Auswahl des Implantat- und Beschichtungsmaterials

PLGA (Polylactic-Co-Glycolic-Acid) gehört zu der Gruppe der biodegradierbaren, synthetischen Polymere. (WAHL u. CZERNUSZKA, 2006; KIM et al., 2000).

Synthetische Polymere zeichnen sich durch ihre kontrollierbaren und reproduzierbaren chemischen und physikalischen Eigenschaften aus (KIM et al., 2000; LIU u. MA, 2004) und sind deshalb für die Anwendung auf dem Gebiet des Tissue Engineerings sehr geeignet. Die Kopolymere der Laktide und Glykolide werden bereits in anderen medizinischen Feldern häufig erfolgreich angewandt, beispielsweise als Nahtmaterialien (YANG et al., 2001). Sie degradieren zu natürlichen Produkten (Laktat, Glycolsäure), die vom Körper metabolisiert werden können (KIM et al., 2000; CHEN u. MOONEY, 2003; LAVIK u. LANGER, 2004).

Die Auswahl des PLGA als Scaffoldmaterial basierte auf den Erkenntnissen, nach denen diese Scaffolds eine mit isogenem Knochen vergleichbare Biokompatibilität besitzen (RÜCKER et al., 2006).

Die für die vorliegende Arbeit verwendeten Scaffolds wurden mit Hilfe der Rapid Prototyping-Technik hergestellt, da mit dieser Methode eine definierte und homogene Porengröße garantiert werden kann (CARVALHO et al., 2005). Die Porengröße ist bei der Vaskularisation der Konstrukte von entscheidender Bedeutung. Zu kleine Poren behindern das Eindringen von Zellen in das Scaffold und der Austausch von Nährstoffen und Metaboliten zwischen der Matrix und der Umgebung kann nicht stattfinden (SALGADO et al., 2004). Zu große Poren führen zu einer mangelnden Adhärenz der Gewebezellen auf den Trägermaterialien und die Ausbildung der gewünschten Gewebeform wird beeinträchtigt (REN et al., 2005). Verschiedene Studien konnten zeigen, dass eine Porengröße von 250 µm für das schnelle Einwachsen von Gefäßen ideal ist (DRUECKE et al., 2004; RÜCKER et al., 2006:

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LASCHKE et al., 2008). Auch für diese Arbeit wurde deshalb eine Porengröße von 250 µm gewählt.

Bei der verwendeten Beschichtung handelte es sich um Kollagen, einem natürlichen Polymer, das aufgrund seiner biokompatiblen und osteokonduktiven Eigenschaften beim Tissue Engineering immer mehr Anwendung findet (LEE et al., 2001; WAHL u.

CZERNUSZKA, 2006). Es wurde eine Beschichtung mit Kollagen-Typ-I gewählt, da dieser Typ natürlicherweise im Knochen vorkommt (WAHL u. CZERNUSZKA, 2006) und 90 % der organischen Knochengrundsubstanz ausmacht (SOMMERFELDT u.

RUBIN, 2001). Zellen haften gut an einer kollagenen Oberfläche (WAHL u.

CZERNUSZKA, 2006), eine Eigenschaft, die das Kollagen besonders wertvoll für den Einsatz als Lieferant von Wachstumsfaktoren macht (CHEN u. MOONEY, 2003).

Um die Rolle der Dura mater bei der Neovaskularisation und Knochenbildung genauer zu untersuchen, isolierten verschiedene Arbeitsgruppen bei Defekten kritischer Größe von Ratten und Kaninchen die osteogenen Gewebe des Schädels mit Hilfe von Membranen aus Silikon und Polytetrafluoroethylen. Sie konnten anhand von histologischen und radiologischen Untersuchungen zeigen, dass der Dura mater dabei eine entscheidende Rolle zukommt (HOPPER et al., 2001; ÖZERDEM et al., 2003). Bei dieser Arbeit wurde für die Isolierung der Dura mater von den knöchernen Strukturen eine nicht poröse Polyethylen-Membran ausgewählt, die biokompatible Eigenschaften besitzt (LIN et al., 2007).

Die Verwendung von Wachstumsfaktoren ist ein therapeutisch wichtiger Aspekt beim Tissue Engineering, um die Vaskularisation der Konstrukte zu steigern (CHEN u.

MOONEY, 2003).

Der Wachstumsfaktor VEGF (vascular endothelial growth factor) wirkt hauptsächlich auf Endothelzellen (YAMAGUCHI et al., 1993; MILLAUER, 1994; RISAU, 1997;

RIBATTI, 2004). Das murine VEGF 164 entsteht neben weiteren Isoformen durch Splicing aus einem einzigen VEGF-Gen und ist mit dem VEGF 165 des Menschen vergleichbar (SHIMA et al., 1996).

Die Beschichtung der Scaffolds erfolgte in der vorliegenden Arbeit mit einer sogenannten „kalten Beschichtungstechnik“, weil Wärme die biologischen

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Eigenschaften eines Wachstumsfaktors verändern kann (SCHMIDMAIER et al., 2001).

Mehrere Arbeitsgruppen beschäftigten sich bereits mit der Integration von VEGF in Biomaterialien. Sie konnten an verschiedenen Modellen an Mäusen und Ratten demonstrieren, dass die allmähliche lokale Freisetzung des Wachstumsfaktors aus dem Scaffold das Einwachsen von neuen Gefäßen beschleunigte und zur Bildung eines Gefäßnetzes mit einer erhöhten Kapillardichte führte (RICHARDSON et al., 2001; STREET et al., 2002; MURPHY et al., 2003; SMITH et al., 2004; KLEINHEINZ et al., 2005; SUN et al., 2005; LASCHKE et al., 2008). Die Bolusinjektion von VEGF in ein Scaffold zum Zeitpunkt der Implantation konnte jedoch keine signifikante Änderung der Vaskularisation induzieren (RICHARDSON et al., 2001), was mit der kurzen Halbwertszeit des Wachstumsfaktors zu begründen ist (SMITH et al., 2004).

Eine lokalisierte und kontrollierte Freisetzung des VEGFs minimiert zugleich toxische Nebeneffekte (hyperpermeable Gefäße, abnorme vaskulare Funktion, Hypotension) und unerwünschte Gefäßbildung an anderen Körperstellen (OZAWA et al., 2004;

SMITH et al., 2004). Außerdem erlaubt es die Reduktion der eingesetzten Menge des Wachstumsfaktors, ohne dabei einen Wirkungsverlust zu induzieren. Die VEGF-Wirkung basiert nicht auf der insgesamt vorhandenen, sondern lediglich auf der freigesetzten VEGF-Menge in der Mikroumgebung (OZAWA et al., 2004; SMITH et al., 2004). Folglich ist die Kinetik der Freisetzung des VEGFs von dem Scaffold für eine erfolgreiche Angiogenese entscheidend. Aus diesem Grund wurde ein in vitro Assay angesetzt, der die allmähliche und gleichmäßige Freisetzung des VEGFs von den verwendeten PLGA-Scaffolds bestätigte. Die Angiogenese beginnt während der Wundheilung innerhalb der ersten 48 Stunden (FOLKMAN u. SHING, 1992; RISAU, 1997), weshalb die Freisetzung des Wachstumsfaktors über mindestens 48 Stunden anhalten muss. Dieses wurde mit der vorgenommenen Art der Beschichtung erfolgreich erreicht. Die Beladung des Scaffolds erfolgte mit 10 ng, in 200 µl PBS-Überstand konnte über den gesamten zeitlichen Verlauf von 22 Tagen eine VEGF-Konzentration von bis zu 2,5 ng gemessen werden.

Im Allgemeinen erfolgt die Integration von Wachstumsfaktoren in die Konstrukte durch das Versetzen der Polymerpartikel mit dem Faktor noch vor der Herstellung

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der Scaffolds oder durch die Integration der Faktoren in Mikrosphären (RICHARDSON et al., 2001; SCHMIDMAIER et al., 2001; CHEN u. MOONEY, 2003).

Diese Methoden sind jedoch recht aufwendig. Bei dieser Arbeit wurde eine neue unkomplizierte Methode angewandt, bei der zuerst das Scaffold mit Kollagen beschichtet wurde, um dem Wachstumsfaktor einen besseren Halt zu bieten, und anschließend mit VEGF beladen wurde. Der in-vitro-Assay belegt, dass eine gleichmäßige VEGF-Freisetzung auch mit dieser Integrationsmethode erreicht wird.

VEGF ist ein natürlich vorkommender Wachstumsfaktor und aus diesem Grunde bei allen Gruppen bei der Wundheilung beteiligt. Die Wirkung von dem exogenen VEGF auf die Angiogenese und die physiologischen Eigenschaften der Blutgefäße lässt sich demnach durch das Herausstellen der Unterschiede zwischen den Kontrollgruppen und der behandelten Gruppe erreichen.