wenn die Dura und/oder das Periost isoliert wurde.
MARDAS et al. (2002) trennten die Dura mater von der knöchernen Schädeldecke durch eine poröse e-Polytetrafluoroethylen-Membran, die für Wachstumsfaktoren der Dura mater durchlässig ist. Es zeigte sich, dass von den knöchernen peripheren Strukturen des Defektes eine Heilung ausging. Wurde die Dura jedoch durch eine nicht permeable Membran isoliert (WANG u. GLIMCHER, 1999), erfolgte keine
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Beteiligung der knöchernen Grenzen an der Defektheilung. Dies ließ darauf schließen, dass die Dura in der Lage ist eine osteogene Antwort der knöchernen Defektränder hervorzurufen, in dem sie Progenitorzellen zur Proliferation und Differenzierung veranlasst (AALAMI et al., 2004).
2.3.3 Juvenile und adulte Knochenheilung
Bei jungen Kindern (unter zwei Jahren) und Tieren heilen Defekte der Schädelkalotte besser als bei adulten Lebewesen, bei denen nur eine insuffiziente Heilung mit der Entstehung eines fibrösen Ersatzgewebes stattfindet (HOBAR et al., 1993; HOBAR et al., 1996; GREENWALD et al., 2000 a, b).
Verschiedene in vitro Versuche an juvenilem und adultem duralen Gewebe zeigten, dass juvenile durale Zellen signifikant schneller proliferieren als adulte und dass sie außerdem – im Gegensatz zu den adulten Zellen – in der Lage sind, osteogene Wachstumsfaktoren und extrazelluläre Matrixmoleküle zu exprimieren und zelluläre Elemente (Osteoblasten) für die erfolgreiche Reossifikation im Schädelbereich bereit zu stellen (GREENWALD et al., 2000 a, b).
AALAMI et al. (2004) untersuchten diesbezüglich Defekte mit einem Durchmesser von 3, 4 und 5 mm in der Schädelkalotte von sechs Tage alten (juvenilen) und 60 Tage alten (adulten) männlichen CD-1 Mäusen. Nach der Euthanasie der Tiere acht Wochen nach dem Setzen des Defektes erfolgten entsprechende röntgenologische und histologische Untersuchungen. Dabei zeigte sich, dass die juvenilen Tiere im Vergleich zu den adulten Tieren eine signifikant höhere Fähigkeit besaßen die Defekte zu reossifizieren. Die Defekte der juvenilen Tiere waren nach diesem Zeitraum kleiner und formloser, sie zeigten zentrale isolierte Knocheninseln und Knochenbildung im peripheren Defektgebiet. Zum Teil erfolgte sogar die Bildung von Knochenbrücken. Die Defekte mit einem Durchmesser von 4 mm heilten zu 65 %.
Die Defekte bei den adulten Tieren jedoch behielten ihre runde Form bei und zeigten nur eine geringgradige periphere Heilung an den Defekträndern, so dass bei ihnen eine Heilungsrate von weniger als fünf Prozent ermittelt wurde.
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Die juvenile Dura mater, die eine signifikant höhere Fähigkeit zur Proliferation und Knochenbildung zeigt als die adulte Dura (GREENWALD et al., 2000 a, b), erlaubt also augenscheinlich den jungen Tieren eine erfolgreiche Heilung (AALAMI et al., 2004).
2.4 Neovaskularisation, Vaskulogenese und Angiogenese
2.4.1 Das Gefäßsystem
Das adulte Gefäßsystem besteht aus großen Arterien, die sich in immer kleinere Gefäßäste aufteilen und schließlich in präkapillare Arteriolen überleiten, die in Kapillaren münden. Die Kapillaren gehen in postkapillare Venolen über, die sich dann nach und nach zu größeren venösen Strukturen vereinigen (YANCOPOULOS et al., 1998).
Kapillarwände bestehen nur aus Endothelzellen, während größere Gefäße von muralen Zellen (Perizyten bei Venolen, glatte Muskelzellen bei den größeren Gefäßen) umgeben sind (CARMELIET, 2003).
Das Endothel der großen Gefäße kontrolliert über Interaktion mit Muskelzellen der Gefäßwand die Vasokonstriktion und -dilatation und hat somit Einfluss auf den Blutdruck und andere physiologische Parameter. Das Endothel der Mikrogefäße ist für den Austausch von Sauerstoff und Nährstoffen zwischen dem Blut und dem Gewebe und für die Neovaskularisation verantwortlich (RISAU, 1995).
2.4.2 Neovaskularisation
Die Neovaskularisation kann in zwei generelle Prozesse eingeteilt werden: Die Vaskulogenese und die Angiogenese (UCUZIAN u. GREISLER, 2007). Bislang wurde angenommen, dass sich die Vaskulogenese auf die Embryonalzeit beschränkt. Inzwischen wurde jedoch erkannt, dass sowohl während der embryonalen Entwicklung als auch im adulten Organismus während der
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Neovaskularisation die Prozesse der Angiogenese und Vaskulogenese simultan ablaufen (UCUZIAN u. GREISLER, 2007).
2.4.2.1 Vaskulogenese
Bei der Vaskulogenese erfolgt die de novo Bildung von Blutgefäßen durch endotheliale Progenitorzellen beim Gefäßwachstum im Embryo sowie in ischämischen, kranken oder entzündeten Geweben des adulten Organismus (CARMELIET, 2003). Endotheliale Vorläuferzellen kommen nicht nur im Embryo, sondern auch im Knochenmark und im peripheren Blut der adulten Lebewesen vor (TAKAHASHI et al., 1999; CARMELIET, 2000) und werden durch verschiedene Wachstumsfaktoren wie z.B. VEGF aber auch durch Ischämie zur Differenzierung und Mobilisation stimuliert (RISAU, 1995; RISAU, 1997; TAKAHASHI et al., 1999;
PEICHEV et al., 2000).
Durch die Vaskulogenese wird ein primitives Netzwerk aus Blutgefäßen geformt, das durch die sich anschließende Angiogenese expandiert und umgebaut wird, so dass ein reifes Blutgefäßsystem entsteht (FOLKMAN u. SHING, 1992; CARMELIET, 2000).
2.4.2.2 Angiogenese
Während der Angiogenese werden aus bereits bestehenden Gefäßen neue Kapillaren gebildet (FOLKMAN u. SHING, 1992; UCUZIAN u. GREISLER, 2007). Bei dem Prozess sprossen entweder vaskulare Endothelzellen in das umgebende Gewebe aus oder ein bestehendes Gefäßlumen wird durch das Einfügen eines Gewebepfeilers aus periendothelialen Zellen (Intussuszeption, s. Kap. 2.4.2.2.2) oder durch transendotheliale Zellbrücken geteilt (CARMELIET, 2000; PATAN, 2000;
RÜCKER et al., 2006).
Im normalen adulten Gewebe (Haarzyklus und weiblicher Geschlechtszyklus ausgenommen) liegen die Endothelzellen im Ruhezustand vor (MARX et al., 1994; LI
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et al., 2003). Die Proliferation der ruhenden Endothelzellen wird durch die Perizyten über Zell-Zell-Kontakte inhibiert (FOLKMAN u. SHING, 1992). Bei verschiedenen pathologischen Prozessen, wie der Wundheilung, der chronischen Entzündung oder proliferativen Prozessen bei der Knochenreparatur, kann die Angiogenese jedoch induziert werden (FOLKMAN u. SHING, 1992; MARX et al., 1994; RISAU, 1997;
PATAN, 2000; HANSEN-ALGENSTAEDT et al., 2003; LI et al., 2003).
Die Regulation der Angiogenese erfolgt über Signale aus dem Serum und aus der umgebenden extrazellulären Matrix (RISAU, 1997; KLEINHEINZ et al., 2005).
Gewebehypoxie, Laktatanreicherung, biogene Amine und Cytokine können die Angiogenese stimulieren (REMENSNYDER u. MAJNO, 1968). Die neu entstandenen Gefäße sind Teil des provisorischen Granulationsgewebes und versorgen das wachsende Gewebe mit Nährstoffen und Sauerstoff. Zusätzlich können über diese Gefäße Entzündungszellen (Makrophagen, Leukozyten, Mastzellen, etc.) zur Wunde gelangen (CARMELIET, 2000; LI et al., 2003), die zusätzlich angiogene Faktoren wie VEGF sezernieren (SUNDERKÖTTER et al., 1994).
2.4.2.2.1 Der Prozess des Sprossens
Zu Beginn der Angiogenese erfolgt eine Vasodilatation der elterlichen Venole (FOLKMAN u. SHING, 1992; CARMELIET, 2000). Durch VEGF werden die interendothelialen Zellkontakte gelockert, proteolytische Enzyme führen zur Degradation der Basalmembran und die Gefäßpermeabilität steigt. Es kommt zur Extravasation von Plasmaproteinen, die zusammen mit der extrazellulären Matrix ein vorläufiges Gerüst für die Endothelzellen bilden, die zum angiogenen Stimulus hin migrieren (AUSPRUNK u. FOLKMAN, 1977; WITT u. LANDER, 1994; DVORAK et al., 1995; GLOWACKI, 1998; FENG et al., 1999; CARMELIET, 2000; CARMELIET, 2003;). Dort angekommen reihen sich die Endothelzellen aneinander und es kommt zur interzellulären oder intrazellulären Lumenbildung (AUSPRUNK u. FOLKMAN, 1977; UCUZIAN u. GREISLER, 2007). Die Endothelzellen, die von der führenden Spitze der Sprosse entfernt sind, unterlaufen mitotischen Teilungen (AUSPRUNK u.
FOLKMAN, 1977). Noch enden die so gebildeten tubulären Gebilde blind
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(AUSPRUNK u. FOLKMAN, 1977; FOLKMAN u. SHING, 1992; CARMELIET, 2003).
Nach und nach verbinden sich die individuellen Sprossen untereinander, es werden Schleifen gebildet und die Perfusion des neuen Gefäßes setzt ein (AUSPRUNK u.
FOLKMAN, 1977; CARMELIET, 2003; UCUZIAN u. GREISLER, 2007). Schließlich bilden die Endothelzellen eine neue Basalmembran und sezernieren Schlüsselfaktoren wie z.B. Angiopoietin-1 um glatte Muskelzellen und Perizyten zu rekrutiert, die die neu geformten Blutgefäße stabilisieren und unterstützen (AUSPRUNK u. FOLKMAN, 1977; FOLKMAN u. D’AMORE, 1996; RISAU, 1997;
LINDAHL et al., 1998; CARMELIET, 2000; ALLT u. LAWRENSON, 2001).
2.4.2.2.2 Der Prozess des intussuszeptiven mikrovaskularen Wachstums Diese Form der Angiogenese erfolgt vor allem bei venösen Gefäßen und Kapillaren (Abb. 1). Durch Retraktion der endothelialen Schicht der Gefäße entsteht eine intraluminale Gewebefalte (A), die sich anschließend in das Gefäßlumen hinein streckt und dünner wird (B, C) bis sich die beiden entgegengesetzten endothelialen Schichten wieder berühren (D). Ihre Zellmembranen fusionieren, so dass die intraluminale Spitze der Gewebefalte eine freie intraluminale Gewebestruktur formt (E, F). Durch Wiederholung dieser Vorgänge, können auch mehrere freie intraluminale Gewebestrukturen entstehen (G, H, I). Die Endothelzellen multiplizieren sich und eine Basalmembran wird gebildet. Der Flow wird während dieser Schritte nicht unterbrochen (PATAN et al., 1996; PATAN et al., 1997; PATAN, 2000).
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Abb. 1: Intussuszeptives mikrovaskulares Wachstum (aus PATAN, 2000).
2.4.2.2.3 Angiogenese-Faktoren
Die so genannten Angiogenese-Faktoren stimulieren die Proliferation und Migration von Endothelzellen über entsprechende Oberflächenrezeptoren. Sie haben somit einen entscheidenden Einfluss auf die Angiogenese (NEUFELD et al., 1999). Die meisten Leukozyten-Subtypen produzieren eine Vielzahl von Angiogenese-Faktoren (NORRBY, 2002). Bislang gibt es acht angiogenetisch aktive Polypeptide, die vollständig gereinigt, sequenziert und geklont wurden. Diese unterscheiden sich hinsichtlich ihrer biochemischen und biologischen Eigenschaften und wirken auf unterschiedliche Zielzellen ein (FOLKMAN u. SHING, 1992). Einer dieser angiogenen Faktoren ist der vascular endothelial growth factor (VEGF), der eine bedeutende Rolle bei der Neovaskularisation spielt (NEUFELD et al., 1999).
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2.4.2.2.3.1 Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)
VEGF wird von einer Vielzahl an Zelltypen (z.B. Fibroblasten, Makrophagen, Osteoblasten, Keratinozyten) produziert und sezerniert (GOAD et al., 1996;
FERRARA u. DAVIS-SMITH, 1997; NISSEN et al., 1998; GERBER u. FERRARA, 2003) und ist ein zellspezifischer Wachstumsfaktor (KLEINHEINZ et al., 2005).
Die VEGF-Familie beinhaltet sechs ähnliche Proteine: VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E und den placenta growth factor (PGF). Durch Splicing entstehen aus VEGF-A multiple Isoformen (VEGF121, VEGF165, VEGF189 und VEGF209 beim Menschen), die sich in ihrer Aminosäurenanzahl, ihrer Molekularmasse und in ihrer Fähigkeit an Heparan-Sulfat-Proteoglykane auf der Zelloberfläche zu binden unterscheiden (CROSS u. CLAESSON-WELSH, 2001; LI et al., 2003; ROBINSON u.
STRINGER, 2001). Die Isoform VEGF165 ist dabei der häufigste Vertreter (GERBER u. FERRARA, 2003). Die kleineren Isoformen werden in löslicher Form sezerniert, während dessen die größeren Isoformen mit ihren transmembranen Domänen mit den Zellen assoziiert bleiben bis sie durch Proteolyse freigesetzt und aktiviert werden (LI, et al., 2003). Die meisten Zellen produzieren gleichzeitig verschiedene VEGF- Isoformen (NEUFELD et al., 1999).
2.4.2.2.3.1.1 VEGF-Rezeptoren (VEGFR)
Die Wirkung von VEGF wird über drei spezifische transmembrane Tyrosin-Kinase- Rezeptoren vermittelt, die sich an der Zelloberfläche befinden (CROSS u.
CLAESSON-WELSH, 2001): VEGFR-1 (Flt-1), VEGFR-2 (KDR oder Flk-1) und VEGFR-3 (Flt-4).
VEGFR-1 und VEGFR-2 werden hauptsächlich auf Endothelzellen exprimiert, sie kommen aber auch auf Hämatoblasten und embryonalen endothelialen Vorläuferzellen vor (YAMAGUCHI et al., 1993; MILLAUER, 1994; RISAU, 1997;
RIBATTI, 2004). Sie beteiligen sich an der Regulation der Angiogenese, Vaskulogenese, Hämatopoese und an pathologischen Prozessen, die mit einer Neovaskularisation verbunden sind (QUINN et al., 1993; FONG et al., 1995;
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NEUFELD et al., 1999; ROBINSON u. STRINGER, 2001; GERBER u. FERRARA, 2003).
VEGFR-1 hat die höchste Affinität für VEGF (QUINN et al., 1993) und wird auf ruhenden und proliferierenden Endothelien in adulten und embryonalen Geweben sowie während der Neovaskularisation von heilenden Hautwunden exprimiert (PETERS et al., 1993; ROBINSON u. STRINGER, 2001). Trotzdem ist nicht VEGFR- 1 für die Erhaltung der Endothelzellen verantwortlich, wie ursprünglich angenommen, sondern VEGFR-2 (GERBER et al., 1998).
Die Expression von VEGFR-2 erfolgt von endothelialen und hämatopoetischen Vorläuferzellen sowie von Endothelzellen (ROBINSON u. STRINGER, 2001). Im ruhenden adulten Gefäßsystem ist VEGFR-2 mRNA herunter reguliert (QUINN et al., 1993). VEGFR-2 führt zur Mitogenese, Angiogenese, Permeabilitätssteigerung, Chemotaxis und Veränderungen in der Zellmorphologie (QUINN et al., 1993;
FERRARA u. DAVIS-SMYTH, 1997; YANCOPOULOS et al., 2000).
Die entscheidende Bedeutung der beiden Rezeptoren bei der Vaskulogenese zeigte sich an Gen-Knockout-Untersuchungen an Mäusen: Die Inaktivierung von VEGFR-1 und/oder VEGFR-2 führte zur abnormalen Blutgefäßbildung und zur embryonalen Letalität (FONG et al., 1995; SHALABY et al., 1995; FERRARA et al., 1996). Dabei zeigte sich, dass Mäuseembryos mit homozygoten Mutationen im Flt-1-(VEGFR-1)- Lokus starben, weil sich die Endothelzellen zwar entwickelten, jedoch kein normales Gefäßsystem formten. Mäuse mit inaktivierten VEGFR-2-Genen waren nicht zur Vaskulogenese fähig und konnten keine Blutinseln bilden (FONG et al., 1995;
SHALABY et al., 1995)
Die Expression von VEGFR-1 und VEGFR-2 wird durch Hypoxie beeinflusst (FERRARA u. DAVIS-SMITH, 1997; NEUFELD et al., 1999;).
VEGFR-3 wird auf adulten lymphatischen Endothelien gefunden. Ligand ist hier nicht VEGF-A, sondern VEGF-C (JOUKOV et al., 1996).
Ein weiterer Rezeptor, der nur VEGF165 bindet, ist der VEGF165-Rezeptor, der mit dem humanen Neuropilin-1-Rezeptor (NRP1) identisch ist und sowohl auf Endothelzellen als auch auf verschiedenen Tumorzellen vorkommt (SOKER et al., 1998). NRP1 agiert als Korezeptor für VEGF165 und verstärkt dessen Bindung an
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VEGFR-2 und damit dessen chemotaktische und mitogene Aktivität (SOKER et al., 1998).
2.4.2.2.3.1.2 Funktionen von VEGF
Die Antwort auf VEGF ist sehr heterogen (RIBATTI, 2004). Primäre Zielzellen sind Endothelzellen, bei denen VEGF das Überleben, die Proliferation, die Migration und die Differenzierung stimuliert (GERBER et al, 1998; NEUFELD et al., 1999; CROSS u. CLAESSON-WELSH, 2001; GERBER u. FERRARA, 2003). Gleichzeitig wird durch VEGF die Zellapoptose verhindert (DVORAK et al., 1995). VEGF hat einen chemotaktischen Effekt (NEUFELD et al., 1999) und stimuliert die Endothelzellen zur Expression von Proteasen, die die Basalmembran degradieren, so dass die Endothelzellen migrieren, proliferieren und differenzieren können um neue Blutgefäße zu formen (PATAN, 2000; CROSS u. CLAESSON-WELSH, 2001;
GERBER u. FERRARA, 2003).
Hypoxie (SHWEIKI et al., 1992; NEUFELD et al., 1999; CROSS u. CLAESSON- WELSH, 2001; SEMENZA, 2007), Hypoglykämie, aktivierte Onkogene und verschiedene Zytokine und Wachstumsfaktoren können die Expression von VEGF auslösen und haben somit einen indirekt angiogenetischen Effekt (NEUFELD et al., 1999; ROBINSON u. STRINGER, 2001). Normalerweise werden Zellen durch Diffusion mit Sauerstoff versorgt. Wird das Gewebe zu groß, kann über die Diffusion keine optimale Versorgung der Zellen gewährleistet werden und es kommt zur Bildung von Hypoxie-induzierbaren Transkriptionsfaktoren (HIF), die viele angiogene Gene hoch regulieren, unter anderem auch VEGF (CARMLIET, 2003). Das VEGF bindet dann an die VEGF-Rezeptoren auf den Endothelzellen und stimuliert über Signaltransduktionswege die Zellen zur sprossenden Angiogenese (SEMENZA, 2007). Gleichzeitig kann VEGF in ischämischen Geweben die Mobilisation von heterogenen angiogenen Zellpopulationen aus dem Knochenmark (z.B.
endothelialen Vorläuferzellen) stimulieren und sie an den Ort des angiogenen Stimulus rekrutieren (NEUFELD et al., 1999). Die Quantität und Aktivität der VEGF- Liganden hat Einfluss auf das Überleben der Angioblasten (RISAU, 1997).
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In vivo führen alle VEGF-Isoformen zu einer Erhöhung der Permeabilität für im Blut zirkulierende Makromoleküle (QUINN et al., 1993; DVORAK et al., 1995). Davon sind hauptsächlich postkapillare Venolen und kleine Venen betroffen. Dieser Prozess ist eng an die Angiogenese gekoppelt, die neu gebildeten Mikrogefäße sind hyperpermeabel (DVORAK et al., 1995). Zusätzlich ruft VEGF eine Vasodilatation hervor (NEUFELD et al, 1999).
VEGF scheint der maßgebliche Faktor zu sein, der die Osteogenese und Angiogenese verbindet (GERBER u. FERRARA, 2000). Die VEGF-Expression in den Osteoblasten wird durch eine Vielzahl an osteoinduktiven Wachstumsfaktoren und Cytokinen (z.B. transforming growth factor (TGF)-1, insulin like growth factor (IGF) 1) hochreguliert (GOAD et al., 1996; SAADEH et al., 1999) und fördert somit die Migration, das Überleben und die Aktivität von Osteoblasten (MIDY u. PLOUET, 1994; GERBER u. FERRARA, 2002; HSIONG u. MOONEY, 2006).
VEGF ist also neben weiteren Faktoren wie FGF (fibroblast growth factor) und TGF-
von entscheidender Bedeutung bei der Angiogenese während der Wund- und Frakturheilung (NISSEN et al., 1998; FURUMATSU et al., 2003; KARAYIANNAKIS et al., 2003; LI et al., 2003). Vor allem während der proliferativen Phase bei der Bildung des Granulationsgewebes konnten hohe VEGF-Konzentrationen in der Wundflüssigkeit und im Serum festgestellt werden (NISSEN et al., 1998;
KARAYIANNAKIS et al., 2003). Gibt man neutralisierende anti-VEGF-Antikörper zu einer heilenden Wunde hinzu, wird die Bildung des Granulationsgewebes gehemmt (HOWDIESHELL et al., 2001).
Bei Knochenbrüchen reguliert VEGF die Vaskularisation durch die Rekrutierung von Endothelzellen zu der Defektstelle (FURUMATSU et al., 2003). Die Inhibition von VEGF in einem Femurfraktur-Modell an der Maus resultierte in einer beeinträchtigten Knochenbildung, während die Zugabe von exogenem VEGF in einem critical-size- Defekt-Modell am Radius von Kaninchen die Knochenheilung förderte (STREET et al., 2002).
Die Expression von permeabilitätssteigernden Cytokinen wie VEGF ist während der Knochenheilung allerdings nicht nur im Knochen erhöht, sondern auch im umgebenden Weichgewebe (HANSEN-ALGENSTAEDT et al., 2003).
21 2.5 Knochentransplantate
Knochengewebe zeigt ein hohes regeneratives Potential und es erfolgt ein ständiger Umbau. Besonders die zell- und gefäßreiche Spongiosa, aber auch das Periost, eignet sich für die Transplantation. Die zell- und gefäßarme Kortikalis ist dahingegen weniger einsetzbar (REGENSBURGER, 2005). Ein gesundes Empfängerlager mit guter Vaskularisation ist für die erfolgreiche Heilung und Inkorporation von nicht vaskular gestielten, freien Knochentransplantaten eine notwendige Voraussetzung (HOPPER et al., 2001; REGENSBURGER, 2005).
Bei der Entnahme des freien, nicht gestielten Knochentransplantats wird das Gewebe vollständig von den versorgenden Gefäßen getrennt, so dass enthaltende Zellen vorübergehend nicht mehr versorgt werden. Dieses Transplantat kann nur erfolgreich einheilen, wenn eine Reperfusion aus der Umgebung erfolgt. Durch das Transplantat wird das Einwachsen von Weichgewebe in das Defektgebiet verhindert, es ermöglicht aber vitalen Osteoblasten von den Knochendefekträndern in das Transplantat einzuwandern. Das gestattet eine allmähliche und vollständige Resorption des transplantierten Knochens bei gleichzeitigem Ersatz mit neuem Knochen. Sobald es zu einer funktionellen Belastung kommt, beginnt ein Umbau, der zu einer Angleichung an das umgebende Knochengewebe führt (BURG et al., 2000;
HOWALDT u. SCHMELZEISEN, 2002).
Abhängig von ihrer Herkunft werden Knochentransplantate als auto-, allo- oder xenogen bezeichnet.
2.5.1 Autogene Knochentransplantate
Die autogenen Knochentransplantate gelten als Goldstandard für den Ersatz von Knochen in knöchernen Defekten (BIDIC et al., 2003; GEIGER et al., 2003). Ein und dasselbe Individuum ist dabei Spender und zugleich Empfänger (GEIGER et al., 2003).
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Für die Erzeugung und Erhaltung von neuem Knochengewebe bringen autogene Knochentransplantate günstige Eigenschaften mit: Das Transplantat dient als Gerüstmaterial, ist osteokonduktiv, liefert osteoinduktive Wachstumsfaktoren und enthält Progenitorzellen (LOGEART-AVRAMOGLOU et al., 2005). Die transplantierten Osteoblasten induzieren eine sofortige Knochenneubildung, die für die Frakturheilung und Auffüllung von Knochendefekten von großer klinischer Bedeutung ist (SCHUMPELICK et al., 2006). Jedoch führt nur der Einsatz in kleinen Defekten zu klinisch guten Ergebnissen (LOGEART-AVRAMOGLOU et al., 2005).
Die Wahl der Entnahmestelle des Transplantates ist abhängig von der Größe und Beschaffenheit des knöchernen Defektes (HOWALDT u. SCHMELZEISEN, 2002).
Die Spongiosa-Entnahme vom hinteren oder vorderen Beckenkamm beeinträchtigt nicht die Stabilität des Beckens und ist damit häufig Ort der Wahl (SCHUMPELICK et al., 2006). Die Entnahme von Schädelkalottenknochen hingegen kann zu Konturunebenheiten und Schwächung des Neurokraniums führen (KLINE u. WOLFE, 1995).
Die Erfolgsaussichten von autogenen Knochentransplantaten sind gut, da sie keine immunologischen Abstoßungsreaktionen auslösen (HOWALDT u. SCHMELZEISEN, 2002). Probleme ergeben sich jedoch durch die limitierte Verfügbarkeit des Spendergewebes aufgrund der Notwendigkeit, gesundes Gewebe durch die Entnahme schädigen zu müssen. Außerdem bedarf es der Durchführung eines zweiten operativen Eingriffes mit den damit verbundenen Beschwerden, welche unter dem Begriff der Entnahmemorbidität zusammen gefasst wird. Das Infektionsrisiko und die Narkosedauer steigen und es entstehen folglich höhere Kosten (URIST et al., 1967; KENLEY et al., 1993; LANGER, 2000; GEIGER et al., 2003; KNESER et al., 2006).
2.5.2 Allogene Knochentransplantate
Die allogene oder homologe Knochentransplantation erfolgt zwischen verschiedenen Individuen der selben Spezies. Die verwendete Spongiosa stammt dabei meist aus Hüftköpfen, die bei – 30°C bis – 40°C konserviert wurden. Durch allogene
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Transplantate werden die Osteoblasten des Empfängers zur Knochenneubildung stimuliert (SCHUMPELICK et al., 2006), die Osteogenität ist allerdings limitiert (KNESER et al., 2006). Die Transplantate werden außerdem nicht gut in den Körper inkorporiert (SALGADO, 2004), es findet eine exzessive Resorption statt (KENLEY et al., 1993). Hinsichtlich ihrer biomechanischen Stabilität und Elastizität bieten sie jedoch ähnliche Voraussetzungen wie autogene Knochentransplantate (KNESER et al., 2006). Außerdem besteht bei dieser Art der Transplantation das Risiko einer Übertragung von Infektionskrankheiten auf den Empfänger (LANGER, 2000;
SCHUMPELICK et al., 2006), beziehungsweise das Risiko einer Transplantatabstoßung aufgrund von Immuninkompatibilitäten zwischen dem Spender und Empfänger (LANGER, 2000). Durch immunologische Untersuchungen, Blutgruppen-Vergleiche oder begleitende immunsuppressive Medikationen, welche für den Patienten eine große Belastung darstellt, soll diese Gefahr jedoch minimiert werden (HOWALDT u. SCHMELZEISEN, 2002).
Ein entscheidender Vorteil dieser Transplantate ist jedoch die Verfügbarkeit und die Vermeidung der Entnahmemorbidität (SCHUMPELICK et al., 2006).
2.5.3 Xenogene Knochentransplantate
Erfolgt die Transplantation zwischen Individuen verschiedener Spezies, handelt es sich um eine xenogene Transplantation. Diese Transplantation erfolgt beispielsweise bei der Transplantation von Schweineherzklappen auf den Menschen (HOWALDT u.
SCHMELZEISEN. 2002). Xenogene Knochentransplantate werden nur selten eingesetzt (KENLEY et al., 1993), xenogene Knochenersatzmaterialien kommen jedoch häufig bei präprothetischen Knochenaugmentationen im dentoalveolären Bereich zur Anwendung. Es spielen jedoch Infektionen, Entzündungen und ethische Fragestellungen bei der Wahl dieses Transplantats eine Rolle (WAHL u.
SZERNUSZKA, 2006).
24 2.6 Knochenersatzmaterialien
Das ideale Knochenersatzmaterial sollte folgende Eigenschaften erfüllen: es sollte stabil, osteokonduktiv, osteoinduktiv, resorbierbar, kostengünstig und während der Operation einfach zu handhaben sein, während es gleichzeitig die Zelladhäsion, Proliferation und Zelldifferenzierung fördert (WAHL u. CZERNUZSZKA, 2006). Bis zur Regeneration des Gewebes können die Ersatzmaterialien eine mechanische Unterstützung bieten und gleichzeitig das Einwachsen von Gewebe in das Defektgebiet und die Knochenregeneration fördern (WAHL u. CZERNUSZKA, 2006).
An der Defektstelle werden die Implantate lokalem Stress und Beanspruchungen ausgesetzt. Daher müssen die gewünschten mechanischen Eigenschaften des Implantates (Dehnbarkeit, Scher-, Kompressionskräfte) bei der Auswahl des Knochenersatzmateriales berücksichtigt werden (WAHL u. CZERNUSZKA, 2006).
2.6.1 Synthetische (alloplastische) Knochenersatzmaterialien
Synthetische Knochenersatzmaterialien bieten eine alternative Form des Knochenersatzes. Die Materialien zeichnen sich durch eine unlimitierte Verfügbarkeit, einer Vielzahl an Formen und Größen, sowie einer einfachen Sterilisierbarkeit und Lagerung aus (BUCHHOLZ, 2002). Ihr Einsatz ist jedoch häufig mit hohen Kosten verbunden (URABE et al., 2007) und die Materialien können einen ungünstigen Effekt auf die normalen Umbauvorgänge des Knochens entwickeln (BUCHHOLZ, 2002).
Viele der synthetischen Materialien können vom Körper resorbiert werden (z.B.
Trikalziumphosphat) (HOWALDT u. SCHMELZEISEN, 2002), die Resorptionsraten sind jedoch nicht immer gleich (BUCHHOLZ, 2002). Demgegenüber gibt es Metalle und Keramiken, die sich bioinert verhalten und nicht vom Körper abgebaut werden (SALGADO et al., 2004). Damit bieten die Metalle nur mechanische Unterstützung, sie sind jedoch nicht in der Lage sich einer dynamischen Umgebung anzupassen (HSIONG u. MOONEY, 2006) und können aufgrund von Materialermüdung versagen (BUCHOLZ, 2002; WAHL u. CZERNUSZKA, 2006).
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Bei den synthetischen Knochenersatzmaterialien wird zwischen osteokonduktiven und osteoinduktiven Substanzen unterschieden (HOWALDT u. SCHMELZEISEN, 2002). Allerdings lassen sich die meisten Substanzen nur in die Klasse der osteokonduktiven Materialien einteilen (VACCARO, 2002).
2.6.1.1 Osteokonduktive Knochenersatzmaterialien
Knochenersatzmaterialien, die bereits über einen knochenähnlichen Aufbau verfügen, somit ein Gerüst anbieten, auf dem Knochenzellen proliferieren können und damit zu einer Osteointegration und einem Durchwachsen des Materials mit neuem Knochen führen, werden als osteokonduktive Substanzen bezeichnet (HOWALDT u. SCHMELZEISEN, 2002; LOGEART-AVRAMOGLOU et al., 2005). Zu dieser Substanzklasse gehören Hydroxylapatit, aber auch verschiedene Keramiken wie β-Trikalziumphosphat.
2.6.1.2 Osteoinduktive Knochenersatzmaterialien
Osteoinduktive Materialien führen zur Knochenneubildung an bisher knochenfreien Stellen (HOWALDT u. SCHMELZEISEN, 2002). Die Substanzen stimulieren undifferenzierte Zellen (z.B. mesenchymale Stammzellen) zur Proliferation und zu ihrer Differenzierung zu Osteoblasten (KENLEY et al., 2003; LOGEART- AVRAMOGLOU et al., 2005). Diese Stoffe kommen v.a. aus der Gruppe der bone morphogenetic proteines (BMPs). Als nachteilig sind eventuelle Fremdkörperreaktionen und hohe Materialkosten zu betrachten (HOWALDT u.
SCHMELZEISEN, 2002).
26 2.7 Tissue Engineering
Das Tissue Engineering ist ein relativ junges Forschungsfeld, das auf dem Wissen der Embryologie, der Gewebebildung und Geweberegeneration basiert und es sich zum Ziel gesetzt hat, neue funktionierende Gewebe zu generieren (KNESER et al., 2006).
Mechanische Stabilität, Osteokonduktivität, Osteoinduktivität, Osteogenität und die einfache Handhabung der Transplantate müssen gut ausbalanciert sein, um den klinischen Anforderungen zu entsprechen (KNESER et al., 2006). Dabei definiert der beabsichtigte klinische Gebrauch die erwünschten Eigenschaften des kreierten Knochenersatzes. So werden beispielsweise bei Defekten im Schädel- und Gesichtsbereich formbare Konstrukte mit einer konkreten dreidimensionalen Form favorisiert, großen mechanischen Belastungen müssen diese Transplantate nicht stand halten (KNESER et al., 2006; WAHL u. CZERNUSZKA, 2006). Der Einsatz von Computer-assistierten Design- und Herstellungstechniken erlaubt die Herstellung von maßgearbeiteten, passgenauen Scaffolds (YANG et al., 2001).
Genau wie das vitale Gewebe bestehen die beim Tissue Engineering gefertigten Konstrukte aus Zellen und einer Matrix, dem so genannten Scaffold (HUANG u.
INGBER, 1999). Das Scaffold dient als temporäres dreidimensionales Baugerüst und führt das Wachstum neuen Gewebes bei gleichzeitiger mechanischer Unterstützung (KIM et al., 2000).
Die Methode beinhaltet die Biopsie bei dem Patienten, oft unter lokaler Anästhesie.
Die gewebstypischen autogenen Zellen werden anschließend isoliert, in vitro vermehrt, kultiviert und mit einem dreidimensionalen abbaubaren Scaffold kombiniert. Anschließend wird das Konstrukt in den Defekt eingesetzt, um die Bildung von neuen Gewebe anzuregen. Durch die Verwendung autogener Zellen werden Abstoßungsreaktionen vermieden (YANG et al., 2001; EWERS et al., 2003).
Eine weitere Ansatzmöglichkeit ist das Einbringen von unbesiedelten Biomaterialien in das Defektgebiet, das dann durch Zellen aus dem umgebenden Gewebe besiedelt wird. Der Körper wird als natürlicher Bioreaktor genutzt (CHAPEKAR, 2000). Vorteil
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hierbei ist die reduzierte Anzahl an durchzuführenden Operationen, woraus eine kürzere Erholungszeit für den Patienten resultiert (REZWAN et al., 2006).
Die Qualität des Gewebes am Empfängerort beeinflusst die Vaskularisation des Scaffolds, das Einwachsen von Gefäßen, die Immigration von Zellen, die Infektionsrate und die eventuelle Knochenbildung (KNESER et al., 2006). Das Konstrukt sollte in ein Gewebe mit einem hohen Vaskularisationspotential implantiert werden (CASSELL et al., 2002), da die neuen Gefäße sich durch Aussprossung aus bereits bestehenden Blutgefäßen im umgebenden gesunden Wirtsgewebe bilden (CARMELIET, 2000; SMITH et al., 2004). Eine adäquate Vaskularisation ist die Grundvoraussetzung für die Bildung eines hoch qualitativen Knochens (KNESER et al., 2006) und bislang eine kritische Angelegenheit (LAVIK u. LANGER, 2004). Wird ein Konstrukt implantiert, so werden die Zellen auf diesem Konstrukt anfangs ausschließlich per Diffusion mit Nährstoffen und Sauerstoff versorgt. Die Diffusion von Sauerstoff erfolgt aber nur über eine maximale Strecke von 200 µm (FOLKMAN u. HOCHBERG, 1973; COLTON, 1995). Vor allem für das Überleben der Zellen im Zentrum eines großen Implantates ist daher die Induktion einer sofortigen und effizienten Vaskularisation erforderlich (EWERS et al., 2003; KNESER et al., 2006;
RÜCKER et al., 2006), da bei geringen Sauerstoffdrücken die Zellen entweder metabolisch inaktiv vorliegen oder sogar nekrotisieren (COLTON, 1995).
Gefördert wird die Vaskularisation des Gebietes durch die operative Implantation des Scaffolds, die eine entzündliche Wundheilung auslöst, und in Kombination mit einer lokalen Hypoxie die endogene Expression von angiogenen Wachstumsfaktoren stimuliert (CASSELL et al., 2002; KNESER et al., 2006).
2.7.1 Das Scaffold
Damit Zellen sich in vitro dreidimensional ausrichten können, benötigen sie ein dreidimensionales Stützgerüst, das Scaffold, das die Knochenstruktur nachahmt (LAURENCIN et al., 1999; SALGADO et al., 2004) und als temporäre Matrix für die Zellanlagerung, -migration, -proliferation, -differenzierung und für die Ablagerung
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extrazellulärer Matrix dient, bis sich das knöcherne Gewebe wieder vollständig regeneriert hat (LAURENCIN et al., 1999; HUTMACHER, 2000; YANG et al., 2001).
Bislang wurde eine Vielzahl von Materialien als Matrix beim Knochen-Tissue Engineering eingesetzt (YANG et al., 2002; SHIN et al., 2003). Neben den adäquaten Materialien selbst sind auch deren makro- und mikrostrukturelle, chemische und physikalische Eigenschaften von großer Bedeutung, da sie das Überleben der Zellen, die Signalgebung, das Wachstum, die Reorganisation und letztendlich die Knochenbildung beeinflussen (LEONG et al., 2003; LAVIK u.
LANGER, 2004; LOGEART-AVRAMOGLOU et al., 2005).
2.7.1.1 Anforderungen an das Scaffold
2.7.1.1.1 Biokompatibilität
Biokompatible Scaffolds integrieren sich gut in das umliegende Gewebe ohne dabei eine Immunantwort oder eine toxische Wirkungen auszulösen (HUTMACHER, 2000;
LEONG et al., 2003; LIU u. MA, 2004; LOGEART-AVRAMOGLOU et al., 2005).
Dadurch wird das Risiko eines Implantatversagens und das Durchführen weiterer Operationen reduziert (ROSE u. OREFFO, 2002).
Eine übermäßige Entzündung würde zur Bildung einer fibrotischen Kapsel um das Implantat führen, die den Gewebeumbau und das Gewebewachstum inhibieren kann und zudem als Barriere wirkt, so dass eine Angiogenese und der Transport von Nährstoffen behindert wird (CHAPEKAR, 2000).
2.7.1.1.2 Porosität
Hoch poröse Scaffolds mit offenen, interkonnektiven Poren fördern durch ihre große Oberfläche das Einwandern von Zellen und eine akkurate Zellverteilung, während sie gleichzeitig das Einsprossen von Kapillaren bis in das Zentrum des Konstruktes unterstützen und für eine akkurate Diffusion von Nährstoffen und Gasen und für den Abtransport von metabolischen Abbauprodukten sorgen (KIM et al., 2000; EWERS et
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al., 2003; LOGEART-AVRAMOGLOU et al., 2005; CAO et al., 2006). Abhängig von seiner Funktion und Lokalisation weist Knochen unterschiedliche Strukturen auf. So gibt es auch beim Tissue Engineering für jeden spezifischen Zelltyp eine optimale Porentopographie (BURG et al., 2000).
2.7.1.1.3 Porengröße
Das schnelle Einwachsen von Blutgefäßen ist für das Überleben der Zellen auf dem Scaffold entscheidend. Biomedizinische Materialien, die beim Tissue Engineering angewendet werden, sollten deshalb die schnelle Angiogenese unterstützen oder stimulieren (DRUECKE et al., 2004). Bei zu kleinen Poren im Scaffold können diese durch Zellen verschlossen werden. Damit wird die zelluläre Penetration, die Produktion von extrazellulärer Matrix und die Vaskularisation im Inneren des Scaffolds verhindert (SALGADO et al., 2004). Für das Tissue Engineering von Knochen sollte die Porengröße zwischen 200 bis 900 µm liegen (YANG et al., 2001;
LOGEART-AVRAMOGLOU et al., 2005). Eine Porengröße von 250 µm erwies sich als besonders fördernd für das Einwachsen von Kapillaren in das Scaffold (DRÜCKE et al., 2004; RÜCKER et al., 2006).
2.7.1.1.4 Oberflächeneigenschaften
Die chemische und topographische Oberflächenbeschaffenheit (Partikelgröße, Partikelform, Oberflächenrauheit) des Scaffoldmaterials kann die zelluläre Adhäsion und Proliferation kontrollieren und beeinflussen (BURG et al., 2000; SHEA et al., 2000; LANGE et al., 2002; LOGEART-AVRAMOGLOU et al., 2005).
Die chemischen Eigenschaften bestimmen die Fähigkeit der Zellen an dem Material zu adhärieren. Die topographischen Eigenschaften des Scaffolds wirken sich auf die Osteokonduktion und auf die Knochenneubildung aus (DAVIES, 1998). Durch ein Fibringerinnsel, das sich im Anschluss an die Materialimplantation bildet, können osteogene Zellen an die Oberfläche des Scaffolds migrieren. Hierfür ist eine gute Verankerung des Gerinnsels am Scaffold erforderlich, da sich das Gerinnsel sonst
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durch Wundkontraktionen vom Scaffold lösen würde. Eine raue Oberfläche begünstigt die Anheftung des Fibrins an dem Material (DAVIES, 1998;
ALBREKTSSON u. JOHANSSON, 2001).
2.7.1.1.5 Mechanische Eigenschaften
Knochen steht unter ständiger Stresseinwirkung. Daher sollten die mechanischen Eigenschaften des implantierten Konstruktes mit denen des lebenden Knochen übereinstimmen (CHAPEKAR, 2000; HUTMACHER, 2000; LEONG et al., 2003). Soll das Scaffold direkt nach der Implantation strukturelle und funktionelle Aufgaben übernehmen, empfiehlt sich die Verwendung langsam resorbierbarer, stabiler Materialien (EWERS et al., 2003). Die mechanische Unterstützung sollte so lange erhalten bleiben bis das neu entstandene Gewebe genug mechanische Integrität hat um sich selbst zu unterstützen (KIM et al., 2000).
2.7.1.1.6 Biodegradierbarkeit
Die Scaffoldmaterialien sollten biologisch abbaubar sein. Anfangs stellen sie das strukturelle Gerüst um die Rekonstruktion eines vollständig normalen Gewebes zu unterstützen, mit fortschreitender Degradation geben sie dann Raum frei für das Gewebewachstum und die Knochenablagerung. Gleichzeitig wird so das Risiko einer Entzündung oder Fremdkörperreaktion minimiert bzw. vermieden (KIM et al., 2000).
Die Degradations- und Resorptionskinetik des Biomaterials hat der Wachstumsrate des neuen Gewebes zu entsprechen (CHAPEKAR, 2000; HUTMACHER, 2000). Die Degradation sollte kontrolliert erfolgen (EWERS et al., 2003; LIU u. MA, 2004;
LOGEART-AVRAMOGLOU et al., 2005). Die entstehenden Degradationsprodukte sollten nicht toxisch und nicht inflammatorisch wirksam, außerdem leicht zu metabolisieren und auszuscheiden sein (KIM et al., 2000; LIU u. MA, 2004).
Allerdings haben nicht nur die verwendeten Materialien einen Einfluss auf die Degradationsrate, sondern auch der Implantationsort und dessen Durchblutung (EWERS et al., 2003).
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2.7.1.1.7 Eigenschaften für die Anwendbarkeit
Die Scaffolds sollten leicht in reproduzierbarer Weise in der erwünschten Form herzustellen sein und aus sterilisierbaren Materialien bestehen (GOLDSTEIN et al., 2001; LOGEART-AVRAMOGLOU et al., 2005). Zusätzlich ist eine einfache Handhabung während der Implantation ohne präparatorische Schritte anzustreben, damit das Risiko einer Infektion limitiert werden kann. Strahlendurchlässige Materialien erlauben zudem eine röntgenologische Unterscheidung zwischen dem neu gebildeten Knochen und dem Implantat (LOGEART-AVRAMOGLOU et al., 2005).
2.7.1.2 Einsetzbare Scaffoldmaterialien
Eine Vielzahl an natürlichen und synthetischen Materialien wurde bislang beim Tissue Engineering untersucht (LANGER, 2000; LAVIK u. LANGER, 2004), unter anderem Metalle, Keramiken (Hydroxyapatit, -Trikalzium-Phosphat) oder Polymere (LIU u. MA, 2004; REZWAN et al., 2006). Dabei gelten die biodegradierbaren Polymere als ideale Materialen für das Knochen-Tissue-Engineering (YANG et al., 2001).
Bei den Polymeren wird zwischen natürlichen und synthetischen Polymeren unterschieden. Synthetische biodegradierbare Polymere werden beim Tissue Engineering häufiger angewendet. Ihre chemische Vielseitigkeit und Verarbeitbarkeit variiert abhängig von ihrer Struktur (SALGADO et al., 2004).
2.7.1.2.1 Natürliche Polymere
Die natürlichen degradierbaren Polymere, wie beispielsweise Kollagen oder Fibrin, werden aus Pflanzen oder Tieren hergestellt (SALGADO et al., 2004; LASCHKE et al., 2008). Diese Substanzen kommen auch in der natürlichen extrazellulären Matrix vor und haben damit ein niedriges immunogenes Potential (KIM et al., 2000;
