4.2. Diskussion der Methoden
4.2.4. Die Fluoreszenzmikroskopie
Die Intravitalmikroskopie ist die am besten geeignete Methode um direkt die Architektur und Funktion des Mikrogefäßsystems in vivo zu untersuchen (MENGER u. LEHR, 1993). Sie ermöglicht eine direkte, nicht invasive, wiederholbare Untersuchung von Geweben in vivo mit einer quantitativen Analyse der Mikrozirkulation und deren Veränderungen (STEINBAUER et al., 2000).
Es ist jedoch zu berücksichtigen, dass die experimentelle Beantwortung der meisten Fragestellungen eine Manipulation des zu untersuchenden Systems erfordert. Durch den invasiven operativen Eingriff wird ein Trauma gesetzt, das lokale, aber auch systemische, inflammatorische Auswirkungen haben kann. Trocknet das Operationsgebiet auch nur kurz an, können bereits mikrovaskulare Dysfunktionen ausgelöst werden. Die angewandten Anästhetika können die respiratorischen, makro- und mikrohämodynamischen Gegebenheiten verändern und zusätzlich zur Freisetzung oder Aktivierung inflammatorischer Zellen und Mediatoren führen (MEMPEL et al., 2004; HALIN et al., 2005). Zudem kann die Anwendung von Fluoreszenzfarbstoffen zu phototoxischen Effekten führen, die das zu untersuchende System beeinflussen (STEINBAUER et al., 2000; MEMPEL et al., 2004; HALIN et al.,
113
2005). Dies kann sich unter anderem in einer erhöhten makromolekularen Leakage oder in einer erhöhten Leukozyten-Enodthelzell-Interaktion äußern (REED u.
MILLER, 1988; SAETZLER et al., 1997; MEMPEL et al., 2004;). Der Grad der phototoxischen Schädigung ist abhängig von dem Fluorophor, dessen Konzentration, der Intensität und der Wellenlänge des Exzitationslichtes, sowie von der Dauer der Lichtexposition (SAETZLER et al., 1997; STEINBAUER et al., 2000). Auf eine wiederholte Applikation der Fluoreszenzfarbstoffe konnte in der vorliegenden Arbeit nicht verzichtet werden, da die Farbstoffe im Laufe der Zeit in unterschiedlichen Maße von ihrer Färbung verlieren (BAATZ et al., 1995). Um dennoch die phototoxischen Interferenzen auszuschließen, beziehungsweise nur gering ausfallen zu lassen, wurde mit einer minimalen Farbstoffdosierung gearbeitet und ein lichtempfindliches Kamerasystem eingesetzt, das eine Reduktion der Lichtstärke erlaubte. Des weiteren wurde darauf geachtet, die Untersuchungszeiträume so kurz wie möglich zu halten, um die Dauer der Lichtexposition zu reduzieren (LEHR et al., 1993; SAETZLER et al., 1997; STEINBAUER et al., 2000; MEMPEL et al., 2004).
Dieses wurde unter anderem dadurch erreicht, dass das Mikroskopieren aufgezeichnet wurde und somit die Auswertung zu einem späteren Zeitpunkt erfolgen konnte. Gleichzeitig konnte so die Narkosedauer der Versuchstiere während der intravitalen Fluoreszenzmikroskopie auf ein Minimum reduziert werden.
Bei Untersuchungen an der Rückenhautkammer der Maus wurde unter vergleichbaren Bedingungen mikroskopiert. Es wurde bewiesen, dass FITC-Dextran die Kapillarperfusion und die Leukozyten-Endothel-Interaktion nicht beeinflusst.
Jedoch stellte sich im Verlauf der Untersuchungen heraus, dass durch die wiederholte Applikation und Absorption des FITC-Dextran-Farbstoffes die Kontrastqualität in dem Kammergewebe negativ beeinflusst wurde (LEHR et al., 1993).
Eine mögliche Fehlerquelle bei der Anwendung der IVM ist die manuelle Analyse der Daten (HALIN et al., 2005). Aus diesem Grunde wurde die Auswertung nur von einer Person computergestützt durchgeführt.
114
Zusammenfassend kann anhand der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit festgestellt werden, dass das neu entwickelte und angewendete Schädelkammermodell ein verlässliches chronisches Modell für die direkte in vivo-Quantifizierung der Angiogenese desmalen Knochens über drei Wochen darstellt.
Die Untersuchungen ergaben, dass sich PLGA generell als Biomaterial für den Einsatz als Gerüstsubstanz im Bereich des Knochen-Tissue-Engineering eignet.
Durch die Porengröße von 250 µm, die Beschichtung mit Kollagen und vor allem durch die zusätzliche Ankopplung des Wachstumsfaktors VEGF ließ sich die Vaskularisation der Konstrukte steigern. Es konnte auch gezeigt werden, dass bei der Heilung von Defekten der Schädeldecke neben den peripheren knöchernen Strukturen, die Dura eine wesentliche Rolle spielt.
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Meike Gudrun Winkler (2008): Einfluss des Wachstumsfaktors VEGF auf die initiale Kapillarisierung beim Einbringen von PLGA-Scaffolds in Defekte kritischer Größe der Schädelkalotte der Maus – intravitale fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen in einem neuartigen Schädelkammermodell.
5 ZUSAMMENFASSUNG
Um die Eignung von Knochenersatzmaterialien besser beurteilen zu können, muss deren initiale Integration und Vaskularisation in eine knöcherne Umgebung untersucht werden. Dazu ist ein passendes Modell erforderlich. In der vorliegenden Arbeit wurde ein neuartiges Schädeldefektmodell an der Maus entwickelt und etabliert, das die Untersuchung der entzündlichen und angiogenen Gewebereaktion auf implantierte Biomaterialien in vivo über einen Zeitraum von drei Wochen erlaubt.
Die Anwendung der intravitalen Fluoreszenzmikroskopie ermöglichte die wiederholte Untersuchung und Quantifizierung mikrozirkulatorischer Parameter (Durchmesser, Erythrozytenfließgeschwindigkeit, Volumenfluss, Scherrate), der stattfindenden Entzündungsreaktion (Leukozyten-Endothelzell-Interaktion, mikrovaskulare Gefäß-permeabilität), der Anigogenese und der funktionellen Kapillardichte an den Tagen 0 (Tag der Operation), 3, 6, 10, 14, 18 und 22.
Für die Untersuchungen wurde ein 3 x 3 mm großer Knochendefekt in die Schädelkalotte von insgesamt 55 adulten (8 Wochen alt), männlichen balb/c-Mäusen gesetzt, ohne dabei die darunter liegende Dura mater zu verletzen. Anschließend wurde eine neu entwickelte, ringförmige Kammer aus Polyetherimid mit Hilfe von Titan-Schrauben an der Schädelkalotte befestigt und die umgebende Haut mit der Kammer vernäht. Ein abnehmbarer Sprengring und ein rundes Deckglas ermöglichten einen wiederholten Zugriff auf das Defektgebiet und sorgten gleichzeitig für einen Abschluss der Kammer bzw. verhinderten eine Austrocknung.
Neben einer Kontrollgruppe mit Defekten ohne ein Scaffold (Gruppe 1, 8 Tiere), erfolgten Untersuchungen an Defekten mit einer zwischen der Dura mater und der Schädeldecke eingebrachten nicht porösen Polyethylen-Membran (Gruppe 2, 8
116
Tiere). Die Defekte weiterer Gruppen wurden mit einem unbeschichteten (Gruppe 3, 8 Tiere) bzw. mit einem Kollagen-beschichteten PLGA-Scaffold (Gruppe 5, 8 Tiere) versorgt. Zusätzlich zu der Membran wurden bei einer Versuchsgruppe außerdem unbeschichtete PLGA-Scaffolds (Gruppe 4, 8 Tiere), bei einer anderen Gruppe Kollagen-beschichtete PLGA-Konstrukte (Gruppe 6, 7 Tiere) implantiert. Eine Gruppe mit 8 Mäusen bekam ein mit dem Wachstumsfaktor VEGF (10 ng) überzogenes PLGA-Kollagen-Implantat in den Knochendefekt eingesetzt (Gruppe 7).
Bei der Kontrollgruppe (Gruppe 1) zeigte sich eine geringgradige temporäre Entzündungsreaktion mit einer leicht erhöhten Gefäßpermeabilität. Die Angiogenese erfolgte recht langsam beginnend an Tag 3.
Unbeschichtete PLGA-Scaffolds (Gruppe 3) führten zu verstärkten Reaktionen, vor allem hinsichtlich der Angiogenese. Ab Tag 6 zeigten sich bezüglich der funktionellen Kapillardichte bereits signifikante Unterschiede gegenüber der Kontrollgruppe bzw.
der Membran-Gruppe. Die zusätzliche Beschichtung des Scaffolds mit Kollagen (Gruppe 5) beeinflusste diese Parameter verglichen mit den unbeschichteten Scaffolds nicht signifikant.
Die Polyethylen-Membran der Gruppe 2 diente der Isolation der knöchernen Defektränder von der darunter liegenden Dura mater. So konnte der Einfluss beider Strukturen bei den Heilungsvorgängen untersucht werden. Ähnlich wie nach der Implantation eines PLGA-Scaffolds rief die Implantation der Membran nur eine geringe, temporäre Entzündungsreaktion hervor. Die Angiogenese im peripheren Defektbereich begann, wie auch bei der Kontrollgruppe, bereits nach drei Tagen.
Zentral konnte nach zwei Wochen eine nennenswerte funktionelle Kapillardichte verzeichnet werden, weil erst die Gefäße aus der Peripherie in das Defektzentrum vordringen mussten.
Die zusätzlich zu der Membran erfolgte Implantation eines unbeschichteten (Gruppe 4) oder Kollagen-beschichteten PLGA-Konstruktes (Gruppe 6) rief eine erhöhte Leukozytenrekrutierung und Gefäßpermeabilität hervor, die mit den entsprechenden Reaktionen nach Implantation eines (un)beschichteten PLGA-Scaffolds ohne Membran (Gruppe 3) vergleichbar waren. Die periphere und auch die zentrale
117
Angiogenese war im Vergleich zu den Membran-Gruppen durch die Implantation der beschichteten und unbeschichteten Biomaterialien gesteigert.
Bei der Implantation eines mit dem Wachstumsfaktor VEGF (10 ng) beschichteten PLGA-Scaffolds (Gruppe 7) zeigte sich bereits an Tag 3 neben einer vermehrten inflammatorischen auch eine schnellere angiogene Reaktion auf die Scaffolds mit signifikanten Unterschieden zu der Kontrollgruppe.
Während dieser Arbeit konnte bestätigt werden, dass sich PLGA als Biomaterial für den Knochenersatz im Bereich des Tissue Engineerings eignet. Eine Beschichtung mit Kollagen beeinträchtigte diese gute Biokompatibilität nicht.
Mit Hilfe der eingesetzten Membran konnte demonstriert werden, dass die Dura mater bei der Vaskularisation von Knochenersatzkonstrukten im Bereich der Schädeldecke und somit auch bei der Knochenheilung entscheidend mitwirkt.
Die vorgestellten Daten belegen, dass die allmähliche, lokale Freisetzung des exogen eingesetzten Wachstumsfaktors VEGF die Vaskularisation des PLGA-Konstruktes bereits innerhalb der ersten drei Tage nach Implantation beschleunigen konnte.
Die neu gewonnenen Erkenntnisse erlauben die Entwicklung neuer Strategien im Bereich des Tissue Engineerings, um eine effektive Versorgung auch größerer Knochendefekte zu erreichen.
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Meike Gudrun Winkler (2008): The influence of the growth factor VEGF on the initial vascularization after the implantation of PLGA-scaffolds into the calvarial critical size defect of mice – intravital fluorescence microscopic observation in a newly developed calvaria bone chamber.
6 SUMMARY
For the characterization of the biomaterials it is necessary to study their initial integration and vascularization into a bony environment. In this study a new calvarial defect model in mice was developed and established. It allows the examination of inflammatory and angiogenous reactions of the host-tissue in vivo for about three weeks. The intravital fluorescence microscopy enables repeated measurements and quantification of microcirculatory parameters, the inflammatory reaction (leukocyte-endothelial-interaction, microvascular leakage), the angiogenesis and the functional capillary density.
A bony defect of 3 x 3 mm was created in the parietal calvaria of adult balb/c-mice without injuring the underlaying dura mater. In the following a new developed, circular chamber made of polyetherimid was attached to the calvaria with titanium-screws and the surrounding skin was sewed to the chamber. A removable circlip fixation and a round cover glass enable repeated access to the defect area and prevented the preparation from drying.
Besides a control group with unequipped defects (group 1, 8 animals), further tests were made with a group in which the defect was filled with porous poly(L-lactide-co-glycolide) (PLGA)-blocks (group 3, 8 animals) or porous PLGA-scaffolds coated with collagen (group 5, 8 animals). The control group showed a slight temporary inflammatory reaction with a small increase of the macromolecular vascular permeability. Angiogenic reactions occurred slowly. Both reactions can be explained with the surgical procedure. The implantation of PLGA caused an increase in the inflammatory and especially the angiogenic reaction. The formation of a densely vascular network was observed. Coating with collagen did not influence the formation of new blood vessels.
119
By placing a thin, non porous polyethylene membrane in between the dura mater and the calvaria (group 2, 8 animals) the influence of the dura mater on the bone healing could be proved. The inflammatory response was similar to the response after scaffold implantation, the angiogenesis in the peripheral defect area was comparable with the results found in the control group. In the central area of the defect a noteworthy functional capillary density could be observed after two weeks, since the blood vessels had to penetrate from the osseous margings to the central area.
In addition to the membrane an uncoated PLGA-Scaffold (group 4, 8 animals) or respectively a collagen-coated scaffold (group 7, 7 animals) was implanted. The leucocyte recruitment and vascular leakage were comparable with those induced by implantation of a scaffold. The implantation of the biomaterials resulted in an increased peripheral and central angiogenesis compared with the membrane-group.
A collagen-coated PLGA-implant that was covered with the growth factor VEGF (vascular endothelial growth factor) (10 ng) (group 8, 8 animals) was inserted into the defect in another group. Besides a stronger inflammatory reaction an accelerated angiogenic process could be observed.
This study showed that the biomaterial PLGA is a potential matrix for scaffolds used in tissue engineering constructs. A coating with collagen induced just a slight increase in biocompatibility.
Using the membrane it could be demonstrated that the dura mater plays a prominent role in bone healing.
The gradually local release of the exogenously added growth factor VEGF resulted in an accelerated angiogenic response in the first three days after scaffold implantation.
The presented results encourage to develop new strategies in tissue engineering to heal even larger bone defects.
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